Summary
Questo protocollo descrive l'isolamento, l'arricchimento e il mantenimento delle cellule tumorali medulloblastoma staminali derivate da topi mutanti con percorso di attività ectopica di Sonic hedgehog.
Abstract
Tumori del cervello sono state proposte di possedere una piccola popolazione di cellule staminali che sono la causa principale di tumorigenesi. Saggi neurosfere sono state generalmente adottate per studiare la natura delle cellule staminali neurali, compresi quelli derivati da tessuti normali e tumorali. Tuttavia, quantità apprezzabili di differenziazione e morte cellulare sono comuni nelle neurosfere colto probabilmente dovuto alla non ottimale condizione come l'accessibilità di tutte le cellule all'interno degli aggregati sfera di terreno di coltura.
Medulloblastoma, il più comune tumore pediatrico sistema nervoso centrale, è caratterizzata da rapida progressione e la tendenza a diffondersi lungo l'intero cervello-spinale, con triste risultato clinico. Medulloblastoma è un tumore neuroepiteliale del cervelletto, che rappresentano il 20% e il 40% dei tumori intracranici e fossa posteriore durante l'infanzia, rispettivamente 1. E 'ormai noto che Shh segnalazione stimola la proliferazione dei precursori neuronali dei granuli cerebellari (CGNPs) durante lo sviluppo del cervelletto 2-4. Numerosi studi utilizzando modelli del mouse, in cui il percorso Shh è costitutivamente attivata, hanno collegato segnalazione Shh con medulloblastoma 5-9.
Un recente rapporto ha mostrato che un sottogruppo di cellule derivate da medulloblastoma Patched1 topi LacZ / + sono le cellule staminali tumorali, che sono in grado di avviare e propogating tumori 10. Qui si descrive un metodo efficace per isolare, arricchire e mantenere le cellule staminali tumorali derivanti da alcuni modelli murini di medulloblastoma, con costitutivamente attivato percorso Shh a causa di una mutazione in Smoothened (11, di cui esso contenute come SmoM2), un GPCR, che è fondamentale per Shh percorso di attivazione. In ogni tessuto medulloblastoma isolato, siamo stati in grado di stabilire numerose colonie altamente proliferative. Queste cellule robustamente espresso diversi marcatori di cellule staminali neurali come Nestin e Sox2, possono subire passaggi consecutivi (maggiore di 20) e sono stati clonogenica. Mentre queste colture di cellule staminali tumorali sono relativamente piccole, spesso bipoar nucleare con elevato rapporto citoplasmatico quando coltivate in condizioni favoriscono la crescita delle cellule staminali, hanno drasticamente modificato la loro morfologia, esteso più processi cellulari, appiattite e si ritirò dal ciclo cellulare dopo il passaggio a una cella mezzo di coltura supplementato con 10% di siero fetale bovino. Ancora più importante, queste cellule staminali tumorali differenziate in Tuj1 NeuN + + o neuroni, astrociti GFAP + e + CNPase oligodendrociti, evidenziando la loro multi-potenza. Inoltre, queste cellule erano in grado di propagare medulloblastomi secondario quando ortotopicamente trapiantate in topi di accoglienza.
Protocol
1. Micro-dissezione del tumore-cuscinetto Cervelletto, dissociazione del tessuto tumorale e placcatura
- Recupero del tessuto tumorale
- Sick topi portatori di medulloblastoma erano spesso runted, visualizzati idrocefalo e tipici sintomi neurologici, tra cui paralisi posteriore e l'incapacità di riacquistare la postura in caso di ribaltamento. Per recuperare tessuto tumorale, eutanasia topi per inalazione di anidride carbonica. E 'importante non eseguire dislocazione cervicale, una procedura che genera una pressione al cranio posteriore e può compromettere l'integrità del tessuto tumorale.
- Decapitazione viene eseguita subito dopo la morte con un paio di forbici, la rimozione dei capelli e tessuto muscolare il più possibile per una buona visualizzazione del cranio. Pulire la superficie del cranio con Kimwipe imbevuto di etanolo al 95%.
- Usare le forbici per tagliare bene un'apertura lungo la linea mediana del cranio, e rimuovere il tessuto cranio con una pinzetta sottile, a questo punto l'intero cervello compreso portatori di tumore cervelletto è esposto.
