Summary
Bu protokol, izolasyon, zenginleştirme, ektopik Sonic hedgehog yolu aktivite ile mutant farelerde elde edilen medulloblastom tümör kök hücreler bakım ve açıklar.
Abstract
Beyin tümörleri Tümörgenez kök neden olan kök hücreler küçük bir nüfusa sahip öne sürülmüştür. Neurosphere testleri genellikle normal ve tümöral dokuların elde edilenler dahil olmak üzere nöral kök hücreler, doğayı incelemek için kabul edilmiştir. Ancak, kayda değer miktarda farklılaşması ve hücre ölümüne kürenin agrega içinde tüm hücrelerin kültür ortamı erişilebilirlik gibi sub-optimal durum muhtemelen nedeniyle kültür neurospheres yaygındır.
Medulloblastom, en sık görülen pediatrik merkezi sinir sistemi tümörü, hızlı ilerlemesi ve kasvetli klinik sonuç ile tüm beyin-omurilik ekseni boyunca yayılma eğilimi ile karakterize. Medulloblastom 1 sırasıyla% 20 ve% 40, çocukluk çağında intrakranial ve posterior fossa tümörü için muhasebe, beyinciğin bir nöroepitelyal tümör . Şimdi iyi Shh sinyalizasyon serebellar gelişim 2-4 sırasında serebellar granül nöron öncüleri (CGNPs) yayılması uyarır kurulmuştur. Çeşitli çalışmalar, Shh yolu yapısal olarak aktif olan fare modelleri kullanarak medulloblastom 5-9 Shh sinyalizasyon bağlantılı.
Yeni bir rapor Patched1 LacZ / + fareler türetilen medulloblastom hücrelerinin tümörleri 10 başlatılması ve propogating yeteneğine kanser kök hücreleri, bir alt kümesi olduğunu göstermiştir. Burada Smoothened içinde bir mutasyon (11 hereon SmoM2 olarak anılacaktır), Shh için kritik bir GPCR nedeniyle yapısal olarak aktive Shh yolağı, medulloblastom birkaç fare modelleri türetilmiş tümör kök hücreleri izole zenginleştirmek ve korumak için etkili bir yöntem tarif yolağı aktivasyonu. Her izole medulloblastom dokusu, çok sayıda yüksek proliferatif koloniler kurmayı başardık. Bu hücreler, sağlam Nestin ve Sox2 gibi çeşitli sinir kök hücre belirteçleri ifade seri pasajlar tabi (20'den fazla) ve clonogenic edildi. Bu kültür tümör kök hücreler, kök hücre büyüme lehine koşullar altında kültüre sitoplazmik oranı yüksek nükleer ile sık sık bipoar nispeten küçük iken, bu ölçüde, kendi morfolojisi değiştirdi birden fazla hücre sürecinin genişletilmiş, basık ve bir hücreye geçiş üzerine hücre döngüsü çekildi kültür ortamı,% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiştir. Daha da önemlisi, bu tümör kök hücreler Tuj1 ayrılabilir + veya Neun + nöronlar, GFAP + astrositler ve CNPase + oligodendrosit, böylece onların çok potens vurgulayarak. Ayrıca, bu hücreler orthotopically ana farelere nakledilen zaman ikincil medülloblastomlar yayma yeteneğine sahip.
Protocol
1. Tümör taşıyan Serebellum Mikro-disseksiyon, Tümör Doku ve Kaplama, Ayrılma
- Tümör dokusu alımı
- Hasta fareler taşıyan medulloblastom genellikle runted, hidrosefali ve posterior felç ve devrik zaman duruş yeniden yetmezliği de dahil olmak üzere tipik bir nörolojik semptomlar görüntülenir. Tümör dokusu almak için, karbon dioksit Solunduğunda fareler euthanize. Servikal dislokasyon, posterior kafatasına basınç oluşturur ve tümör dokusu bütünlüğünü tehlikeye düşürebilecek bir işlem gerçekleştirmek için önemlidir.
