Summary
يصف هذا البروتوكول من العزلة ، والإثراء ، وصيانة الخلايا الجذعية ورم نخاعي المستمدة من الفئران الطافرة مع سونيك القنفذ مسار النشاط خارج الرحم.
Abstract
وقد اقترحت أورام المخ لامتلاك عدد قليل من السكان من الخلايا الجذعية التي هي السبب الجذري لتكون الأورام. وقد تم اعتماد المقايسات Neurosphere عموما لدراسة طبيعة الخلايا الجذعية العصبية ، بما في ذلك تلك المستمدة من الأنسجة الطبيعية ورمي. ومع ذلك ، وكميات ملموسة من التمايز وموت الخلية شائعة في neurospheres مثقف بسبب المرجح أن حالة شبه مثالية مثل إمكانية الوصول إلى جميع الخلايا ضمن المجاميع المجال لثقافة المتوسط.
يتميز نخاعي ، وأكثرها شيوعا ورم CNS الأطفال ، عن طريق التقدم السريع والميل الى الانتشار على طول محور الدماغ الشوكي كامل مع نتائج سريرية كئيبة. هو ورم نخاعي ظهاري من المخيخ ، وهو ما يمثل 20 ٪ و 40 ٪ من الورم داخل القحف والحفرة الخلفية في مرحلة الطفولة ، على التوالي 1. الآن أنها راسخة بأن SHH يحفز يشير انتشار الخلايا العصبية للدماغ السلائف الحبيبية (CGNPs) خلال التنمية مخيخي 2-4. وربطت دراسات عديدة باستخدام نماذج الماوس ، والذي يتم تنشيط المسار constitutively SHH ، مما يشير SHH مع نخاعي 5-9.
وأظهر تقرير صدر مؤخرا أن مجموعة فرعية من الخلايا المشتقة من الفئران نخاعي LacZ Patched1 / + هي الخلايا الجذعية السرطانية ، والتي هي قادرة على بدء والأورام propogating 10. نحن هنا وصف وسيلة فعالة لعزل ، وإثراء والحفاظ على الخلايا الجذعية المشتقة من ورم نماذج الماوس العديد من نخاعي ، مع تنشيط مسار SHH constitutively بسبب طفرة في مملس (11 ، على النحو المشار إليه hereon SmoM2) ، وهو النوع من الاختزال الذي هو أمر حاسم لSHH مسار التنشيط. في كل الأنسجة نخاعي معزولة ، كنا قادرين على إقامة العديد من المستعمرات التكاثري للغاية. يمكن لهذه الخلايا وأعرب بقوة عدة الخلايا الجذعية العصبية علامات مثل Nestin وSox2 ، مقاطع المسلسل الخضوع (أكبر من 20) وكان مولد الرمع. في حين أن هذه الخلايا الجذعية السرطانية مثقف كانت صغيرة نسبيا ، وغالبا ما bipoar النووية مع ارتفاع لنسبة حشوية عند المثقف في ظل ظروف لصالح وقف نمو الخلايا ، التي غيرت بشكل كبير على التشكل ، وسعت العمليات الخلوية متعددة ، بالارض ، وانسحب من دورة الخلية عند التحول إلى خلية مستنبت تستكمل مع مصل بقري جنيني من 10 ٪. الأهم من ذلك ، هذه الخلايا الجذعية السرطانية المختلفة في Tuj1 + أو + NeuN الخلايا العصبية ، والخلايا النجمية GFAP + + CNPase oligodendrocytes ، وبالتالي تسليط الضوء على قوة متعددة. وعلاوة على ذلك ، كانت هذه الخلايا قادرة على التكاثر medulloblastomas الثانوية عند زرعها في الفئران orthotopically المضيف.
Protocol
1. الجزئي تشريح الورم الحاملة المخيخ ، تفكك نسيج الورم والتصفيحات
- استرجاعها من الأنسجة الورم
- عرض موه الرأس وأعراض عصبية نموذجية ، بما في ذلك الشلل الخلفي والفشل في استعادة الموقف عندما انقلبت runted كانت في كثير من الأحيان المرضى نخاعي الفئران الحاملة. لاسترداد أنسجة الورم ، والموت ببطء الفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون. فمن المهم عدم القيام خلع عنق الرحم ، وهو الإجراء الذي يولد الضغط في الجمجمة الخلفي ، ويمكن حل وسط الورم سلامة الأنسجة.
