Summary
Langendorff modo de perfusión cardiaca aislada, en conjunto con
Abstract
Modelos de ratón de bioingeniería se han convertido en poderosas herramientas de investigación para determinar las relaciones causales entre las alteraciones moleculares y modelos de enfermedad cardiovascular. A pesar de la biología molecular es necesario para identificar los principales cambios en la vía de señalización, no es un sustituto de la importancia funcional. Mientras que la fisiología puede dar respuesta a la cuestión de la función, la combinación de la fisiología con la evaluación bioquímica de los metabolitos en el intacta, latidos del corazón permite una visión completa de la función cardíaca y la energética. Durante años, nuestro laboratorio ha utilizado la perfusión del corazón aislado en combinación con resonancia magnética nuclear (RMN) para realizar esta tarea. Función ventricular izquierda se evaluó mediante la perfusión Langendorff modo de corazón aislado, mientras que la energética cardíaca se mide mediante la realización de
Protocol
- Para estos experimentos, dos sistemas separados se utilizan al mismo tiempo. Para la adquisición de 31 espectros P, un imán Bruker 14T está conectado con la consola Avance III y un ordenador equipado con software TopSpin V2.1. Para la evaluación de la función cardíaca, una costumbre sistema integrado de perfusión cardiaca se interconecta con el PowerLab 04/30 de adquisición de datos, equipado con el LabChartPro 6 software para el análisis de datos.
- En el día del experimento, 1 litro de Krebs-Henseleit buffer se prepara de la siguiente manera: 0,5 mM EDTA, KCl 5.3mm, 1.2mm MgSO4, NaCl 118 mm, y 25 mM de NaHCO3. La mezcla se burbujea con un 5% de CO 2 / 95% O 2 durante 10-15 minutos antes de la adición de 2 mM de CaCl2. Finalmente, los sustratos, en forma de glucosa 10 mM y piruvato 0,5 mm, se agregan.
- Regulación de la temperatura durante el experimento es crucial. Circuladores con calefacción se utilizan para mantener la temperatura entre 37,0 a 37,5 ° C, mientras que el corazón está en el interior del imán. La temperatura se controlarán durante la duración del experimento usando una sonda de fibra óptica de la temperatura.
- La presión de perfusión y la presión del ventrículo izquierdo son monitoreados a través de transductores de presión conectada a un sistema de adquisición de datos y se muestran usando el software incluido. Estos son calibrados con un esfigmomanómetro estándar antes del experimento. Además, las líneas de presión se limpian adecuadamente con el fin de eliminar todas las burbujas de aire.
- Una muestra estándar de 150 mM de fosfato sódico (lo que equivale a la fuerza iónica del buffer KH) se utiliza para "calibrar" la sonda antes de la inserción del corazón. Esto facilita la señal y reduce el tiempo necesario para iniciar el período de adquisición una vez que el corazón se coloca dentro de la sonda.
- Para reducir la coagulación, el ratón es inyectado con 200 unidades de heparina IP Después de 5 minutos, el pentobarbital sódico (175 mg / kg) IP se da.
- El corazón es rápidamente eliminado (con los pulmones y el timo intacto) y detuvo en el hielo frío KH buffer.
- Mientras que se mantienen en hielo, los pulmones se elimina rápidamente. Los lóbulos del timo se identifican y despegar con cuidado hacia atrás para exponer la aorta. El timo es eliminado. La aorta se aísla mediante una cuidadosa eliminación de cualquier tejido que lo rodea.
- Micro pinzas de sutura se utilizan para sostener suavemente las dos paredes de la aorta para exponer la luz. La aorta se coloca cuidadosamente sobre la cánula a partir de 0.965 mm de diámetro exterior tubo de polietileno (PE50). La aorta se sujeta con una pinza de micro barco mientras las suturas son rápidamente atada alrededor de la aorta. El clip se elimina y las pinzas se utilizan para verificar cuidadosamente que la cánula está por encima de la raíz aórtica. Vínculos adicionales se agregan como sea necesario para mantener el corazón en su lugar.
- Cualquier tejido extra se elimina el uso de fórceps y micro tijeras. Una pequeña incisión en la aurícula izquierda. Un tubo de polietileno de 0,61 mm OD (PE10) se inserta cuidadosamente a través de la aurícula izquierda, cavidad del ventrículo izquierdo y sale por la punta, mientras que la celebración de la suavidad del corazón. El tubo se recorta el exceso.
