Summary
Langendorff-mode isolerade hjärta genomblödning, i samband med
Abstract
Genmanipulerad musmodeller har blivit kraftfullt forskningsverktyg för att fastställa orsakssambanden mellan molekylära förändringar och modeller av hjärt-kärlsjukdom. Även molekylärbiologi är nödvändigt att fastställa de centrala förändringarna i signalväg, är det inte ett surrogat för funktionell betydelse. Medan fysiologi kan ge svar på frågan om funktionen, som kombinerar fysiologi med biokemiska utvärdering av metaboliter i den intakta, bultande hjärta ger en komplett bild av hjärtfunktion och energin. Under flera år har vårt laboratorium använde isolerade hjärta perfusion i kombination med kärnmagnetisk resonans (NMR) för att utföra denna uppgift. Vänsterkammarfunktion bedöms av Langendorff-mode isolerade hjärta perfusion medan hjärt energin mäts genom att utföra
Protocol
- För dessa experiment är två separata system utnyttjas samtidigt. För förvärv av 31 P-spektra, är en Bruker 14T magnet gränssnitt med Avance III konsolen och en dator utrustad med Topspin V2.1 mjukvara. För bedömning av hjärtfunktionen, är en specialbyggd hjärta perfusion systemet gränssnitt med PowerLab 4 / 30 datainsamling, utrustad med LabChartPro 6 programvara för dataanalys.
- På dagen av försöket, är 1 liter Krebs-Henseleit buffert beredas enligt följande: 0,5 mm EDTA, 5.3mM KCl, 1,2 mm MgSO 4, 118mm NaCl och 25mm NaHCO 3. Blandningen sedan bubblade med 5% CO 2 / 95% O 2 i 10-15 minuter innan tillsats av 2mm CaCl 2. Slutligen, substrat, i form av 10 mM glukos och 0,5 mm pyruvat, läggs till.
- Temperaturreglering under försöket är kritisk. Uppvärmd cirkulationspumpar används för att hålla temperaturen mellan 37,0 till 37,5 ° C medan hjärta är inne i magneten. Temperaturen övervakas under hela experimentet med hjälp av en fiberoptisk temperaturgivare.
- Perfusion tryck och vänster kammares trycket övervakas via tryckgivare ansluten till ett datainsamlingssystem och visas med hjälp av den medföljande programvaran. Dessa är kalibrerade med en standard blodtrycksmätare före experimentet. Dessutom är trycket linjer spolas tillräckligt för att få bort alla luftbubblor.
- En standard prov på 150 mm natriumfosfat (vilket motsvarar jonstyrka av KH buffert) används för att "kalibrera" sonden före införandet av hjärtat. Detta underlättar signalen och minskar den tid som behövs för att börja förvärvet perioden när hjärtat är placerat inom sonden.
- För att minska koagulation, är den mus injiceras med 200 enheter heparin IP Efter 5 minuter, natrium pentobarbital (175 mg / kg) IP ges.
- Hjärtat är snabbt censurerade (med lungorna och tymus intakt) och som greps iskallt KH buffert.
- Samtidigt hålls på is, är lungorna snabbt bort. Den lober bräss identifieras och bänd försiktigt tillbaka för att exponera stora kroppspulsådern. Bräss tas bort. Aorta är sedan isoleras genom att försiktigt ta bort alla omgivande vävnad.
- Micro suturering pincett används för att försiktigt hålla både väggar aorta att exponera lumen. Aorta är noggrant placeras på kanylen gjorda av 0,965 mm OD polyeten slang (PE50). Aortan hålls på plats med en mikro fartyg klämma medan suturer snabbt knutna runt aorta. Klippet tas bort och pincett används för att noggrant kontrollera att kanylen är över aortaroten. Ytterligare band tillkommer som behövs för att hålla hjärtat på plats.
