Summary
בעקבות חשיפה לאנטיגן, מופעל subpopulations של תאים B עוברים תהליך הידוע בשם רקומבינציה לעבור מחלקה (CSR) כדי לייצר נוגדנים isotypes עם מפעיל פונקציות שונות. פרוטוקול המתוארים בדוח זה מסביר כיצד CSR יכול להיגרם ונותחו
Abstract
חסינות הלחות היא ענף של המערכת החיסונית ומתוחזק על ידי תאים B ו מתווכת באמצעות הפרשה של נוגדנים. עם הפעלת תא B, מוקד אימונוגלובולינים עוברת סדרה של שינויים גנטיים כדי לשנות את קיבולת מחייב מפעיל פונקציה של נוגדנים מופרשים. תהליך זה מודגש על ידי אירוע רקומבינציה גנטי המכונה רקומבינציה בכיתה מתג (CSR) שבו IgM מחדל אלוטיפ נוגדן הוא החליף את אחד IgG, IgA או IgE. אלוטיפ כל בעל פונקציות שונות ובכך מפעיל אחריות חברתית חיונית לשמירה על חסינות.
גיוון של מוקד אימונוגלובולינים מתווכת על ידי דאמינז הפעלה-Induced cytidine אנזים (AID). וידאו סכמטי המתאר את התהליך בפירוט זמינה באופן מקוון (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). פעילות של סיוע מסלול CSR נלמדים בדרך כלל הערכה של תפקוד התא B ו חסינות הלחות בעכברים. פרוטוקול המתוארים בדוח זה מציג שיטה של בידוד תא B מ spleens Murine וגירוי לאחר מכן עם lipopolysaccharide חיידקי (LPS) כדי לגרום מעמד מעבר IgG3 (עבור isotypes נוגדנים אחרים ראו טבלה 1). בנוסף, מכתים פלורסנט התא לצבוע Carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) משמש כדי לפקח על חלוקת התא של תאים מגורה, תהליך חיוני אלוטיפ מיתוג 1, 2.
הסדרת הסיוע את המנגנון שבאמצעותו CSR מתרחשת עדיין אינם ברורים ולכן בבורר מבחני חוץ גופית בכיתה לספק שיטה אמינה לבדיקת תהליכים אלה במודלים של עכברים שונים. מבחני אלו שימשו בעבר בהקשר של חוסר גנטי באמצעות עכברים knockout 3. יתר על כן, במבחנה מיתוג של תאים B יכול להיות קדמו התמרה ויראלית לווסת ביטוי גנים על ידי מציאה RNA או ביטוי transgene 4-6. נתונים אלו סוגים של ניסויים השפיעו ההבנה שלנו של פעילות AID, ברזולוציה של התגובה CSR, ואת הנוגדנים בתיווך חסינות העכבר.
Protocol
שלב I: בידוד של תאים B הטחול באמצעות העשרה מגנטי
- עכברי הניסוי צריך להיות בגיל 8-12 שבועות כדי להבטיח הבשלה מלאה של המערכת החיסונית.
- להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם ומשרים אתנול 70%. ניתוח להסרת הטחול על ידי ביצוע חתך דרך העור והשריר של hypochondrium השמאלי של הבטן וחתכו אותה לשלושה חלקים גדולים פוספט בופר סליין (PBS). ודאו כי כל כלי ריאגנטים הם עקרים.
- שימוש בסוף גומי של 1 מ"ל במזרק הבוכנה, ומועכים בעדינות את הטחול דרך מסננת לתוך תא 70 מיקרומטר PBS. הקפד להשתמש תנועה דוחפים ולא בתנועה כמו שחיקה שחיקה עלול להוביל לקרע של (כלומר ריבוי) תאים גדולים יותר.
- ספין למטה התאים בבית גרם לא יותר מ 350 במשך 5 דקות ו resuspend גלולה ב PBS. ספירת התאים resuspended באמצעות hemocytometer.
- הכן השעיה של 1x10 8 תאים / מ"ל PBS עם נסיוב 5% חולדה נורמלית צינור פוליסטירן סטרילי 5 מ"ל עם מכסה (בנפח מרבי של 2 מ"ל לכל צינור).
- הוסף 50 μL של עכבר EasySep שלילי לבחירה קוקטייל B העשרה תא עבור כל מ"ל של תאים. פיפטה את התערובת, מכסה את הצינורות, ומניחים במקרר למשך 15 דקות.
- הוספת 100 קוקטייל μL EasySep ביוטין לבחירה עבור כל מ"ל של תאים. פיפטה את התערובת, מכסה את הצינורות, ומניחים במקרר למשך 15 דקות.
- הוספת 100 μL של חלקיקים מגנטיים EasySep (להבטיח חלקיקים מעורבבים היטב הפתרון הוא הומוגני) עבור כל מ"ל של תאים. פיפטה את התערובת, מכסה את הצינורות, ומניחים במקרר למשך 5 דקות.
- פתרון למעלה כדי 2.5mL עם PBS ומניחים מגנט EasySep במשך 5 דקות. היפוך המגנט ואת הצינורית ויוצקים במהירות לתוך צינור פוליסטירן חדש. אין לטלטל את הצינור כפי התאים שנבחרו באופן שלילי יהיה מחויב מגנטית על הקירות צינור.