- يتم تنفيذ قطع الرؤوس على الفور بعد وفاة باستخدام مقص ، وإزالة الشعر والأنسجة العضلية قدر الإمكان عن التصور الجيد للجمجمة. تنظيف السطح من الجمجمة مع Kimwipe غارقة مع الايثانول 95 ٪.
- استخدام مقص لقطع غرامة فتح على طول خط الوسط من الجمجمة ، وإزالة الأنسجة الجمجمة باستخدام الملقط غرامة ، والنقطة التي يتعرض لها الدماغ كله بما في ذلك الورم الحاملة المخيخ.
- في حين أن مخيخات من البالغين الأصحاء عرض محددة جيدا نصفي الكرة الأرضية ودودة ، ومخيخات من الفئران الحاملة للورم وغالبا ما تكون موسعة ، غير متبلور مع سطح أملس والأوعية الدموية واضح. باستخدام تقنيات عقيمة ، استرداد ورم مخيخي باستخدام الملقط ومكان في الجليد الباردة PBS دون Mg2 + و 2 + كا.
ملاحظة : يتم تعقيم جميع الأدوات في الايثانول 95 ٪ قبل الاستخدام. - تفكك نسيج الورم
- نقل أنسجة الورم من برنامج تلفزيوني لAccutase 50 ٪ (المخفف في PBS) التي هي على وشك حجم 4 مرات من نسيج الورم ، واللحم المفروم مع النسيج المقص الغرامة لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، تليها الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ، وبعد ذلك يخضع الأنسجة pipeting المتكررة مع Pipetman 1 مل عن 3 دقائق إضافية. هذا الأسلوب يجب أن يسفر عن خليط من الخلايا واحد ومجاميع صغيرة الخلوية.
- تمييع تعليق الخلوية 3 أضعاف مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز 1000 إلى خلايا بيليه. Resuspend بيليه في خلية جديدة في المتوسط الجذعية العصبية خلية ثقافة والصعود إلى لوحة gelatinized Primaria 60 ملم صحن زراعة الأنسجة. نستخدم الأطباق Primaria لتعزيز المرفق في الطلاء الأولى ؛ قد يكون مطلي المقاطع اللاحقة على أطباق زراعة الأنسجة العادية.
ملاحظة : أطباق معطف الثقافة بنسبة 0.1 ٪ الجيلاتين لا يقل عن 30 دقيقة. اعداد جديدة من الخلايا الجذعية العصبية تتكون من مستنبت المتوسطة Neurobasal مع الجلوتامين ، القلم بكتيريا ، N2 ، B27 ، EGF الإنسان (25 نانوغرام / مل) ، وجمعية جيل المستقبل الأساسية (25ng / مل).
2. تخصيب اليورانيوم والصيانة والتوسع في الخلايا السرطانية عن طريق ممرات المسلسل نخاعي
عادة ما نحصل على العديد من المستعمرات بعد 1 اسبوع من الطلاء الأولي (الشكل 1). يمكن لهذه المستعمرات يمكن فصلها وreplated على أطباق جديدة لتخصيب gelatinized من السكان الخلية السرطانية. التغيير الأول لثقافة جديدة متوسطة ، ثم ببساطة استخدام Pipetman 1 مل ميكانيكيا لفصل المستعمرات تليها pipeting متكررة لمدة 4 دقائق لتسفر عن تعليق الخلوية (أي Accutase الحاجة). الاختيار تحت المجهر للتأكد من أن الخلية كتل كبيرة قد تم فصلها. ثم الاستغناء عن التعليق على الخلية gelatinized أطباق جديدة لزراعة المزيد من وتذهب من خلال نفس الإجراء مقاطع إضافية. تتم إزالة الخلايا السرطانية غير مرتبط ، وخلايا الدم وأنواع الخلايا الأخرى عن طريق إعادة المسلسل التصفيح ، وترك الخلايا السرطانية تعلق في التوسع بسرعة. تغيير الثقافة المتوسطة في اليوم الثاني بعد غرس البذور الأولي ، وبعد ذلك مرة كل يومين.