- Un desinflado lleno de agua globo se inserta a través del atrio a la LV y se mantiene en su lugar con cinta adhesiva o suturas. La velocidad de la bomba peristáltica se incrementa gradualmente para permitir un flujo suficiente para el corazón. Hasta que el corazón es el lugar en la sonda de la RMN, el corazón seguirá siendo perfundido con flujo constante equivalente a aproximadamente 2 ml / min. El globo se infla LV con un pequeño volumen con una jeringa micrómetro para verificar que el transductor de presión del VI está funcionando.
- El corazón se inserta cuidadosamente en un tubo de RMN de 10 mm. Un gran agujero "spinner" se utiliza para ayudar a guiar el tubo en la posición correcta dentro de la sonda. Todo el aparato es entonces firmemente adherido a la "cordón umbilical" con cinta adhesiva.
- El cordón umbilical es lentamente en el orificio superior del imán hasta que el tubo del corazón / RMN está dentro de la bobina de la sonda de 10 mm de RMN.
- Una vez que el corazón está en la posición correcta dentro de la sonda, el flujo de la bomba peristáltica se ajusta a fin de lograr una presión de perfusión de 80 mmHg. (Recuerde, que hasta este momento, el corazón fue perfundido con un flujo constante de aproximadamente 2 ml / min). La presión de perfusión y se mantiene al permitir la "retención" en el mecanismo controlador de la bomba. El corazón es entonces de un plazo de equilibrio 15-20 minutos. Durante ese tiempo, el volumen del globo LV se ajusta para lograr una presión diastólica final de 80-10 mmHg.
- Durante el período de equilibrio, es necesario optimizar los parámetros del espectrómetro con el fin de obtener la señal de fósforo posible. Esto se logra mediante el establecimiento de los pulsos de radio en la frecuencia con la que el núcleo de fósforo resuena ("tuning") y hacer que el campo magnético homogéneo ("cuñas").
- Después del período de equilibrio, 31 P múltiples espectros de RMN se pueden obtener. El período de adquisición de cada espectro depende de tque la fuerza del campo del imán, del tamaño de la muestra, y la relación señal a ruido necesaria para un experimento específico. Espectros se obtienen utilizando un imán de 14 Telsa el promedio de la señal obtenida a partir de 256 pulsos de radio frecuencia de 20 ms con un ángulo de 60 grados tapa y los retrasos de 2,0 segundos. Este experimento se requieren aproximadamente 10 min.
Resultados representante
Desde el hardware de adquisición de datos y el software LabChart, varios parámetros de la función cardíaca se puede medir a través del protocolo experimental. La medida típica de la función cardíaca, la presión ventricular izquierda desarrollados (LVDevP), se obtiene restando la presión diastólica final (EDP) de la presión sistólica (Figura 1). Esta medida puede variar dependiendo de la cepa del ratón y la condición del corazón (es decir, la sobrecarga de presión). Sin embargo, en un año normal C57BL6 LVDevP corazón de ratón suele ser de entre 100-110 mmHg en fija la presión diastólica final de 80-10 mmHg. Además, el programa LabChart permite la medición de la frecuencia cardíaca sobre la base de las mediciones cíclicas de las ondas de presión del ventrículo izquierdo. Una vez más, esta medida puede variar, pero los valores típicos son 350 a 400 latidos por minuto cuando el corazón se les permite vencer a un ritmo intrínseco. Sin embargo, el corazón puede ser estandarizada mediante un sistema de estimulación que se mantiene la frecuencia cardíaca de 420 latidos por minuto. Además, las medidas de la contractilidad (+ dP / dt) y relajación (-dP/dt) puede estimarse utilizando la primera derivada de la onda de presión del ventrículo izquierdo. En el protocolo experimental, es fácil de evaluar el mecanismo de Starling mediante la incorporación de una relación presión-volumen. Esto se logra haciendo que los aumentos graduales en el volumen del globo LV y tomando nota de la LVDevP, así como la EDP. Estos valores se pueden representar como se muestra en la Figura 2. Mientras que la curva de Starling es óptimo, teniendo en cuenta el volumen necesario para lograr un procesamiento electrónico de datos de 10.8 mmHg puede dar una idea indirecta de LV dimensión de la cámara. Esto puede ser usado en los modelos de la aorta de bandas como los corazones hipertrofiados por lo general se requiere un volumen del globo más pequeño mientras que los corazones dilatados requieren un mayor volumen en comparación con los controles. La Tabla 1 muestra datos representativos función cardíaca adquirida durante el protocolo de la perfusión.