- כדי להגביר עוד יותר את הטוהר של השעיה התא, הצינור יכול להיות לרחם לאבן שואבת עבור 5 דקות נוספות ושפך לתוך צינור חדש. זה עשוי להפחית את התאוששות התא הכולל.
- תא טוהר B ניתן להעריך על ידי ניתוח תזרים cytometric סמנים של משטח B התא. בעקבות העשרה, אנחנו בעקביות לראות טוהר> 95% תאים חיוביים B220.
שלב II: תא מכתים CFSE
- Resuspend בתאים מבודדים PBS חם בתוספת בסרום שור 0.1% אלבומין בריכוז הסופי של 1 x 10 6 תאים לכל מ"ל.
- הכן פתרון מניות 5mm של CFSE (בדילול מלא sulfoxide דימתיל סטרילי) ולהוסיף 2μL עבור מ"ל כל התאים בצינור. הריכוז הסופי של 10μM הוא אופטימלי עבור מכתים של תאים B העיקרי.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בחושך (הערה: CFSE אור רגישים צריכים להיות כל הזמן בחושך כאשר הדבר אפשרי).
- להרוות את הכתם על ידי הוספת נפח שווה של נסיוב עגל שור לתאים שלך דוגרים על הקרח במשך 5 דקות.
- לשטוף את התאים על ידי ציפוי את צינורות עם המדיום תרבות (ראה שלב III למתכון) ו centrifuging ב 350 גרם שים לב, לפחות 5 פעמים המקבילה נפח התקשורת יש להוסיף כדי לנטרל את הצמיגות של נסיוב עגל שור ועל התאים לייצר גלולה.
- לשטוף את התאים עוד פעמיים במדיום תרבות. התאים מוכנים כעת לגירוי.
שלב III: גירוי נייד עם LPS
- הכן שלך בינוני במבחנה B תרבית תאים על ידי משלים RPMI 1640 עם 10% נסיוב עגל עוברית 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol /.
- הכן בינוני הגירוי שלך על ידי הוספת LPS בריכוז הסופי של 50μg/mL. 125 Aliquot μL של המדיום גירוי לבאר כל תחתית שטוחה 96-היטב בתרבות צלחת רקמות.
- הכן תאים CFSE מוכתם שלך B במדיום תרבות ללא LPS בריכוז סופי של 3.2 x 10 6 תאים / מ"ל. הוספת 125 μL של ההשעיה התא המכיל את הבארות בינוני הגירוי שלך ומערבבים ידי pipetting בעדינות.
- גם עכשיו כל מכיל 4 x 10 5 תאים ריכוז LPS הסופי של 25 מיקרוגרם / מ"ל. זה מספק רמות אופטימליות של התפשטות תאים ומיתוג מעמד, למרות שינויים בערכים אלה עשויים להיות הרצוי.
- דגירה התאים ב 37 ° C ו 5% CO 2 עבור 72-96 שעות. לאחר 48 שעות, אשכולות גדולים של תאים B מתרבים יהיה לעין תחת מיקרוסקופ.
שלב IV: ניתוח תזרים cytometric של מיתוג בכיתה
- כאשר אתה מוכן להסתכל מעבר בכיתה, להסיר את התאים מן התנאים תרבותם לשטוף אותם פעמיים מ"ל 1 של חיץ מכתים (PBS עם 2% שור עגל נסיוב).
- כדי למנוע אי - נוגדן ספציפי מכתים של תאים שלך, גלולה התאים על ידי ספינינג אותם ב 350 גרם ו incubate אותם 100μL של מכתים חיץ עם נסיוב 5% עכבר רגיל 1μg של FcBlock per106 התאים במשך 15 דקות על הקרח. חסימת Cell צריכה להתבצע על הקרח.
- ללא כביסה התאים, להוסיף 1μg לכל 10 6 תאים של נוגדן מתויג fluorescently אנטי עכבר IgG3 ולאפשר לתאים כתם במשך 30 דקות על הקרח.
- לשטוף את התאים פעמיים על ידי צנטריפוגה ו resuspend ב μL 200-300 של חיץ מכתים. התאים מוכנים כעת להערכה על ידי cytometry הזרימה.
- CFSE הוא מתרגש בצורה אופטימלית ב 492 ננומטר (על ידי ארגון יון לייזר) ופולט ב 517 ננומטר. ספקטרום עירור ופליטה של הנוגדן IgG3 תלויה צבע פלואורסצנטי המצומד שלה.
נציג תוצאות
בעקבות העשרה מגנטי, על השעיית התא אמור להיראות אוכלוסייה הומוגנית של נבדל תאים עגולים קטנים (איור 1 א). לאחר 48-72 שעות של גירוי, אשכולות של תאים בודדים מתרבים מוגדל יהיה נראה בבירור (איור 1B). חלק גדול של תאים שאינם מתרבים יופיעו קטנים פרטנית כפי שהם עוברים אפופטוזיס.