3. مناعي يلطخ وفحص الخلايا المستزرعة
1. تنمو الخلايا السرطانية على الزجاج coverslips
في يوم 1 ، ساترة الزجاج مكان واحد في كل من لوحة 6 - جيدا ، ثم يضاف الجيلاتين 0.1 ٪ لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. البذور حوالي 2 10 5 - 4X الخلايا السرطانية لكل مليلتر. وينبغي إرفاق الخلايا بين عشية وضحاها ، والخلايا الجذعية العصبية المتوسطة تغيرت في اليوم 3. يتم تنفيذ تلطيخ يوم 4.
2 تلوين مناعي
إزالة الخلايا المتوسطة الثقافة ويغسل مرتين مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني. تحديد الخلايا مع طازجة من صنع PFA 4 ٪ لمدة 15 دقيقة. غسل الخلايا لفترة وجيزة مرتين مع برنامج تلفزيوني وpermeablize مع تريتون 0.3 ٪ (في برنامج تلفزيوني) لمدة 5 دقائق. غسل الخلايا لفترة وجيزة مرتين مع برنامج تلفزيوني وكتلة مع مصل الماعز 10 ٪ لمدة 40 دقيقة. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 90 دقيقة ، ثم يغسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ، لمدة 5 دقائق لكل منهما. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 60 دقيقة ، ثم يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ، كل 5 دقائق. جبل coverslips على الشرائح مع 5 مل من الوسط المائي وتصاعد أداء المجهري متحد البؤر.
4. تمايز الخلايا السرطانية
ن إزالةeural المتوسطة الخلايا الجذعية وغسل الخلايا لفترة وجيزة مع برنامج تلفزيوني مرتين. إضافة متوسطة التمايز في اليوم 1 ، تغيير المتوسطة في يوم (4) وتحديد مستوى التمايز عن طريق تلوين المناعي في يوم 7. المتوسط يتكون من تمايز DMEM ، القلم بكتيريا ، و 10 ٪ مصل بقري جنيني.
5. ممثل النتائج
مورفولوجيا النتائج
وبعد العلاج Accutase pipeting المتكررة لطيف ، ينبغي للنسيج الورم يمكن فصلها معظمها في المجاميع والخلايا الصغيرة الخلوية واحد. ويمكن ملاحظة العديد من المستعمرات لا بأس به في أقرب وقت بعد 5 أيام الطلاء الأولي ، كما يتضح من الشكل رقم 1. الخلايا السرطانية التكاثري للغاية وغالبا ما تكون ثنائية القطبية مع ارتفاع نسبة النووية / هيولي. وتعتبر هذه الخلايا عادة يشع من المجاميع الخلوية الصغيرة التي تعلق على سطح gelatinized. وعادة ما تتم إزالة خلايا الدم والصغيرة والدور ، من خلال وسائل الاعلام التغييرات اللاحقة والتصفيح التسلسلي. بعد العديد من المقاطع ، يمكن للمرء الاحتفال وزعت بشكل موحد ، التكاثري Ki67 + الخلايا السرطانية وتلوث قليلا مع أنواع الخلايا الأخرى (الشكل 2).
التعبير عن علامات الخلايا الجذعية العصبية ، والتحليل والتمايز في نسيلي الأنساب متعددة
لتحديد ما إذا كانت الخلايا المشتقة من التكاثري نأت ورم مخيخي الخصائص تظهر الأنسجة من الخلايا الجذعية السرطانية ، أجرينا توصيف المزيد من الخلايا الجذعية علامة التعبير ، وقدرة التحليل نسيلي التمايز. وجدنا أن هذه الخلايا السرطانية معزولة للغاية التعبير عن علامات العصبية مثل الخلايا الجذعية وSox2 Nestin (الشكل 3). ونحن من الأنسجة استرجاع SmoM2 - YFP الورم ، وأعرب عن الخلايا السرطانية YFP. تتفق مع دراسة حديثة أن التقارير الأولية أهداب هامة لتطوير مسار نخاعي تعتمد SHH 12 ، SmoM2 - YFP تم التعبير بوضوح المترجمة إلى أهداب من Sox2 + الخلايا السرطانية (الشكل 3). عندما لاحظنا كثافة في نسيلي مطلي من 300 خلية لكل مليلتر من مستنبت ، والتوسع النسيلي من خلية الورم واحد إلى مستعمرة كبيرة (الشكل 4). وعلاوة على ذلك ، كانت هذه الخلايا قادرة على التمايز إلى مختلف أنواع الخلايا العصبية والدبقية عندما مثقف تحت الموالية للتمايز الظروف (الشكل 5).
