Summary
这个协议描述和异位刺猬通路活性的突变小鼠的髓母细胞瘤肿瘤干细胞的分离，浓缩，维护。
Abstract
脑肿瘤已建议拥有人口少的干细胞，是肿瘤发生的根本原因。神经球分析已普遍采用，以研究神经干细胞，包括那些来自正常和肿瘤组织的性质。然而，分化和细胞死亡的可观的金额，共同培养的神经球，很可能是由于次优的条件，如细胞培养液中在所有领域聚集内无障碍。
髓母细胞瘤，小儿中枢神经系统最常见的肿瘤，其特点是它的快速进展和扩散趋势沿整个脑脊髓轴与惨淡的临床结果。髓母细胞瘤是小脑的神经上皮肿瘤，约占颅内和后颅窝肿瘤的童年的20％和40％， 分别为1。现在是完善的，Shh信号刺激小脑颗粒神经元前体（CGNPs）的增殖， 在小脑发展2-4。许多研究使用的小鼠模型，在SHH通路组成激活，与髓母细胞瘤5-9 Shh信号。
最近的一份报告表明，从Patched1 LacZ基因/ +小鼠的髓母细胞瘤细 胞的一个子集，是癌症的干细胞，这是能够启动和propogating肿瘤10。在这里，我们描述组成激活SHH通路由于在理顺突变（11，关于此简称为SmoM2），一个GPCR的关键是嘘隔离开来，丰富和维护几个髓母细胞瘤小鼠模型的肿瘤干细胞的有效方法，通路的激活。在每一个孤立的髓母细胞瘤组织，我们能够建立大量高度增生的殖民地。强劲表达一些神经干细胞标记物，如巢和Sox2这些细胞，可以进行串行通道（大于20），克隆形成。虽然这些培养的肿瘤干细胞相对较少，往往与高核质比，有利于干细胞生长的条件下培养时bipoar，他们极大地改变它们的形态，扩展多种细胞过程，夷为平地，从细胞周期退出后，切换到一个单元格辅以10％胎牛血清的培养基。更重要的是，这些肿瘤干细胞分化成Tuj1 +或NeuN +神经元，GFAP +的星形胶质细胞和CNPase +少突胶质细胞，从而突出其多效力。此外，这些细胞能够传播继发髓母细胞瘤原位移植到宿主小鼠时。
Protocol
1。微解剖荷瘤小脑，肿瘤组织和电镀分解
- 检索肿瘤组织
- 患病老鼠轴承髓母细胞瘤常runted，显示脑积水和典型的神经症状，包括瘫痪后未能收复当朝天的姿势。要检索肿瘤组织，安乐死小鼠吸入二氧化碳。重要的是不要执行颈椎脱位，程序产生的压力后的头骨，并能破坏肿瘤组织的完整性。
- 斩首是死亡后，立即用一把剪刀，头发和肌肉组织，尽可能消除良好的可视化的头骨。清洁的头骨表面用95％乙醇浸泡Kimwipe。
- 用细剪刀削减开放沿着头骨中线，然后取出用细镊子，在这一点荷瘤全脑包括小脑暴露颅骨组织。
- 虽然健康成人小脑显示定义的半球和蚓部，荷瘤小鼠的小脑往往是一个光滑的表面和突出的血管扩大，无定形。使用无菌技术，检索的小脑肿瘤，使用镊子和地方在冰冷PBS没有MG2 + 和 Ca 2 + 。
- 肿瘤组织离解
- 转移的肿瘤组织从PBS，以50％的Accutase（PBS稀释）的4倍左右的肿瘤组织的体积，组织讳言罚款剪刀为3分钟，在室温下孵育其次，在37 ° C，4分钟之后，该组织经过与另外3分钟1毫升Pipetman的重复pipeting。这种方法应该产生一个单细胞和小细胞聚集的混合物。
- 在1000克5分钟沉淀细胞稀释的细胞悬浮液的3倍，用PBS和离心机。重悬到一个60毫米的糊化Primaria组织培养皿中的细胞沉淀在新鲜的神经干细胞培养液和板。我们使用Primaria菜在第一电镀增强附件，随后的段落可能会定期组织培养皿镀上。
注：所有仪器在使用前95％的乙醇消毒。
注：明胶0.1％，为至少30分钟的外衣培养皿。准备新鲜的神经干细胞的培养基Neurobasal培养基的组成与谷氨酰胺，钢笔，链球菌，氮气，B27，人类表皮生长因子（25毫微克/毫升）和基本的FGF（25ng /毫升）。
2。由串行通道的充实，维护和扩大髓母细胞瘤瘤细胞