- Någon extra vävnad tas bort med pincett och microscissors. Ett litet snitt görs i den vänstra förmaket. En 0,61 mm OD polyeten slang (PE10) är försiktigt in genom vänster förmak, LV hålrum, och ut genom spetsen samtidigt som du försiktigt håller hjärtat. Överskottet slangen är trimmade.
- En tömd vattenfylld ballong förs in genom atrium i LV och hålls på plats med hjälp av tejp eller suturer. Den peristaltiska pumpen hastigheten gradvis ökas för att ge tillräckligt flöde till hjärtat. Tills hjärtat är platsen i NMR-sond, kommer hjärtat fortsätta att vara perfusion med konstant flöde motsvarar ca 2 ml / min. LV ballongen är uppblåst med en liten volym med hjälp av en mikrometer spruta för att kontrollera att LV tryckgivare fungerar.
- Hjärtat är försiktigt in i en 10 mm NMR rör. Ett stort hål "spinner" används för att vägleda röret i rätt läge i sonden. Hela apparaten är sedan ordentligt ansluten till "navelsträngen" med tejp.
- Navelsträngen sakta sänks ner i övre hålet i magneten tills hjärtat / NMR röret är inne i spolen på 10 mm NMR-sond.
- När hjärtat är i rätt position inom sonden är Slangpumpar flödet justeras för att uppnå en genomblödning tryck 80mmHg. (Kom ihåg, att upp till denna punkt hjärta perfusion med ett konstant flöde av cirka 2 ml / min). Den perfusionstryck bibehålls sedan genom att "hold"-mekanism på pumpstyrningen. Hjärtat får sedan en 15-20 period minut jämvikt. Under den tiden är volymen av LV ballong justeras för att uppnå ett slutet diastoliskt tryck på 8-10 mmHg.
- Under jämvikt period är det nödvändigt att optimera spektrometern parametrar för att uppnå bästa möjliga fosfor signal. Detta uppnås genom att ställa radion puls för den frekvens där fosfor kärnan resonans ("tuning") och göra det magnetiska fältet homogen ("mellanlägg").
- Efter jämvikt period kan flera 31 P NMR-spektra erhållas. Förvärvet period för varje spektrum är beroende på tHan fältstyrka magneten, storleken på urvalet, och signal-brus-förhållande som krävs för ett visst experiment. Spectra erhålls med hjälp av en 14 Telsa magnet som genomsnittet av den signal som erhålls från 256 pulser radiofrekvens av 20 ìs med en 60 graders flip vinkel och förseningar på 2,0 sekunder. Detta experiment kräver ca 10 min.
Representativa resultat
Från datainsamling hårdvara och LabChart programvaran kan flera parametrar av hjärtfunktionen mätas i hela försöksprotokoll. Den typiska mått på hjärtfunktion är vänster kammare utvecklat tryck (LVDevP), som erhålls genom att subtrahera slutet diastoliska trycket (EDP) från det systoliska trycket (Figur 1). Denna åtgärd kan variera beroende på belastningen av musen och hjärtats tillstånd (dvs övertryck). Men i en normal C57BL6 mus hjärta LVDevP är vanligtvis mellan 100-110 mmHg i fast slutet diastoliskt tryck på 8-10 mmHg. Dessutom tillåter LabChart program för mätning av hjärtfrekvensen baserat på cykliska mätningar av LV tryckvågor. Återigen kan denna åtgärd varierar men typiska värden är 350-400 bpm när hjärtan är tillåtet att slå på inneboende priser. Däremot kan hjärtat vara standardiserat med hjälp av en pacing system där pulsen hålls på 420 bpm. Dessutom kan åtgärder för kontraktilitet (+ dP / dt) och avslappning (-dP/dt) beräknas med den första derivatan av LV tryckvåg. Under den experimentella protokollet är det lätt att bedöma Starling mekanismen genom att införliva ett tryck-volym förhållande. Detta uppnås genom att gradvis höjning av LV ballong volymen och notera LVDevP samt EDP. Dessa värden kan sedan ritas som visas i Figur 2. Medan Starling kurvan är optimal, notera den volym som krävs för att uppnå en EDP på 8-10 mm Hg kan ge en indirekt bild av LV kammare dimension. Detta kan användas i modeller av aorta band som hypertrophied hjärtan vanligtvis kommer att kräva en mindre ballong volymen medan dilaterade hjärtan kräver en större volym jämfört med kontroller. Tabell 1 visar representativa hjärtfunktion data som förvärvats under perfusion protokollet.