الشكل 1. مورفولوجية مستعمرة التكاثري للغاية بعد الطلاء الأولى من الأنسجة نخاعي فصلها. عموما ، فإن دلت على وجود أشكال مستعمرة كبيرة في غضون 5 أيام بعد الغرس الأولي من نسيج الورم فصلها ، وممثل واحد هنا في مجال مشرق. ثنائية القطبية ، وتشع الخلايا ممدود من مجموع الخلية الأساسية الكثيفة. تعلق على الخلايا السرطانية هي ، صغيرة مدورة خلايا الدم الحمراء ، التي استنفدت تدريجيا التصفيح التسلسلي.
الشكل 2. مورفولوجيا الخلايا نخاعي أنشأت أكثر من ثلاثة مقاطع. هذه الصورة المشرقة حقل يظهر في مظهر نموذجي للخلايا نخاعي أنشئت بعد العديد من المقاطع. الخلايا تبقى في معظمها ثنائي القطبية مع نسبة النووية / هيولي عالية. نظهر الأسيتيل تلطيخ تويولين من الخلايا السرطانية ، ومعظمها الدراجات كما يتضح من التعبير Ki67 قوية.
الشكل 3. خلايا المنشأ نخاعي التعبير عن علامات العصبية الخلايا الجذعية. SmoM2 - YFP علامات الإعراب عن الخلايا النشطة constitutively SMO ، وبالتالي SHH النشاط الطريق. وأعرب عن خلايا المنشأ خلايا نخاعي خطوط YFP ، ومعظمهم شارك في أعربت مختلف مستويات عالية من العصبية علامات الخلايا الجذعية ، مثل Nestin وSox2. ومن المثير للاهتمام ، اكتشفنا أننا عندما يقوم YFP الكشف عن إشارة مع الحد الأدنى من قوة الليزر خلال الفحص المجهري متحد البؤر ، وتتركز في إشارة YFP أهداب الخلايا + Sox2. هذه الملاحظة بما يتفق مع تقرير حديث أن 12 صفه بالدور الأساسي للأهداب في تطوير مسار نخاعي تعتمد SHH.
الشكل 4. الخلايا السرطانية أنشئت الخضوع التوسع نسيلي. بعد تفكك في تعليق خلية واحدة ، كانت مطلية الخلايا السرطانية في الصعود إلى 24 صفيحة جيدا في مناطق ذات كثافة نسيلي من 300 خلية لكل مليلتر من المتوسط الثقافة. في كل بئر احظنا توسيع المستعمرات clonally. هذه السلسلة من الصور تظهر التغييرات الميدانية مشرق نموذجي خلال فترة 10 يوما للثقافة.
الشكل 5. تحليلات تمايز الخلايا نخاعي المنشأ. عندما تحول الخلايا السرطانية من EGF / bFGF يحتوي المصل خالية من متوسطة إلى FBS ٪ DMEM/10 ، YFP + الخلايا السرطانية تغيير كبير التشكل ومتباينة في مختلف أنواع الخلايا ، المؤتمر الوطني العراقيluding Tuj1 + أو + NeuN الخلايا العصبية ، الخلايا astroglial GFAP + أو + CNPase oligodendrocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن تصف وسيلة فعالة لعزل ، وإثراء والحفاظ على الخلايا الجذعية من أنسجة الورم نخاعي الأولية التي تم استردادها من الفئران الطافرة مع إشارات نشطة constitutively القنفذ. وجدنا أن واحدة خطوة حاسمة في وضع بنجاح الجذعية السرطانية صحية خط الخلية هو العلاج Accutase المستخدمة أثناء تفكك الأنسجة السرطانية الأولية. في تجربتنا ، الاولى عندما والنأي نسيج الورم من المخيخ ، 4 دقائق من العلاج Accutase 50 ٪ عند 37 درجة مئوية ، تليها 3 دقائق من pipeting المتكررة باستخدام Pipetman 1 مل سيؤدي عموما في أول عملية ناجحة لزرع البذور. من المهم أيضا أن ننتظر حتى يتم تشكيل مستعمرات كبيرة قبل إعادة الطلاء (الشكل 1). بعد زرع البذور الأولى ، Accutase العلاج لم يعد ضروريا ؛ pipeting المتكررة لمدة 3-4 دقائق باستخدام Pipetman 1 مل يكفي لطرد وفصل كتل الخلية لإعادة الطلاء. لا تستخدم أصغر حجم Pipetman والنصائح الدقيقة وتلف الخلايا على نطاق واسع. ويمكن إنشاء خط خلية المنشأ لكل من نسيج الورم معزولة وهذه الخلايا هي التكاثري للغاية ، أعرب بقوة عدة الخلايا الجذعية العصبية ، ويمكن تمييز علامات في كل من أنواع الخلايا العصبية والدبقية. لقد