- Decapitation kafatası iyi bir görünüm için saç ve kas dokusu mümkün olduğunca ortadan kaldırarak, bir makas kullanarak ölümünden sonra hemen yapılır. Kafatası yüzeyi,% 95 etanol ile ıslatılmış Kimwipe ile temizleyin.
- Ince makas, kafatasının orta hat boyunca bir açılış kesmek ve kafatası doku tümör taşıyan serebellum da dahil olmak üzere tüm beyin maruz kalmaktadır, bu noktada ince cımbız kullanarak kaldırmak için kullanın.
- Sağlıklı yetişkinlerin cerebella iyi tanımlanmış hemisferlerin ve vermis görüntüler, Tümör taşıyan farelere cerebella genellikle düz bir yüzey ve göze çarpan kan damarları ile amorf, büyümüş. Steril teknikleri kullanarak, serebellar tümör Mg2 olmadan buz gibi soğuk PBS cımbız kullanarak ve yer almak + ve Ca 2 +.
Not: tüm araçları kullanmadan önce% 95 etanol sterilize edilir. - Tümör dokusu Fototerapisi
- 4 dakika boyunca oda sıcaklığında 3 dakika 37 inkübasyon tarafından ince makas, ° C ile doku kıyma, PBS den 4 kez tümör dokusu hacmi yaklaşık% 50 Accutase (PBS içinde seyreltilmesi) tümör dokusu transferi sonra doku ek 3 dakika için 1 ml Pipetman tekrarlayan pipeting uğrar. Bu yöntem, tek hücre ve küçük hücresel agrega karışımı boyun eğmek zorundadır.
- 1000 gr az 5 dakika pelet hücreleri hücresel süspansiyon PBS ile 3 kat ve santrifüj sulandırınız. Jelatinize 60 mm primaria doku kültürü çanak üzerine taze sinir kök hücre kültür ortamı ve plaka hücre pelletini tekrar. Biz ilk kaplama gelişmiş eklenti primaria yemekleri kullanır; sonraki geçişleri normal doku kültürü yemekleri üzerine kaplama olabilir.
Not: en az 30 dakika süreyle% 0,1 jelatin ile Kat kültür yemekleri. Glutamin, Pen-Strep, N2, B27, insan EGF (25 ng / ml) ve temel FGF (25ng / ml) ile Neurobasal orta oluşan taze sinir kök hücre kültür ortamı hazırlayın.
2. Zenginleştirme, Bakım ve Seri Yolculukları Medulloblastom Tümör Hücreleri genişletilmesi
Biz genellikle ilk kaplama (Şekil 1) 1 hafta sonra birçok koloniler. Bu koloniler, ayrışmış ve tümör hücre popülasyonunu zenginleşmesi için yeni jelatinize yemekleri üzerine replated olabilir. Yeni bir kültür ortamına ilk değişiklik, o zaman sadece mekanik bir hücresel süspansiyon (Accutase gerekli) verim, 4 dakika boyunca tekrarlayan pipeting takip koloniler ayırmak için 1 ml Pipetman kullanabilirsiniz. Büyük hücre kümeleri ayrışmış sahip olmasını sağlamak için bir mikroskop altında kontrol edin. Sonra daha fazla kültür için yeni jelatinize yemekler üzerine hücre süspansiyonu dağıtır ve ek geçişleri için aynı prosedürü geçmesi. Ekli olmayan tümör hücreleri, kan hücreleri ve diğer hücre tipleri, bağlı tümör hücreleri hızla genişletmek için bırakarak, yeniden kaplamalar seri kaldırılır. Kültürün ilk tohumlama izleyen ikinci gününde, orta ve bundan sonra her gün değiştirin.
