Summary
Ce protocole décrit l'isolement, l'enrichissement et l'entretien des cellules tumorales médulloblastome souches dérivées de souris mutantes avec ectopique Sonic activité de la voie Hedgehog.
Abstract
Les tumeurs cérébrales ont été proposés à posséder une petite population de cellules souches qui sont à l'origine de la tumorigenèse. Dosages Neurosphère ont été généralement adoptée pour étudier la nature des cellules souches neurales, y compris ceux issus de tissus normaux et tumoraux. Cependant, des quantités appréciables de différenciation et mort cellulaire sont communs dans neurosphères culture probablement en raison de sous-optimale état tels que l'accessibilité de toutes les cellules dans les agrégats sphère au milieu de culture.
Médulloblastome, la plus fréquente des tumeurs pédiatriques du SNC, est caractérisé par sa progression rapide et tendance à se propager le long de la totalité du cerveau-rachidien axe avec le résultat clinique lamentable. Le médulloblastome est une tumeur neuro-du cervelet, comptant pour 20% et 40% des tumeurs intracrâniennes et la fosse postérieure dans l'enfance, respectivement 1. Il est maintenant bien établi que la signalisation de Shh stimule la prolifération des précurseurs de neurones du cervelet granules (CGNPs) pendant le développement du cervelet 2-4. De nombreuses études utilisant des modèles de souris, dans lequel la voie Shh est constitutivement activé, ont lié la signalisation de Shh avec médulloblastome 5-9.
Un récent rapport a montré que sous-ensemble de cellules provenant de souris médulloblastome LacZ Patched1 / + sont des cellules souches cancéreuses, qui sont capables d'initier et propogating tumeurs 10. Nous décrivons ici une méthode efficace pour isoler, d'enrichir et de maintenir les cellules souches tumorales dérivées de plusieurs modèles murins de médulloblastome, avec voie Shh constitutivement activé en raison d'une mutation dans Smoothened (11, Héraion mentionné que SmoM2), un RCPG qui est essentiel pour Shh activation de la voie. Dans tous les tissus médulloblastome isolés, nous avons été en mesure d'établir de nombreuses colonies très prolifératives. Ces cellules robuste exprimé plusieurs marqueurs des cellules souches neurales telles que Nestin et Sox2, peuvent subir des passages en série (plus de 20) et ont été clonogénique. Bien que ces cellules souches tumorales en culture ont été relativement faibles, souvent avec des armes nucléaires bipoar élevé par rapport au cytoplasme lorsqu'elles sont cultivées dans des conditions favorisant la croissance des cellules souches, ils radicalement modifié leur morphologie, prolongée de plusieurs processus cellulaires, aplatie et se retire du cycle cellulaire lors de la commutation d'une cellule milieu de culture supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal. Plus important encore, ces cellules souches tumorales différenciées en Tuj1 + ou + NeuN neurones, les astrocytes et GFAP + + CNPase oligodendrocytes, soulignant ainsi leur multi-puissance. En outre, ces cellules ont été capables de propager des médulloblastomes secondaire lorsque orthotopique transplantées chez des souris hôte.
Protocol
1. Micro-dissection de la tumeur portant Cervelet, dissociation du tissu tumoral et placage
- Récupération de tissu tumoral
- Malade médulloblastome chez des souris porteuses sont souvent chétifs, affiché hydrocéphalie et typique des symptômes neurologiques, y compris paralysie des membres postérieurs et l'incapacité à retrouver une posture en cas de retournement. Pour récupérer le tissu tumoral, euthanasier les souris par inhalation de dioxyde de carbone. Il est important de ne pas effectuer dislocation cervicale, une procédure qui génère une pression sur le crâne postérieur et peut compromettre l'intégrité des tissus tumoraux.
- Décapitation est effectuée immédiatement après la mort en utilisant une paire de ciseaux, enlever les poils et les tissus musculaires, autant que possible pour une bonne visualisation du crâne. Nettoyer la surface du crâne avec Kimwipe imbibé d'éthanol à 95%.
- Utilisez des ciseaux pour couper fines une ouverture le long de la ligne médiane du crâne, et éliminer les tissus du crâne avec une pince fine, à quel point l'ensemble du cerveau, y compris porteurs d'une tumeur du cervelet est exposée.