El 31 P RMN espectrómetro proporcionará señales de fosfocreatina (PCr) y los tres fosfatos de ATP (γ-ATP, α-ATP, y β-ATP), así como el fosfato inorgánico (Pi), como se muestra en la Figura 2. El análisis de cada uno de estos picos proporciona un valor para el área bajo la curva. La cantidad de ATP se calcula el promedio de los γ-ATP y áreas β-ATP. (El α-ATP no se usa porque las moléculas de NAD contribuir a una parte desconocida de la señal total). El estado energético del corazón es determinado por el cociente de la PCR y las áreas ATP (PCr: proporción de ATP). Este valor es normalmente 1,5 a 1,7 en un corazón de ratón se suministra con la glucosa como sustrato primario. Aunque 31 P RMN no proporciona medidas directas de la ATP y PCr, el área de los picos es proporcional a la cantidad de fósforo que contienen los compuestos de la muestra. Los valores de estas señales se puede estimar mediante el uso de otros métodos. Por ejemplo, medidas directas de la ATP por el alto rendimiento de cromatografía líquida (HPLC) en una cohorte de corazón puede producir una concentración media. Este valor puede ser usado para calibrar el promedio de las áreas ATP observado en los espectros. La concentración de PCR puede ser calculado en base a la zona de PCr en relación con el área de la ATP. También es posible estimar el pH mediante el análisis de los desplazamientos químicos relativos del fosfato inorgánico (Pi) de la señal a la señal de PCr. 1 Uso de diferentes secuencias de pulsos de radio, la velocidad de reacción de creatina quinasa o la velocidad de reacción de síntesis de ATP también se puede medir 2.
Tabla 1. Base de la función cardíaca corazones aislados y perfundidos. LVDevP: la presión ventricular izquierda desarrollados; PDFVI: ventrículo izquierdo al final la presión diastólica; FC: frecuencia cardiaca; RPP: presiones sobre el tipo de producto; + dP / dt: primera derivada LV presión positiva; -dP/dt: la presión de la primera derivada LV negativo; PP : la presión de perfusión; CF: el flujo coronario.
Figura 1. Representante LV ondas de presión de software LabChart Pro.
Figura 2. Starling curvas Representante de control (línea continua) y la aorta con banda (línea punteada) en ratones. A) La función sistólica, representada por más de LVDevP aumento de los volúmenes del VI, como determinado por el volumen del globo LV. B) La función diastólica representada por EDP en aumento de los volúmenes del VI, como determinado por el volumen del globo LV. LVDevP: la presión ventricular izquierda desarrollados (sistólica menos diastólica pPRESIÓN), EDP: la presión diastólica final.
Figura 3. Representante 31 P espectros de RMN de corazón aislado y perfundido de ratón. Observe el pico Pi relativamente pequeño. En un corazón perfundido aeróbicamente suministran con ácidos grasos o piruvato, además de la glucosa, este pico debe ser mínimo. Durante los períodos de isquemia, se incrementa mientras que el pico máximo PCr disminuye. Observe el hombro a la derecha del pico α-ATP. Esta es la contribución de las moléculas de NAD. Pi: fosfato inorgánico; PCR: técnica de la fosfocreatina, ATP: el trifosfato de adenosina.
Discussion
31 P espectroscopía de RMN en el corazón de ratón Langendorff perfundidos aislados proporciona datos confiables y reproducibles. 3, 4 Sin embargo, es imperativo que la canulación de la aorta y la inserción del balón LV se hacen correctamente como para permitir que la función cardiaca estable, mientras que el interior de la RMN tubo. Además, la regulación de la temperatura es de suma importancia para lograr la función de línea de base adecuada. Un factor importante en la obtención de los espectros de buena, analizable RMN es el aumento de la relación señal-ruido. Esto puede lograrse asegurando óptima "de ajuste" y "cuñas" en la muestra. Como se menciona en el texto del protocolo, el uso de un estándar de la muestra antes de la inserción del corazón puede facilitar esta tarea. También es útil contar con un adecuado tamaño de "muestra". Corazones que pesan menos de 100 mg por lo general ofrecen un menor PCr y las señales de ATP, podría aumentar en el tiempo de adquisición, será necesario obtener el espectro de fósforo bueno.