3. Doku ve Hücre Immunofluorescent Boyama ve Sınav
1. Cam lamelleri tümör hücrelerinin büyümesini
1. gün, 6-plaka her yer bir cam lamel, daha sonra 30 dakika boyunca 37 ° jelatin% 0.1 ° C ML başına Tohum yaklaşık 2-4X 10 5 tümör hücreleri. Hücreler gecede eklemek gerekir ve sinir kök hücre orta 3. günde değişti. Boyama, 4. günde yapılır.
2 Immunofluorescent boyama
Buz gibi soğuk PBS ile iki kez kültür ortamı ve yıkama hücreleri çıkarın. 15 dakika boyunca taze hazırlanmış% 4 PFA hücreleri saptamak. Kısaca PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve 5 dakika boyunca% 0.3 Triton (PBS) ile permeablize. Kısaca hücreler PBS ve blok ile iki kez 40 dakika boyunca% 10 keçi serumu ile yıkayın. Hücreleri için primer antikor ile 90 dakika inkübe edin, sonra her biri için 5 dakika PBS ile hücreler üç kez yıkayın. Hücreleri için ikincil antikor ile 60 dakika inkübe edin, her biri 5 dakika sonra, PBS ile üç defa yıkamak. 5 ml sulu bir montaj orta Slaytlarınıza lamelleri Dağı ve konfokal mikroskobi gerçekleştirmek.
4. Tümör Hücreleri farklılaşma
N çıkarıneural kök hücre orta ve kısaca hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Farklılaşması orta 1 gün, günde 4 orta değiştirmek ve 7 gün immünofloresan boyama farklılaşma düzeyini belirlemek. Farklılaşması orta DMEM, Kalem-Strep ve% 10 fetal sığır serumu oluşur.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Morfoloji sonuçları
Accutase tedavi ve nazik tekrarlayan pipeting sonra, tümör dokusu küçük hücresel agrega ve tek hücre içine çoğunlukla ayrışmış olmalıdır. Birçok büyük kolonileri Şekil 1'de gösterildiği gibi, 5 gün sonra ilk kaplama gibi erken bir zamanda görülebilir. Yüksek proliferatif tümör hücreleri genellikle yüksek çekirdek / sitoplazma oranı ile bi-polar. Bu hücreler genellikle jelatinize yüzeye bağlı küçük hücresel agrega yayılan görülür. Kan hücreleri, küçük ve yuvarlak, genellikle sonraki ortam değişiklikleri ve seri kaplamalar kaldırılabilir. Çok ayetle sonra, bir gözlemleyebilirsiniz düzgün yayılı, proliferatif Ki67 + tümör hücreleri ve diğer hücre tipleri (Şekil 2) çok az kontaminasyon.
Sinir kök hücre belirteçleri, klonal analiz ve birden fazla soy içine farklılaşma Açıklanması
Proliferatif hücreler, tümör kök hücrelerinin ayrışmış serebellar tümör dokusu özelliklerini gösterdikleri türetilmiş olup olmadığını belirlemek için, kök hücre işaretleyici ifade, klonal analiz ve farklılaşma potens ileri karakterizasyonu yapıldı. Biz bu izole tümör hücreleri son derece sinir kök hücre belirteçleri Sox2 ve Nestin (Şekil 3) olarak ifade ettikleri bulundu. SmoM2 YFP tümör dokuları alınan tüm tümör hücrelerinin ifade YFP. Birincil kirpikler raporlama son çalışma ile tutarlı Shh yolağı bağımlı medulloblastom 12, SmoM2-YFP ifadesi açıkça Sox2 silya + tümör hücreleri (Şekil 3) lokalize gelişimi için önemlidir. Başına 300 ml kültür ortamı hücrelerinin klonal yoğunlukta kaplama, biz tek bir tümör hücresi oldukça büyük bir koloni (Şekil 4) klonal genişleme görülmektedir. Ayrıca, bu hücreler yanlısı farklılaşma koşullar altında (Şekil 5) kültüre çeşitli nöronal ve glial hücre tipleri ayırt etmek mümkün.