Den 31 P NMR-spektrometer kommer att ge signaler om phosphocreatine (PCR) och de tre fosfater från ATP (γ-ATP, α-ATP, och β-ATP) samt oorganiskt fosfat (Pi) som visas i Figur 2. Analys av varje av dessa toppar ger ett värde för ytan under kurvan. Mängden ATP beräknas som genomsnittet av de γ-ATP-och β-ATP områden. (Den α-ATP används inte för att NAD molekyler bidra till en okänd del av den totala signal). Den energiska status hjärtat bestäms av kvoten av PCR och ATP-områden (PCR: ATP ratio). Detta värde är vanligen 1,5 till 1,7 i en mus hjärta levereras med glukos som primär substrat. Även 31 P NMR inte ger direkta åtgärder av ATP eller PCR, är området av topparna proportion till mängden av fosfor som innehåller föreningar i provet. Värden för dessa signaler kan uppskattas genom att använda andra metoder. Till exempel kan direkta åtgärder av ATP med högpresterande vätskekromatografi (HPLC) i en kohort av hjärtan ger en genomsnittlig koncentration. Detta värde kan sedan användas för att kalibrera den genomsnittliga ATP-områden observeras i spektra. PCR koncentration kan beräknas baserat på PCR-området i förhållande till den ATP-området. Det är också möjligt att uppskatta pH-värdet genom att analysera den relativa kemiska förskjutning av oorganiskt fosfat (Pi) signal till PCR-signalen. Kan 1 Använda olika sekvenser radio puls, kreatinkinas reaktion hastighet eller ATP-syntesen reaktionen hastighet också mätas. 2
Tabell 1. Baseline hjärtfunktion från isolerade perfusion hjärtan. LVDevP: vänster kammare utvecklat tryck, LVEDP: vänsterkammarfunktion slutet av diastoliskt tryck, HR: hjärtfrekvens, RPP: Betygsätt tryck produkt, + dP / dt: första derivat LV trycket positiv, -dP/dt: första derivat LV trycket negativt, PP : perfusion tryck, CF: koronara flödet.
Figur 1. Representant LV tryckvågor från LabChart Pro.
Figur 2. Representant Starling kurvor från kontroll (heldragen linje) och aorta bandad (streckade) möss. A) Systoliskt funktion som representeras av LVDevP över allt LV volymer som bestäms av volym LV ballongen. B) Diastoliskt funktion som representeras av EDP över allt LV volymer som bestäms av volym LV ballongen. LVDevP: vänster kammare utvecklade trycket (systoliskt minus diastoliskt pArbetstryck), EDP: slutet av diastoliskt tryck.
Figur 3. Representant 31 P NMR-spektra av isolerade perfusion mus hjärta. Lägg märke till de relativt små Pi topp. I ett aerobt perfusion hjärtat levereras med pyruvat eller fettsyror i tillägg till glukos, bör denna topp vara minimal. Under perioder av ischemi, denna topp ökar medan PCR-topp minskar. Kallelse axeln till höger om α-ATP-topp. Det är bidraget från NAD molekyler. Pi: oorganiskt fosfat; PCR: phosphocreatine; ATP: adenosintrifosfat.
