בעקבות חשיפה לאנטיגן, מופעל subpopulations של תאים B עוברים תהליך הידוע בשם רקומבינציה לעבור מחלקה (CSR) כדי לייצר נוגדנים isotypes עם מפעיל פונקציות שונות. פרוטוקול המתוארים בדוח זה מסביר כיצד CSR יכול להיגרם ונותחו במבחנה לצורכי לימוד פונקציה B התא.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אינדוקציה והערכה של רקומבינציה החלף מחלקה ב מטוהרים תאים B Murine
במאמר זה
סיכום
תקציר
חסינות הלחות היא ענף של המערכת החיסונית ומתוחזק על ידי תאים B ו מתווכת באמצעות הפרשה של נוגדנים. עם הפעלת תא B, מוקד אימונוגלובולינים עוברת סדרה של שינויים גנטיים כדי לשנות את קיבולת מחייב מפעיל פונקציה של נוגדנים מופרשים. תהליך זה מודגש על ידי אירוע רקומבינציה גנטי המכונה רקומבינציה בכיתה מתג (CSR) שבו IgM מחדל אלוטיפ נוגדן הוא החליף את אחד IgG, IgA או IgE. אלוטיפ כל בעל פונקציות שונות ובכך מפעיל אחריות חברתית חיונית לשמירה על חסינות.
גיוון של מוקד אימונוגלובולינים מתווכת על ידי דאמינז הפעלה-Induced cytidine אנזים (AID). וידאו סכמטי המתאר את התהליך בפירוט זמינה באופן מקוון (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). פעילות של סיוע מסלול CSR נלמדים בדרך כלל הערכה של תפקוד התא B ו חסינות הלחות בעכברים. פרוטוקול המתוארים בדוח זה מציג שיטה של בידוד תא B מ spleens Murine וגירוי לאחר מכן עם lipopolysaccharide חיידקי (LPS) כדי לגרום מעמד מעבר IgG3 (עבור isotypes נוגדנים אחרים ראו טבלה 1). בנוסף, מכתים פלורסנט התא לצבוע Carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) משמש כדי לפקח על חלוקת התא של תאים מגורה, תהליך חיוני אלוטיפ מיתוג 1, 2.
הסדרת הסיוע את המנגנון שבאמצעותו CSR מתרחשת עדיין אינם ברורים ולכן בבורר מבחני חוץ גופית בכיתה לספק שיטה אמינה לבדיקת תהליכים אלה במודלים של עכברים שונים. מבחני אלו שימשו בעבר בהקשר של חוסר גנטי באמצעות עכברים knockout 3. יתר על כן, במבחנה מיתוג של תאים B יכול להיות קדמו התמרה ויראלית לווסת ביטוי גנים על ידי מציאה RNA או ביטוי transgene 4-6. נתונים אלו סוגים של ניסויים השפיעו ההבנה שלנו של פעילות AID, ברזולוציה של התגובה CSR, ואת הנוגדנים בתיווך חסינות העכבר.
פרוטוקול
שלב I: בידוד של תאים B הטחול באמצעות העשרה מגנטי
- עכברי הניסוי צריך להיות בגיל 8-12 שבועות כדי להבטיח הבשלה מלאה של המערכת החיסונית.
- להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם ומשרים אתנול 70%. ניתוח להסרת הטחול על ידי ביצוע חתך דרך העור והשריר של hypochondrium השמאלי של הבטן וחתכו אותה לשלושה חלקים גדולים פוספט בופר סליין (PBS). ודאו כי כל כלי ריאגנטים הם עקרים.
- שימוש בסוף גומי של 1 מ"ל במזרק הבוכנה, ומועכים בעדינות את הטחול דרך מסננת לתוך תא 7....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול שתוארו לעיל מספק assay תקן לנתח ביטוי סיוע לתפקד במהלך מיתוג המעמד העיקרי של תאים B Murine. פרוטוקול זה משתמש LPS בקטריאלי כדי לגרום מעבר מ IgM כדי IgG3, למרות שינויים בתקשורת הגירוי יכול להתבצע לגרום מעבר isotypes אחרים (מסוכמים בטבלה 1 8, 9).
יש לנו לציין כי, מסיבות שעדיין לא ידוע, נסיוב עגל העובר יכול להשפיע על רמת הכיתה מיתוג נצפתה במבחנה. זה חיוני כי מספר רב אותו לשמש עבור כל הניסויים CSR.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
אנו מודים במעבדה מרטין לדיונים מועילים. פרסום זה נתמך על ידי מענק מטעם המכון הקנדי לבריאות מחקר (MOP-89783). AM הוא נתמך על ידי פרס קנדה מחקר הקתדרה המשני.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סליין עם בופר פוספט (Phosphate Buffered Saline) | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| ערכה להעשרה של תאי B מעכבר (EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit) | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| מבחנות פוליסטירן | BD Biosciences | 352058 | |
| אלבומין משרת בקר (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| ערכה לבדיקת proliferציה של תאים (CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit) | Invitrogen | C34554 | |
| סרום עגל בקר | Hyclone | SH30072.03 | |
| מצע תרבית RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| ליפופוליסכרידים מ- Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-מרקפט–אתנול | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| סרום עוברי של בקר (Fetal Bovine Serum) | Hyclone | SH30396.03 | |
| סרום עכבר נורמלי | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| נוגדן חולדה מופק Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | |
| נוגדן חולדה Anti-Mouse IgG3 | BD Biosciences | 553401 |
מקורות
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