初步电镀后1周（图1），我们通常会得到许多殖民地。这些殖民地可以分离到肿瘤细胞的人口致富的新的糊化菜肴replated。第一个变化，以新的培养基，然后只需使用1毫升Pipetman机械分离4分钟重复pipeting的殖民地，以产生细胞悬浮液（没有Accutase必要）。在显微镜下检查，以确保大细胞团块已分离。然后，免除到新的糊化菜肴细胞悬液，为进一步培养和额外的通道经过同样的程序。独立的肿瘤细胞，血细胞和其他类型的细胞的串行重新电镀被删除，留下附着的肿瘤细胞迅速扩大。改变文化中等以下初步播种第二天，此后每隔一天。
3。培养细胞的免疫荧光染色和考试
1。肿瘤细胞生长在盖玻片
在第1天，地方6孔板每一个玻璃盖玻片，然后添加0.1％在37明胶30分钟° C。种子约2 - 4X 10 5每毫升肿瘤细胞。应重视通宵细胞和神经干细胞的介质改变了3天。染色进行4天。
2免疫荧光染色
与冰冷的PBS删除培养基洗涤细胞两次。 15分钟，修复细胞与新鲜的4％PFA。简言之，用PBS洗涤细胞两次，0.3％的Triton（PBS）的permeablize 5分钟。简单用PBS和阻止细胞40分钟，用10％山羊血清的两倍。原发性抗体的细胞孵育90分钟，然后洗净细胞，用PBS三次，每次5分钟。孵育60分钟二次抗体的细胞，然后用PBS洗三次，每次5分钟。装载到5毫升水溶液安装介质中的幻灯片的盖玻片和执行共聚焦显微镜。
4。肿瘤细胞的分化
取出的神经干细胞的培养基，并简要，用PBS洗细胞两次。分化培养基上添加第1天，第4天的中期和分化程度确定由7天的免疫荧光染色。分化培养基组成，笔链球菌和10％胎牛血清的DMEM。
5。代表性的成果
形态学结果
Accutase治疗和轻柔的重复pipeting后，肿瘤组织应多为小细胞聚集和单核细胞分离到。可以观察到许多可观的殖民地，早在5天之后，最初的电镀，如图1所示。高核/质比，高度增生的肿瘤细胞往往是两极。这些细胞通常从糊化表面附着的小细胞聚集辐射。血细胞，小而圆，通常随后的媒体的变化和串行电镀中删除。几个段落后，人们可以观察到均匀分布，增殖的Ki67的+肿瘤细胞，并与其他类型的细胞（图2）小污染。
表达了神经干细胞的标记，克隆分析和分化成多个谱系
要确定是否增殖细胞分离小脑肿瘤组织显示肿瘤干细胞特性的，我们进行了进一步鉴定，表达干细胞标记，克隆分析和分化效力。我们发现，这些孤立的肿瘤细胞高度表达Sox2和巢（图3），如神经干细胞标记物。当我们检索SmoM2 - YFP的肿瘤组织，所有的肿瘤细胞表达YFP的。与最近的研究报告说，初级纤毛相一致是重要的发展SHH通路依赖髓母细胞瘤12 SmoM2 - YFP表达清楚本地化SOX2的纤毛+肿瘤细胞（图3）。镀密度每毫升培养液300细胞克隆时，我们观察到一个庞大的殖民地（图4）从单一的肿瘤细胞克隆扩增。此外，这些细胞能够分化成各种神经元和神经胶质细胞类型，培养亲分化条件下（图5）。
图1。形态后，游离神经管细胞瘤组织的第一个电镀高度增生的殖民地。一般来说，一个可观的殖民地形式分离肿瘤组织中的初始播种后5天之内，并代表之一，是这里说明，在明亮的领域。双极，拉长的细胞从茂密的核心单元总辐射。作用于肿瘤细胞，是小的，圆的红血细胞，它正逐渐耗尽串行电镀。
图2。建立了三个通道以外的髓母细胞瘤细 胞的形态。这间明亮的现场图像显示的几个段落后成立的髓母细胞瘤细胞的典型外观。细胞保持多为高核/质比两极。我们显示肿瘤细胞的乙酰化微管蛋白染色，其中大部分是骑自行车强Ki67表达所示。
图3。成立的髓母细胞瘤细 胞表达神经干细胞标记物。 SmoM2 - YFP标志着表达活性SMO，因此SHH通路活动。所有既定的髓母细胞瘤细胞株细胞表达YFP的，和他们共同表达的各种神经干细胞的标志物，如巢和Sox2，高水平。有趣的是，当我们执行与最小的激光功率，在激光共聚焦显微镜YFP的信号检测，我们发现集中在Sox2基因+细胞的纤毛YFP的信号。这种观察与描述SHH通路依赖髓母细胞瘤的发展中重要作用的纤毛最近的一份报告 12相一致。