- Mentre il cervello dei degli adulti sani visualizzare ben definite emisferi e del verme, il tumore del cervello dei topi portatori sono spesso allargata, amorfo con una superficie liscia e vasi sanguigni cospicua. Usando tecniche sterili, recuperare il tumore del cervelletto con delle pinzette e mettere in ghiaccio PBS freddo senza Mg2 + e Ca 2 +.
Nota: tutti gli strumenti sono sterilizzati in etanolo al 95% prima dell'uso. - Dissociazione del tessuto tumorale
- Trasferire il tessuto tumorale da PBS al 50% Accutase (diluito in PBS) che è circa 4 volte il volume del tessuto tumorale, tritare il tessuto con le forbici multa per 3 minuti a temperatura ambiente, seguita da incubazione a 37 ° C per 4 minuti , dopo di che il tessuto subisce pipeting ripetitivi con un 1 mL Pipetman per altri 3 minuti. Questo metodo dovrebbe produrre un insieme di celle singole e piccoli aggregati cellulari.
- Diluire la sospensione cellulare di 3 volte con PBS e centrifugare per 5 minuti a 1000 g per agglomerare le cellule. Risospendere il pellet cellulare in acqua dolce neurali terreno di coltura delle cellule staminali e la piastra su una parabola di 60 gelatinizzato Primaria cultura millimetro di tessuto. Noi usiamo piatti Primaria per l'attacco migliore in placcatura prima; passaggi successivi possono essere placcato su piatti regolare coltura dei tessuti.
Nota: piatti Cappotto cultura con 0,1% di gelatina per almeno 30 minuti. Preparare fresco medio delle cellule neurali staminali coltura composto medio Neurobasal con la glutamina, Pen-Strep, N2, B27, umano EGF (25 ng / ml) e di base FGF (25ng / mL).
2. Arricchimento, manutenzione ed espansione delle cellule tumorali da Medulloblastoma passaggi consecutivi
Noi di solito ricevono molte colonie dopo 1 settimana di placcatura iniziale (Figura 1). Queste colonie può essere dissociata e saltuariamente su nuovi piatti gelatinizzato per l'arricchimento della popolazione delle cellule tumorali. Primo cambio al terreno di coltura nuova, quindi è sufficiente utilizzare un 1-mL Pipetman per staccare meccanicamente colonie seguita da pipeting ripetitivi per 4 minuti fino ad ottenere una sospensione cellulare (non Accutase necessario). Controllare al microscopio per garantire che grumi grandi cellule sono state dissociate. Poi dispensare sospensione cellulare su nuovi piatti gelatinizzato per la coltura ulteriormente e passare attraverso la stessa procedura per i passaggi aggiuntivi. Cellule tumorali senza legami, cellule del sangue e altri tipi di cellule vengono rimosse da seriale ri-placcature, lasciando le cellule tumorali attaccato ad espandersi rapidamente. Cambiare mezzo di coltura il secondo giorno dopo la semina iniziale, e ogni due giorni dopo.
3. La colorazione di immunofluorescenza ed esame delle cellule in coltura
1. Crescere le cellule tumorali a lamelle di vetro
Il giorno 1, mettere un coprioggetto di vetro in ciascuno di un 6-pozzetti, quindi aggiungere 0,1% di gelatina per 30 minuti a 37 ° C. Seme di circa 2-4X 10 5 cellule tumorali per mL. Le cellule devono allegare tutta la notte e le cellule staminali neurali medio cambiato il giorno 3. Colorazione viene eseguita il giorno 4.
2 colorazione immunofluorescenza
Togliere terreno di coltura e le cellule lavare due volte con PBS freddo ghiaccio. Fissare le cellule con appena fatto il 4% PFA per 15 minuti. Brevemente lavare le cellule due volte con PBS e permeablize con 0,3% Triton (in PBS) per 5 minuti. Brevemente lavare le cellule due volte con PBS e blocco con siero di capra 10% per 40 minuti. Incubare le cellule con l'anticorpo primario per 90 minuti, poi lavare le cellule tre volte con PBS, per 5 minuti ciascuno. Incubare le cellule con l'anticorpo secondario per 60 minuti, poi lavare tre volte con PBS, 5 minuti ciascuno. Montaggio su vetrini coprioggetto con 5 ml di un mezzo acquoso di montaggio e di eseguire la microscopia confocale.