אחריות חברתית בדרך כלל, ניתן להבחין ברמות הגבוהות ביותר בין 72 ו - 96 שעות לאחר גירוי לפני רוב התאים מתחילים למות 7. בשלב זה, התאים צריכים עבר מספר חלוקות תא עם תאים החליף המופיעים האוכלוסייה בתו לאחר מכן התא. תזרים נציג העלילה cytometric של דילול CFSE וביטוי פני השטח של IgG3 לאחר 96 שעות של גירוי LPS ניתן לראות באיור 2.
טבלה 1. אלוטיפ מיתוג קוקטיילים. הערה: ריכוז הערכים ממריצות הן המלצות בלבד. Titrations עשוי להיות נחוץ.
| רצוי אלוטיפ | גירוי קוקטייל |
| IgG1and IgE | LPS (25μg/mL) ו-IL-4 (10 ng / mL) |
| IgG1and IgE | Anti-CD40 (10μg/mL) ו-IL-4 (10 ng / mL) |
| IgG2a | LPS (25μg/mL) ו - IFN-γ (10 ng / mL) |
| IgG2b ו IgG3 | LPS (25μg/mL) |
| IgA | LPS (25μg/mL), TGF-β (2 ng / mL) ו-IL-5 (1.5 ng / mL) |
באיור 1. בידוד גירוי LPS בתאי B הטחול. (א) מועשר מגנטית תאים B הטחול לפני גירוי LPS. (ב) 48 שעות לאחר גירוי עם 25 מיקרוגרם / מ"ל של LPS. התאים מתרבים נתפסים אשכולות ברקע של תאים אפופטוטיים פיצוץ ו.
איור 2. הפצת נשק ולעבור רקומבינציה הכיתה לאחר 96 שעות. (א) דילול CFSE עבור LPS מגורה בתאים לאחר 96 שעות בתרבות. כל שיא עצמאית מהווה דילול של הקרינה CFSE המתאים חלוקת תאים עצמאיים. (ב) הביטוי IgG3 המציג את צמיחתה של האוכלוסייה IgG3 חיובית בעקבות כמה סיבובים של חלוקת התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול שתוארו לעיל מספק assay תקן לנתח ביטוי סיוע לתפקד במהלך מיתוג המעמד העיקרי של תאים B Murine. פרוטוקול זה משתמש LPS בקטריאלי כדי לגרום מעבר מ IgM כדי IgG3, למרות שינויים בתקשורת הגירוי יכול להתבצע לגרום מעבר isotypes אחרים (מסוכמים בטבלה 1 8, 9).
יש לנו לציין כי, מסיבות שעדיין לא ידוע, נסיוב עגל העובר יכול להשפיע על רמת הכיתה מיתוג נצפתה במבחנה. זה חיוני כי מספר רב אותו לשמש עבור כל הניסויים CSR כדי להבטיח עקביות ניסיוני. זה יכול להיות גם מועיל מסך פאנל של מקורות עגל עוברי בדם להשיג אופטימלי בשערי חוץ גופית מיתוג. זנים עכבר יכול להשפיע גם על מידת מיתוג בכיתה ראה במבחנה 10. בהתאם assay הנדון, גרוע מיתוג מודלים Murine, כגון עכבר SJL, חייב להיות מספיק כדי backcrossed C57BL / 6 רקע להשיג שיעורי מיתוג ניכר.
שלב אני יכול להיות מושמט אם תרבית תאים טהור B אינו רצוי. גירוי מתערובת של תאים הטחול ימשיכו לגרום מיתוג מעמד, למרות שזה עלול לגרום אוכלוסייה גדולה יותר של אי - B תאים אפופטוטיים. יתר על כן, ניתוח תזרים הבאים cytometric חייב לכלול B הוקם תא סמן (B220 למשל, CD19). הערכה טיהור להשתמש בפרוטוקול זה מסופק על ידי StemCell טכנולוגיות (ראה טבלה ריאגנטים). ערכות חלופי המשתמשות בתהליך ההעשרה שלילי עשוי לשמש גם על פי הוראות היצרן.
הקרינה CFSE יכולה להיות חזקה מאוד ולכן כל ניסוי דורש פקד פיצוי הולם עבור ניתוח תזרים cytometric. בנוסף, CFSE יהיה לאט לדלוף החוצה של תאים והתוצאה היא ירידה של הקרינה הכוללת לאורך זמן. מסיבות אלה, מומלץ כי כל הניסויים כוללים unstimulated CFSE מוכתם האוכלוסייה התא. במשך זמן קצר, תאים אלה יישארו סטטיים בתרבות ולכן יכול לשמש כביקורת פיצוי CFSE ולזהות את האוכלוסייה הלא מתרבים התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים במעבדה מרטין לדיונים מועילים. פרסום זה נתמך על ידי מענק מטעם המכון הקנדי לבריאות מחקר (MOP-89783). AM הוא נתמך על ידי פרס קנדה מחקר הקתדרה המשני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| Polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Bovine Calf Serum | Hyclone | SH30072.03 | |
| RPMI 1640 Culture Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Rat Anti-Mouse IgG3 | BD Biosciences | 553401 |
References
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