图4。既定的肿瘤细胞进行克隆扩增。后离解成单细胞悬液，肿瘤细胞接种到24井板，在每毫升培养液300细胞克隆密度。在每口井，我们观察到克隆扩大的殖民地。这一系列明场图像表明，超过10天期间的文化的典型变化。
图5。建立髓母细胞瘤细 胞分化的分析 。当肿瘤细胞被含有EGF /碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基DMEM/10％FBS，YFP的切换+肿瘤细胞有明显的改变了他们的morphology和成各种细胞类型，包括Tuj1 +或NeuN +神经元，GFAP +的星形胶质细胞或CNPase +少突胶质细胞分化。
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Discussion
我们描述了一个高效的方式隔离开来，充实和维持髓母细胞瘤干细胞从原发肿瘤组织组成性激活Hedgehog信号的突变小鼠检索。我们发现，成功地建立一个健康的肿瘤干细胞系的一个关键的一步Accutase治疗原发肿瘤组织中的解离过程中使用。根据我们的经验，当第一游离小脑肿瘤组织中，50％在37 Accutase治疗4分钟° C，重复pipeting 3分钟使用1毫升Pipetman，一般会导致成功的第一直播。同样重要的是要等到重新电镀（图1）前形成相当大的殖民地。第一次播种后，Accutase治疗不再是必要的;为3-4分钟，使用1毫升的Pipetman重复pipeting足以驱逐和游离细胞团块，再镀。不要使用更小的体积Pipetman的细节提示会损害细胞的广泛。已建立的细胞株可以从每一个孤立的肿瘤组织产生，这些细胞高度增生，有力表达多种神经干细胞标记和可以分化成神经元和神经胶质细胞类型。我们已经进行到这些细胞的免疫能力受损的受体小鼠，随后制定了中学的髓母细胞瘤原位移植。在文化这些肿瘤细胞很少展出自发分化或凋亡，是常见的神经球培养方法的特点。此协议是专为从小学髓母细胞瘤的肿瘤干细胞的成功繁殖，因此，将使我们能够测试刺猬驱动的肿瘤细胞的生长和行为上的候选基因和化学抑制剂的影响。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是由Vanderbilt - Ingram癌症中心支援津贴（P30 CA068485），儿童脑瘤基金会和美国国立卫生研究院（NS042205）的赠款支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | 0.1% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Primaria dishes | Fisher Scientific | 087724C | |
| Sox2 antibody | EMD Millipore | MAB4343 | Mouse, 1:1000 |
| Nestin antibody | DSHB | rat401 | Mouse, 1:200 |
| YFP antibody | Molecular Probes, Life Technologies | A11122 | Rabbit, 1:2000 |
| GFAP antibody | Neuromics | CH22102 | Chicken, 1:1000 |
| Tuj1 antibody | Sigma-Aldrich | T5076 | Mouse, 1:2000 |
| NeuN antibody | EMD Millipore | MAB377 | Mouse, 1:2000 |
| CNPase antibody | EMD Millipore | MAB326 | Mouse, 1:1000 |
References
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