4. La differenziazione delle cellule tumorali
Rimuovere nEURAL cellule staminali e medie brevemente lavare le cellule con PBS due volte. Aggiungere mezzo differenziazione al giorno 1, il cambiamento medio nel giorno 4 e determinare il livello di differenziazione da immunofluorescenza il giorno 7. Il mezzo di differenziazione è costituito da DMEM, Pen-Strep e il 10% di siero fetale bovino.
5. Rappresentante Risultati
Morfologia risultati
Dopo il trattamento Accutase e gentile pipeting ripetitivo, il tessuto tumorale dovrebbe essere per lo più dissociata in piccoli aggregati cellulari e cellule singole. Molte colonie di considerevoli dimensioni si possono osservare già 5 giorni dopo la placcatura iniziale, come mostrato dalla Figura 1. Cellule tumorali altamente proliferative sono spesso bi-polare, con elevato rapporto nucleare / citoplasma. Queste cellule si vedono di solito irradia da piccoli aggregati cellulari attaccati alla superficie gelatinizzata. Cellule del sangue, piccolo e rotondo, di solito sono rimosse dai successivi cambiamenti dei media e placcature di serie. Dopo vari passaggi, si può osservare uniformemente distribuiti, proliferativo Ki67 + cellule tumorali e la contaminazione poco con altri tipi di cellule (Figura 2).
Espressione di marcatori di cellule staminali neurali, analisi clonale e differenziazione in linee multiple
Per determinare se le cellule proliferative derivate da dissociato caratteristiche cerebellari mostrano tessuto tumorale di cellule staminali tumorali, abbiamo effettuato la caratterizzazione ulteriore espressione di marcatori di cellule staminali, l'analisi clonale e la potenza differenziazione. Abbiamo scoperto che queste cellule tumorali isolate altamente esprimere marcatori di cellule staminali neurali come Sox2 e Nestin (Figura 3). Come abbiamo recuperate tessuti da SmoM2-YFP tumore, tutte le cellule tumorali esprimere YFP. In linea con un recente studio di reporting che ciglia primarie sono importanti per lo sviluppo di Shh percorso-dipendente medulloblastoma 12, SmoM2-YFP espressione è stata chiaramente localizzata alle ciglia di Sox2 + cellule tumorali (Figura 3). Quando placcato a densità clonale di 300 cellule per ml di terreno di coltura, abbiamo osservato l'espansione clonale di una cellula tumorale solo ad una colonia di considerevoli dimensioni (Figura 4). Inoltre, queste cellule erano in grado di differenziarsi in vari tipi di cellule neuronali e gliali quando coltivate in pro-differenziazione condizioni (Figura 5).
Figura 1. Morfologia di una colonia altamente proliferative dopo placcatura primo tessuto medulloblastoma dissociato. In genere, si forma una colonia consistente entro 5 giorni dalla semina iniziale di tessuto tumorale dissociato, e un rappresentante è illustrato qui in campo chiaro. Bi-polare, irradiare le cellule allungate da un denso aggregato di cellule fondamentali. Allegati alle cellule tumorali sono piccole, cellule rotonde rosse del sangue, che vengono gradualmente impoverito da placcature di serie.
Figura 2. Morfologia delle cellule di medulloblastoma stabilita oltre tre passaggi. Questa immagine in campo chiaro mostra l'aspetto tipico delle cellule medulloblastoma stabilito dopo diversi passaggi. Le cellule rimangono per lo più bi-polare, con alta attività / citoplasmatica rapporto. Mostriamo colorazione acetilati tubulina delle cellule tumorali, la maggior parte delle quali sono in bicicletta, come mostrato da una forte espressione di Ki67.
Figura 3. Cellule di medulloblastoma stabilito esprimere marcatori di cellule staminali neurali. SmoM2-YFP segni di cellule che esprimono costitutivamente attiva Smo, quindi l'attività pathway Shh. Tutte le cellule del medulloblastoma linee cellulari stabilito espresso YFP, e la maggior parte di loro co-espressi alti livelli di marcatori di cellule staminali neurali diverse, come ad esempio Nestin e Sox2. È interessante notare che quando abbiamo effettuato il rilevamento del segnale YFP con potenza laser minimo durante la microscopia confocale, abbiamo rilevato il segnale YFP concentrato nelle cellule cilia di Sox2 +. Questa osservazione è coerente con un 12 recente rapporto che ha descritto il ruolo essenziale delle ciglia per lo sviluppo di Shh percorso-dipendente medulloblastoma.