- Alors que les cervelets des adultes sains d'affichage bien définis hémisphères et du vermis, les cervelets de souris porteuses de tumeurs sont souvent élargie, amorphe avec une surface lisse et les vaisseaux sanguins visibles. En utilisant des techniques stériles, extraire la tumeur du cervelet en utilisant une pince à épiler et le lieu de PBS glacé, sans Mg 2 + et Ca 2 +.
- La dissociation du tissu tumoral
- Transférer le tissu tumoral du PBS pour Accutase 50% (dilué dans du PBS), qui est environ 4 fois le volume du tissu tumoral, émincer les tissus avec des ciseaux fins pour 3 minutes à température ambiante, suivie d'une incubation à 37 ° C pendant 4 minutes , après quoi le tissu subit pipetage répétitifs avec un Pipetman de 1 ml pour 3 minutes supplémentaires. Cette méthode devrait donner un mélange de cellules individuelles et de petits agrégats cellulaires.
- Diluer la suspension cellulaire 3 fois avec du PBS et centrifuger pendant 5 minutes à 1000 g pour sédimenter les cellules. Resuspendre la cellule dans l'eau douce moyennes tiges de culture de cellules neurales et plaque granulés sur une parabole de 60 mm gélatinisé Primaria culture de tissus. Nous utilisons des plats Primaria pour la fixation améliorée au plaquage première passages ultérieurs peuvent être étalés sur des boîtes de culture tissulaire régulière.
Remarque: tous les instruments sont stérilisés dans de l'éthanol à 95% avant utilisation.
Remarque: des boîtes de culture Manteau avec 0,1% de gélatine pendant au moins 30 minutes. Préparer une solution fraîche moyennes neuronaux de culture de cellules souches composé de milieu Neurobasal avec de la glutamine, Pen-Strep, N2, B27, EGF humain (25 ng / ml) et FGF basique (25 ng / ml).
2. Enrichissement, entretien et l'expansion des cellules tumorales par des passages en série Médulloblastome
Nous obtenons habituellement de nombreuses colonies après 1 semaine de plaquage initial (figure 1). Ces colonies peuvent être dissociés et sur de nouveaux plats réétalées gélatinisé pour l'enrichissement de la population de cellules tumorales. Premier changement au nouveau milieu de culture, il suffit d'utiliser un Pipetman 1 mL mécaniquement détacher colonies suivie par pipetage répétitifs pendant 4 minutes pour obtenir une suspension cellulaire (pas Accutase nécessaire). Vérifiez sous un microscope pour s'assurer que les mottes à grandes cellules ont été dissociées. Puis passer la suspension cellulaire sur de nouveaux plats gélatinisé pour cultiver plus loin et passer par la même procédure pour les passages supplémentaires. Seules les cellules tumorales, les cellules sanguines et d'autres types cellulaires sont éliminés par série re-placages, laissant les cellules tumorales attachés à développer rapidement. Changer milieu de culture sur le deuxième jour suivant l'ensemencement initial, et chaque jour d'autres par la suite.
3. La coloration par immunofluorescence et examen des cellules cultivées
1. Cultiver des cellules tumorales sur des lamelles de verre
Au jour 1, lamelle de verre placer un dans chacun d'une plaque à 6 puits, puis ajouter 0,1% de gélatine pendant 30 minutes à 37 ° C. Graines d'environ 2-4x 10 5 cellules tumorales par mL. Les cellules devraient attacher la nuit et le milieu des cellules souches neurales changé le jour 3. La coloration est réalisée sur 4 jours.
2 La coloration par immunofluorescence
Retirer milieu de culture et les cellules laver deux fois avec PBS glacé. Fixer les cellules avec des fraîchement faite PFA 4% pendant 15 minutes. Brièvement laver les cellules deux fois avec du PBS et permeablize avec Triton 0,3% (dans du PBS) pendant 5 minutes. Brièvement laver les cellules deux fois avec du PBS et de bloquer avec du sérum de chèvre 10% pendant 40 minutes. Incuber les cellules avec l'anticorps primaire pendant 90 minutes, puis lavez les cellules trois fois avec PBS, pendant 5 minutes chacune. Incuber les cellules avec un anticorps secondaire pendant 60 minutes, puis laver trois fois avec du PBS, 5 minutes chacun. Mont lamelles sur des lames avec 5 ml d'un milieu aqueux de montage et d'effectuer la microscopie confocale.