Discussion
31 P NMR-spektroskopi i Langendorff-perfusion isolerade mus hjärta ger tillförlitliga och reproducerbara data. 3, 4 Det är dock viktigt att kanylering av aorta och införandet av LV ballongen görs på rätt sätt så att en stabil hjärt prestanda samtidigt inne i NMR röret. Dessutom är temperaturreglering av största vikt för att uppnå god baslinjen funktion. En viktig faktor för att erhålla god, analyserbart NMR-spektra ökar signal-brus-förhållande. Detta kan uppnås genom att säkerställa optimal "Tuning" och "mellanlägg" på provet. Som nämnts i protokollet texten, kan användningen av ett standardprov före införandet av hjärtat underlätta detta. Det är också bra att ha en tillräcklig storlek "sample". Hjärtan som väger mindre än 100 mg ger oftast lägre PCR och ATP-signaler så ökar i förvärvet tid kommer att krävas för att få bra fosfor-spektra.
Det finns flera sätt att ändra det nuvarande protokollet att samla ytterligare information om hjärtats funktion och energier. I vårt laboratorium har vi perfusion hjärtan med blandade substrat buffertar som kan omfatta förekomsten av olika kombinationer av fettsyror (i låga och höga koncentrationer), laktat, ketoner, och insulin. Med hjälp av stabila isotoper i perfusion bufferten (dvs 13 C-märkt substrat), vi har förmågan att uppskatta substrat utnyttjande av den relativa betydelsen av märkt acetyl CoA till TCA cykeln. 5-7 För denna tillämpning utför vi isotopomer analys av 13 C3 och 13 C4-glutamat med 13 C-NMR-spektroskopi. Detta kräver freeze-fastspänning hjärtat i slutet av perfusionen protokoll och utföra en extraktion av den frusna vävnad. Detta kommer att bli ytterligare ett experiment som analysen kräver användning av en annan sond med separata inställningar parametrar. Andra tillämpningar är att ersätta glukos med deoxyglucose i bufferten samtidigt övervaka tidsberoende ackumulering av 2-deoxyglucose fosfat i hjärtat med hjälp av 31 P NMR-spektroskopi. Denna metod gör det möjligt för mätning av hjärtinfarkt glukosupptaget. 7, 8 dessutom vårt laboratorium har analyserat hjärtfunktion och energin i perfusion protokoll bestående av ischemi / reperfusion och hög arbetsbelastning utmaning. 6, 8-10
Sammanfattningsvis är 31 P NMR-spektroskopi i enstaka mus hjärtan en tekniskt utmanande förfarande som kräver användning av avancerad utrustning. Däremot är de data som den ger ovärderlig för forskare som vill analysera funktion och energetiken av genmanipulerad mus modeller. För vårt laboratorium har dessa tekniker varit avgörande för vår förståelse av konsekvenserna av olika stressfaktorer på hjärtats funktion, energetiken och ämnesomsättning. 1, 11, 12
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Lynne Spencer för hennes stöd under NMR-spektroskopi delen av experimentet. Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health fond R01 HL059246, R01 HL067970, R01 HL088634 (till Dr Tian) och F32 HL096284 (Dr Kolwicz).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Magnesium Sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| EDTA | Reagent | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Potassium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | P4505 | |
| Sodium bicarbonate | Reagent | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Calcium chloride dihydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| D-Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Sodium Pyruvate | Reagent | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Bruker Ultrashield 600WB Plus | Equipment | Bruker Corporation | ||
| PowerLab 4/30 | Equipment |  ADInstruments |
ML866/P | |
| LabChart 6 Pro | Equipment | ADInstruments |
MLS260/6 | |
| Quad Bridge Amp | Equipment | ADInstruments |
ML224 | |
| STH Pump Controller | Equipment | ADInstruments |
ML175 | |
| Minipuls 3 Peristaltic Pump | Equipment | ADInstruments |
ML172 | |
| Disposable BP Transducer | Equipment | ADInstruments |
MLT0699 | |
| 10mm NMR Sample Tube | Equipment | Wilmad LabGlass | 513-7PP-7 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Equipment | BD Biosciences | 427401 | |
| Physiological Pressure Transducer | Equipment | ADInstruments |
MLT844 | |
| Polyethylene tubing PE50 | Equipment | BD Biosciences | 427411 | |
| Micrometer syringe | Equipment | Gilmont Instruments | GS-1101 | |
| McPherson Forceps | Equipment | Miltex Inc. | 18-949 | |
| Castraviejo microscissors | Equipment | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5650 | |
| Neoptix Signal Conditioner | Equipment | Neoptix, Inc. | Reflex - 1 |
References
- Nascimben, L., Ingwall, J. S., Lorell, B. H., Pinz, I., Schultz, V., Tornheim, K., Tian, R. Mechanisms for increased glycolysis in the hypertrophied rat heart. Hypertension. 44, 662-667 (2004).