Figura 4. Fondata cellule tumorali subiscono espansione clonale. Dopo la dissociazione in sospensione singola cellula, le cellule tumorali sono stati piastrati su un piatto ben 24 con una densità clonale di 300 cellule per ml di terreno di coltura. In ogni pozzetto abbiamo osservato le colonie clonale ampliato. Questa serie di immagini in campo chiaro dimostrare i cambiamenti tipici nel corso di un periodo di 10 giorni di cultura.
Figura 5. Analisi di differenziazione delle cellule medulloblastoma stabilito. Quando le cellule tumorali sono passati da FEG / bFGF contenente mezzo privo di siero di FBS% DMEM/10, YFP + cellule tumorali significativamente alterato la loro morfologia e differenziato in vari tipi di cellule, incLuding Tuj1 NeuN + + o neuroni, le cellule GFAP + astrogliali o CNPase + oligodendrociti.
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Discussion
Descriviamo un modo efficace per isolare, arricchire e mantenere le cellule staminali da medulloblastoma primario tessuto tumorale recuperato da topi mutanti con costitutivamente attiva di segnalazione Hedgehog. Abbiamo scoperto che un passo fondamentale in successo, che istituisce un sano linea di staminali delle cellule tumorali è il trattamento Accutase utilizzato durante la dissociazione del tessuto del tumore primario. Nella nostra esperienza, al momento della prima tessuto tumorale dissociare dal cervelletto, 4 minuti di trattamento Accutase 50% a 37 ° C, seguita da 3 minuti di pipeting ripetitive utilizzando un 1-mL Pipetman generalmente risultato di successo prima semina. E 'inoltre importante attendere colonie di considerevoli dimensioni si formano prima di ri-placcatura (Figura 1). Dopo la semina soccorso, terapia Accutase non è più necessaria; pipeting ripetitivi per 3-4 minuti con un 1-mL Pipetman è sufficiente per rimuovere e dissociare grumi di cellule per la ri-placcatura. Non utilizzare Pipetman volume più piccolo come la punta più fine danneggia le cellule ampiamente. Una linea di cellule prestabilite possono essere generati da tutti i tessuti tumorali isolate e queste cellule sono altamente proliferative, robustamente esprimere diversi marcatori di cellule staminali neurali e possono differenziarsi in entrambi i tipi di cellule neuronali e gliali. Abbiamo effettuato il trapianto ortotopico di queste cellule in topi immunocompromessi destinatario che successivamente sviluppato medulloblastomi secondaria. Queste cellule tumorali in coltura esposte raramente differenziazione spontanea o apoptosi, caratteristiche che sono comuni a metodi di coltura neurosfere. Questo protocollo è progettato per la propagazione di successo di cellule staminali tumorali derivati da medulloblastoma primario e, quindi, ci permetterà di testare gli effetti di geni candidati e gli inibitori chimici Hedgehog-driven crescita delle cellule tumorali e il comportamento.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato anche da finanziamenti della Vanderbilt-Ingram Cancer Center Support Grant (P30 CA068485), il Brain Tumor Foundation Infanzia e il National Institutes of Health (NS042205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | 0.1% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Primaria dishes | Fisher Scientific | 087724C | |
| Sox2 antibody | EMD Millipore | MAB4343 | Mouse, 1:1000 |
| Nestin antibody | DSHB | rat401 | Mouse, 1:200 |
| YFP antibody | Molecular Probes, Life Technologies | A11122 | Rabbit, 1:2000 |
| GFAP antibody | Neuromics | CH22102 | Chicken, 1:1000 |
| Tuj1 antibody | Sigma-Aldrich | T5076 | Mouse, 1:2000 |
| NeuN antibody | EMD Millipore | MAB377 | Mouse, 1:2000 |
| CNPase antibody | EMD Millipore | MAB326 | Mouse, 1:1000 |
References
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