4. La différenciation des cellules tumorales
Retirer neurones moyennes de cellules souches et brièvement laver les cellules avec du PBS deux fois. Ajouter milieu de différenciation sur le jour 1, le changement moyen au jour 4 et déterminer le niveau de différenciation par immunofluorescence au jour 7. Le milieu de différenciation consiste DMEM, Pen-Strep et 10% de sérum fœtal bovin.
5. Les résultats représentatifs
Morphologie des résultats
Après le traitement Accutase et doux pipetage répétitifs, le tissu tumoral devrait être principalement dissocié en petits agrégats cellulaires et des cellules individuelles. Beaucoup de colonies considérables peuvent être observés dès 5 jours après l'étalement initial, comme le montre la figure 1. Cellules tumorales fortement prolifératives sont souvent bi-polaire avec un ratio nucléaire / cytoplasmique élevé. Ces cellules sont généralement vus rayonnant à partir de petits agrégats cellulaires attachés à la surface gélatinisé. Les cellules sanguines, petites et rondes, sont généralement enlevés par les changements de supports suivants et les placages de série. Après plusieurs passages, on peut observer uniformément répartie, prolifératif Ki67 + cellules tumorales et la contamination peu avec d'autres types cellulaires (figure 2).
Expression des marqueurs des cellules souches neurales, analyse clonale et différenciation en multiples lignées
Afin de déterminer si les cellules proliférantes dérivées de dissocier caractéristiques de la tumeur du cervelet montrent tissu de cellules souches tumorales, nous avons effectué une caractérisation plus poussée par l'expression du marqueur de cellules souches, l'analyse clonale et la puissance de différenciation. Nous avons constaté que ces cellules tumorales isolées très explicite marqueurs des cellules souches neurales telles que Sox2 et nestine (figure 3). Comme nous l'avons récupéré à partir des tissus tumoraux SmoM2-YFP, toutes les cellules tumorales expriment YFP. Conformément à une récente étude indiquant que les cils primaires sont importants pour le développement de la voie Shh-dépendant médulloblastome 12, SmoM2-YFP d'expression a été clairement localisé les cils des cellules tumorales Sox2 + (figure 3). Lorsque la densité plaquées à clonale de 300 cellules par mL de milieu de culture, nous avons observé l'expansion clonale d'une cellule tumorale unique d'une colonie importante (figure 4). En outre, ces cellules ont été capables de se différencier en divers types de cellules neuronales et gliales lorsqu'elles sont cultivées dans des conditions pro-différenciation (figure 5).
Figure 1. Morphologie d'une colonie hautement proliférative après le placage d'abord des tissus médulloblastome dissociées. Généralement, une colonie importante des formes dans les 5 jours après l'ensemencement initial de tissu tumoral dissocié, et un représentant est illustré ici dans le champ lumineux. Bi-polaire, rayonnent des cellules allongées d'un agrégat de cellules noyau dense. Attaché aux cellules tumorales sont petites, rondes globules rouges, qui sont progressivement épuisés par placages de série.
Figure 2. Morphologie des cellules de médulloblastome établis au delà de trois passages. Cette image en champ clair montre l'aspect typique des cellules de médulloblastome établie après plusieurs passages. Les cellules restent essentiellement bi-polaire de haute nucléaire / cytoplasmique ratio. Nous montrons coloration tubuline acétylée de cellules tumorales, dont la plupart sont le vélo, comme indiqué par une forte Ki67 expression.