Şekil 1. Ayrışmış medulloblastom doku ilk kaplama sonra yüksek proliferatif koloni morfolojisi. Genel olarak, parlak bir alan içinde oldukça büyük bir koloni formları, 5 ayrışmış tümör dokusunun ilk tohumlama gün sonra ve bir temsilcisi olarak burada gösterilmiştir. Bi-polar, uzamış yoğun bir çekirdek hücrenin toplam hücreleri yayar. Seri kaplamalar yavaş yavaş tükenmiş küçük, yuvarlak, kırmızı kan hücreleri, tümör hücrelerinin tutunmuştur.
Şekil 2. Üç geçişleri dışında kurulan medulloblastom hücrelerinin morfolojisi. Bu parlak alan görüntü çok ayetle sonra kurulan medulloblastom hücrelerinin tipik görünümü gösterir. Hücreleri çok yüksek sitoplazmik / nükleer oranı ile bi-polar kalır. Biz tümör hücrelerinin asetillenmiş tubulin boyama, en güçlü Ki67 ifade tarafından gösterildiği gibi bisiklet vardır.
Şekil 3. Kurulan medulloblastom hücreleri sinir kök hücre işaretleri ifade eder. SmoM2 YFP ifade hücreleri yapısal olarak aktif Smo, dolayısıyla Shh yolağı faaliyet işaretler. Kurulan medulloblastom hücre hatları tüm hücreler YFP ifade ve çoğu Nestin ve Sox2 gibi çeşitli sinir kök hücre belirteçleri, yüksek düzeyde ortak dile getirdi. İlginçtir ki, biz konfokal mikroskopi sırasında en az lazer gücü ile YFP sinyal algılama yapıldığında, Sox2 + hücrelerin silya konsantre YFP sinyal tespit edildi. Bu gözlem, Shh yolağı bağımlı medulloblastom gelişimi kirpikler temel rol açıklanan son raporunda 12 ile tutarlıdır .
Şekil 4. Kurulan tümör hücrelerinin klonal genişleme uğrarlar. Disosiasyon sonra tek bir hücre süspansiyonu içine, tümör hücrelerinin klonal bir kültür ortamı ml başına 300 hücre yoğunluğu az 24 iyi plaka üzerine kaplanmıştır. Her bir kuyunun klonal genişletilmiş koloniler gözlemledi. Bu dizi parlak bir alan görüntüler 10 günlük süre içinde bir kültür tipik değişiklikleri göstermektedir.
Şekil 5. Farklılaşma kurulan medulloblastom hücrelerinin analiz eder. Tümör hücrelerinin EGF / bFGF DMEM/10% FBS, YFP + tümör hücrelerinin kendi morfolojisi önemli ölçüde değişmiş ve çeşitli hücre tipleri, inc ayrılabilir serum orta içeren geçişTuj1 luding + veya Neun + nöronlar, GFAP + Astroglial hücreleri veya CNPase + oligodendrosit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medulloblastom kök hücreleri yapısal olarak aktif Kirpi sinyalizasyon ile mutant farelerde alınan birincil tümör dokusundan izole zenginleştirmek ve korumak için etkili bir şekilde açıklar. Biz, başarılı, sağlıklı bir tümör kök hücre hattı kurulması bir kritik adım birincil tümör dokusu disosiasyon sırasında kullanılan Accutase bir tedavi olduğunu bulundu. Bizim tecrübelerimize göre, beyincik ilk dissociating tümör dokusu, 4 dakika 37% 50 Accutase tedavi ° C, 1 ml Pipetman kullanarak genellikle başarılı ilk tohumlamada tekrarlayan pipeting 3 dakika izledi. Yeniden kaplama (Şekil 1) büyük kolonileri önce oluşana kadar beklemek de önemlidir. Ilk tohumlama sonra, Accutase tedavi artık gerekli değildir; 1 ml Pipetman kullanarak 3-4 dakika boyunca tekrarlayan pipeting yeniden kaplama için hücre kümeleri yerinden ayırmak yeterli. Ince ipuçları yoğun hücrelere zarar verir gibi daha küçük hacimli Pipetman kullanmayın. Kurulmuş bir hücre hattı izole her tümör dokusu oluşturulur ve bu hücreler yüksek proliferatif