أجرينا مثلي زرع هذه الخلايا في الفئران المناعية للخطر المتلقي التي وضعت في وقت لاحق medulloblastomas الثانوية. هذه الخلايا السرطانية في الثقافة نادرا ما عرضت أو التمايز عفوية موت الخلايا المبرمج ، الميزات التي هي مشتركة بين وسائل الثقافة neurosphere. ويهدف هذا البروتوكول لنشر الناجح للورم الخلايا الجذعية المستمدة من medulloblastomas الأولية ، وبالتالي ، سوف تمكننا من اختبار تأثير الجينات مرشح ومثبطات الكيميائية على القنفذ يحركها نمو الخلايا السرطانية والسلوك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من فاندربيلت ، انجرام السرطان غرانت مركز الدعم (P30 CA068485) ، واستئصال ورم من الدماغ مؤسسة الطفولة والمعاهد الوطنية للصحة (NS042205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | 0.1% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Primaria dishes | Fisher Scientific | 087724C | |
| Sox2 antibody | EMD Millipore | MAB4343 | Mouse, 1:1000 |
| Nestin antibody | DSHB | rat401 | Mouse, 1:200 |
| YFP antibody | Molecular Probes, Life Technologies | A11122 | Rabbit, 1:2000 |
| GFAP antibody | Neuromics | CH22102 | Chicken, 1:1000 |
| Tuj1 antibody | Sigma-Aldrich | T5076 | Mouse, 1:2000 |
| NeuN antibody | EMD Millipore | MAB377 | Mouse, 1:2000 |
| CNPase antibody | EMD Millipore | MAB326 | Mouse, 1:1000 |
References
- Rossi, A., Caracciolo, V., Russo, G. Medulloblastoma: From Molecular Pathology to Therapy. Clin Cancer Res. 14 (4), 971-971 (2008).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. Control of Neuronal Precursor Proliferation in the Cerebellum by Sonic Hedgehog. P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).
- Dahmane, N., Ruiz, A., Altaba, I. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3089 (1999).
- Wallace, V. A. Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum. Curr Biol. 9 (8), 445-445 (1999).
- Fan, X., Eberhart, C. G.
- Yoon, J. W., Gilbertson, R., Iannaccone, S. Defining a Role for Hedgehog Pathway Activation in Desmoplastic Medulloblastoma by Identifying GLI1 Target Genes. International journal of cancer. 124 (1), 109-109 (2009).
- O'Dorisio, M. S., Khanna, G., Bushnell, D. Combining anatomic and molecularly targeted imaging in the diagnosis and surveillance of embryonal tumors of the nervous and endocrine systems in children. Review. Cancer metastasis reviews. 27 (4), 665-665 (2008).
- Corcoran, R. B., Bachar Raveh, T., Barakat, M. T. Insulin-like Growth Factor 2 Is Required for Progression to Advanced Medulloblastoma in patched1 Heterozygous Mice. Cancer research. 68 (21), 8788-8788 (2008).
- Gilbertson, R. J., Ellison, D. W.
- Ward, R. J., Lee, L., Graham, K. Multipotent CD15+ Cancer Stem Cells in Patched-1 Deficient Mouse Medulloblastoma. Cancer research. 69 (11), 4682-4682 (2009).
- Mao, J., Ligon, K. L., Rakhlin, E. Y. A Novel Somatic Mouse Model to Survey Tumorigenic Potential Applied to the Hedgehog Pathway. Cancer research. 66, 10171-10171 (2006).
- Han, Y. G., Kim, H. J., Dlugosz, A. A. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature medicine. 15 (9), 1062-1062 (2009).