Figure 3. Cellules de médulloblastome Fondée expresse marqueurs des cellules souches neurales. SmoM2-YFP marques cellules exprimant constitutivement active Smo, donc activité de la voie Shh. Toutes les cellules des lignées cellulaires établies médulloblastome exprimé YFP, et la plupart d'entre eux co-exprimé des niveaux élevés de différents marqueurs des cellules souches neurales, tels que la nestine et Sox2. Fait intéressant, lorsque nous avons effectué la détection du signal YFP avec la puissance laser minimale pendant la microscopie confocale, nous avons détecté le signal YFP concentrés dans les cils des cellules + Sox2. Cette observation est cohérente avec un rapport récent que 12 décrit le rôle essentiel des cils dans le développement de la voie Shh-dépendant médulloblastome.
Figure 4. Fondée cellules tumorales subissent une expansion clonale. Après dissociation en suspension cellulaire unique, les cellules tumorales ont été étalées sur une plaque de 24 puits-à une densité clonale de 300 cellules par ml de milieu de culture. Dans chaque puits, nous avons observé des colonies par clonage élargi. Cette série d'images en champ clair démontrer les changements typiques sur une période de 10 jours de culture.
Figure 5. Analyses de différenciation des cellules de médulloblastome établie. Lorsque les cellules tumorales sont passés du FEM / bFGF contenant un milieu sans sérum à DMEM/10% de FBS, YFP + cellules tumorales sensiblement modifié leur morphology et différencié dans différents types cellulaires, y compris Tuj1 + ou + NeuN neurones, les cellules GFAP + astrogliales ou CNPase + oligodendrocytes.
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Discussion
Nous décrivons une façon efficace d'isoler, d'enrichir et de maintenir les cellules souches du tissu médulloblastome tumeur primaire récupérées à partir des souris mutantes avec constitutivement active de signalisation Hedgehog. Nous avons constaté qu'un étape critique dans la réussite d'un lignée tumorale des cellules souches saines est le traitement utilisé pendant Accutase la dissociation du tissu tumoral primaire. Dans notre expérience, lors de la première tissu tumoral dissociant du cervelet, 4 minutes de traitement Accutase 50% à 37 ° C, suivi de 3 minutes de pipetage répétitifs utilisant un Pipetman 1-ml se traduit généralement par ensemencement premier succès. Il est également important d'attendre que les colonies de taille sont formés avant de re-placage (figure 1). Après les premiers semis, le traitement Accutase n'est plus nécessaire; pipetage répétitifs pendant 3-4 minutes en utilisant un Pipetman de 1 ml est suffisant pour déloger et se dissocient des bouquets de cellules pour re-placage. Ne pas utiliser Pipetman plus petit volume que les conseils seront plus fines endommager les cellules en profondeur. Une lignée cellulaire établie peuvent être générés à partir de chaque tissu tumoral isolé et ces cellules sont hautement proliférative, robuste exprimer plusieurs marqueurs des cellules souches neurales et peuvent se différencier en deux types de cellules neuronales et gliales. Nous avons effectué la transplantation orthotopique de ces cellules dans des souris immunodéficientes bénéficiaires qui par la suite développés médulloblastomes secondaire. Ces cellules tumorales en culture rarement exposées différenciation spontanée ou apoptose, caractéristiques qui sont communes aux méthodes de culture Neurosphère. Ce protocole est conçu pour la propagation réussie de cellules souches tumorales dérivées de médulloblastomes primaire et donc, va nous permettre de tester les effets des gènes candidats et des inhibiteurs chimiques sur Hérisson axée croissance des cellules tumorales et leur comportement.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par des subventions du Vanderbilt-Ingram Cancer Center Grant Support (P30 CA068485), la Fondation des tumeurs cérébrales enfance et les National Institutes of Health (NS042205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | 0.1% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Primaria dishes | Fisher Scientific | 087724C | |
| Sox2 antibody | EMD Millipore | MAB4343 | Mouse, 1:1000 |
| Nestin antibody | DSHB | rat401 | Mouse, 1:200 |
| YFP antibody | Molecular Probes, Life Technologies | A11122 | Rabbit, 1:2000 |
| GFAP antibody | Neuromics | CH22102 | Chicken, 1:1000 |
| Tuj1 antibody | Sigma-Aldrich | T5076 | Mouse, 1:2000 |
| NeuN antibody | EMD Millipore | MAB377 | Mouse, 1:2000 |
| CNPase antibody | EMD Millipore | MAB326 | Mouse, 1:1000 |
References
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