olabilir, sağlam birkaç sinir kök hücre belirteçleri ifade etme ve hem de nöronal ve glial hücre tipleri ayırt edebilirsiniz. Biz sonradan ikincil medülloblastomlar geliştirilen immün yetmezlikli alıcı fareler, bu hücrelerin ortotopik nakli gerçekleştirdik. Bu kültür tümör hücrelerini nadiren kendiliğinden farklılaşma ya da apoptoz, neurosphere kültür yöntemleri için ortak özellikleri sergiledi. Bu protokol, tümör kök hücre birincil medülloblastomlar elde edilen başarılı bir şekilde yayılması için tasarlanmıştır ve bu nedenle, bize Kirpi odaklı tümör hücre büyümesi ve davranış aday genler ve kimyasal inhibitörlerinin etkisini test etmek sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışmada, Vanderbilt-Ingram Kanser Merkezi Destek Hibe (P30 CA068485), Çocukluk Çağı Beyin Tümörü Vakfı ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NS042205) hibe ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | 0.1% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Primaria dishes | Fisher Scientific | 087724C | |
| Sox2 antibody | EMD Millipore | MAB4343 | Mouse, 1:1000 |
| Nestin antibody | DSHB | rat401 | Mouse, 1:200 |
| YFP antibody | Molecular Probes, Life Technologies | A11122 | Rabbit, 1:2000 |
| GFAP antibody | Neuromics | CH22102 | Chicken, 1:1000 |
| Tuj1 antibody | Sigma-Aldrich | T5076 | Mouse, 1:2000 |
| NeuN antibody | EMD Millipore | MAB377 | Mouse, 1:2000 |
| CNPase antibody | EMD Millipore | MAB326 | Mouse, 1:1000 |
References
- Rossi, A., Caracciolo, V., Russo, G. Medulloblastoma: From Molecular Pathology to Therapy. Clin Cancer Res. 14 (4), 971-971 (2008).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. Control of Neuronal Precursor Proliferation in the Cerebellum by Sonic Hedgehog. P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).
- Dahmane, N., Ruiz, A., Altaba, I. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3089 (1999).
- Wallace, V. A. Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum. Curr Biol. 9 (8), 445-445 (1999).
- Fan, X., Eberhart, C. G.
- Yoon, J. W., Gilbertson, R., Iannaccone, S. Defining a Role for Hedgehog Pathway Activation in Desmoplastic Medulloblastoma by Identifying GLI1 Target Genes. International journal of cancer. 124 (1), 109-109 (2009).
- O'Dorisio, M. S., Khanna, G., Bushnell, D. Combining anatomic and molecularly targeted imaging in the diagnosis and surveillance of embryonal tumors of the nervous and endocrine systems in children. Review. Cancer metastasis reviews. 27 (4), 665-665 (2008).
- Corcoran, R. B., Bachar Raveh, T., Barakat, M. T. Insulin-like Growth Factor 2 Is Required for Progression to Advanced Medulloblastoma in patched1 Heterozygous Mice. Cancer research. 68 (21), 8788-8788 (2008).
- Gilbertson, R. J., Ellison, D. W.
- Ward, R. J., Lee, L., Graham, K. Multipotent CD15+ Cancer Stem Cells in Patched-1 Deficient Mouse Medulloblastoma. Cancer research. 69 (11), 4682-4682 (2009).
- Mao, J., Ligon, K. L., Rakhlin, E. Y. A Novel Somatic Mouse Model to Survey Tumorigenic Potential Applied to the Hedgehog Pathway. Cancer research. 66, 10171-10171 (2006).
- Han, Y. G., Kim, H. J., Dlugosz, A. A. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature medicine. 15 (9), 1062-1062 (2009).