Hay varias maneras de modificar el protocolo existente para reunir información adicional sobre la función cardiaca y de la energética. En nuestro laboratorio, hemos perfundido corazones con tampones sustrato mezcla que puede incluir la presencia de diferentes combinaciones de los ácidos grasos (en concentraciones bajas y altas), lactato, cetonas, y la insulina. Con el uso de isótopos estables en el buffer de la perfusión (es decir, 13 C etiquetados sustratos), que poseen la capacidad para estimar la utilización de sustratos de la contribución relativa de la etiqueta de acetil-CoA en el ciclo TCA. 7.5 Para esta aplicación, se realiza isotopomer análisis de 13 y 13 de C3-C4-glutamato con 13 espectroscopía de RMN de C. Esto requiere de congelación y fijación del corazón al final del protocolo de perfusión y realizar una extracción de los tejidos congelados. Este será un experimento adicional en el análisis requiere el uso de una sonda diferente con los parámetros de configuración por separado. Otras aplicaciones incluyen la sustitución de la glucosa con desoxiglucosa en el buffer, mientras que el control de la acumulación en función del tiempo de 2-desoxiglucosa fosfato en el corazón utilizando 31 P espectroscopía de RMN. Este método permite la medición de la absorción de glucosa de miocardio. 7, 8 Además, nuestro laboratorio ha analizado la función cardiaca y de la energética en los protocolos de perfusión que consiste en la isquemia / reperfusión y el desafío de gran carga de trabajo. 6, 80-10
En resumen, 31 P espectroscopía de RMN en los corazones de ratón aislado es un procedimiento técnicamente difícil que requiere el uso de equipo sofisticado. Sin embargo, los datos que los rendimientos son muy valiosos para el investigador que desea analizar la función y la energética de los modelos de ratón de bioingeniería. De nuestro laboratorio, estas técnicas han sido vitales en nuestra comprensión de las consecuencias de una variedad de factores de estrés en la función cardíaca, la energética y el metabolismo. 1, 11, 12
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Lynne Spencer por su apoyo durante la etapa de la espectroscopía de RMN de la experiencia. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud de fondo HL059246 R01, R01 HL067970, R01 HL088634 (con el Dr. Tian) y F32 HL096284 (con el Dr. Kolwicz).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Magnesium Sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| EDTA | Reagent | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Potassium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | P4505 | |
| Sodium bicarbonate | Reagent | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Calcium chloride dihydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| D-Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Sodium Pyruvate | Reagent | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Bruker Ultrashield 600WB Plus | Equipment | Bruker Corporation | ||
| PowerLab 4/30 | Equipment |  ADInstruments |
ML866/P | |
| LabChart 6 Pro | Equipment | ADInstruments |
MLS260/6 | |
| Quad Bridge Amp | Equipment | ADInstruments |
ML224 | |
| STH Pump Controller | Equipment | ADInstruments |
ML175 | |
| Minipuls 3 Peristaltic Pump | Equipment | ADInstruments |
ML172 | |
| Disposable BP Transducer | Equipment | ADInstruments |
MLT0699 | |
| 10mm NMR Sample Tube | Equipment | Wilmad LabGlass | 513-7PP-7 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Equipment | BD Biosciences | 427401 | |
| Physiological Pressure Transducer | Equipment | ADInstruments |
MLT844 | |
| Polyethylene tubing PE50 | Equipment | BD Biosciences | 427411 | |
| Micrometer syringe | Equipment | Gilmont Instruments | GS-1101 | |
| McPherson Forceps | Equipment | Miltex Inc. | 18-949 | |
| Castraviejo microscissors | Equipment | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5650 | |
| Neoptix Signal Conditioner | Equipment | Neoptix, Inc. | Reflex - 1 |
References
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