- Spindler, M., Saupe, K. W., Tian, R., Ahmed, S., Matlib, M. A., Ingwall, J. S. Altered creatine kinase enzyme kinetics in diabetic cardiomyopathy. A(31)P NMR magnetization transfer study of the intact beating rat heart. J Mol Cell Cardiol. 31, 2175-2189 (1999).
- Ingwall, J. S. Phosphorus nuclear magnetic resonance spectroscopy of cardiac and skeletal muscles. Am J Physiol. 242, H729-H744 (1982).
- Ingwall, J. S., Javadpour, M. M., Miao, W. 31P NMR spectroscopy of the mouse heart. Cardiovascular physiology in the genetically engineered. Hoit, B. D., Walsh, R. A. , Kluwer. Boston. 151-163 (2002).
- Luptak, I., Balschi, J. A., Xing, Y., Leone, T. C., Kelly, D. P., Tian, R. Decreased contractile and metabolic reserve in peroxisome proliferator-activated receptor-alpha-null hearts can be rescued by increasing glucose transport and utilization. Circulation. 112, 2339-2346 (2005).
- Yan, J., Young, M. E., Cui, L., Lopaschuk, G. D., Liao, R., Tian, R. Increased glucose uptake and oxidation in mouse hearts prevent high fatty acid oxidation but cause cardiac dysfunction in diet-induced obesity. Circulation. 119, 2818-2828 (2009).
- Luptak, I., Shen, M., He, H., Hirshman, M. F., Musi, N., Goodyear, L. J., Yan, J., Wakimoto, H., Morita, H., Arad, M., Seidman, C. E., Seidman, J. G., Ingwall, J. S., Balschi, J. A., Tian, R. Aberrant activation of AMP-activated protein kinase remodels metabolic network in favor of cardiac glycogen storage. J Clin Invest. 117, 1432-1439 (2007).
- Xing, Y., Musi, N., Fujii, N., Zou, L., Luptak, I., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J., Tian, R. Glucose metabolism and energy homeostasis in mouse hearts overexpressing dominant negative alpha2 subunit of AMP-activated protein kinase. J Biol Chem. 278, 28372-28377 (2003).
- Luptak, I., Yan, J., Cui, L., Jain, M., Liao, R., Tian, R. Long-term effects of increased glucose entry on mouse hearts during normal aging and ischemic stress. Circulation. 116, 901-909 (2007).
- Tian, R., Abel, E. D. Responses of GLUT4-deficient hearts to ischemia underscore the importance of glycolysis. Circulation. 103, 2961-2966 (2001).
- Liao, R., Jain, M., Cui, L., D'Agostino, J., Aiello, F., Luptak, I., Ngoy, S., Mortensen, R. M., Tian, R. Cardiac-specific overexpression of GLUT1 prevents the development of heart failure attributable to pressure overload in mice. Circulation. 106, 2125-2131 (2002).
- Tian, R., Musi, N., D'Agostino, J., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J. Increased adenosine monophosphate-activated protein kinase activity in rat hearts with pressure-overload hypertrophy. Circulation. 104, 1664-1669 (2001).
