Summary
Après l'exposition des antigènes, des sous-populations de cellules B activées subissent un processus connu sous le nom commutation isotypique (CSR) pour produire des isotypes d'anticorps avec les différentes fonctions effectrices. Le protocole décrit dans le présent rapport explique comment la RSE peut être induite et analysé
Abstract
L'immunité humorale est la branche du système immunitaire entretenu par les cellules B et médiée par la sécrétion d'anticorps. Lors de l'activation des lymphocytes B, le locus d'immunoglobuline subit une série de modifications génétiques pour modifier la capacité de liaison et de la fonction effectrice des anticorps sécrétés. Ce processus est mis en évidence par un événement de recombinaison génomique connue comme la commutation isotypique (RSE) dans lequel l'isotype des anticorps IgM par défaut est substitué à l'un des IgG, IgA ou IgE. Chaque isotype possède des fonctions effectrices distinctes rendant ainsi la RSE crucial pour le maintien de l'immunité.
Diversification de l'locus d'immunoglobuline est médiée par l'enzyme cytidine désaminase induite par activation (AID). Une vidéo décrivant schématiquement ce processus en détail est disponible en ligne (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). L'activité de l'AID et la voie de la RSE sont fréquemment étudiés dans l'évaluation de la fonction des cellules B et l'immunité humorale chez la souris. Le protocole décrit dans le présent rapport présente une méthode d'isolement des cellules B de la rate de souris et une stimulation ultérieure avec lipopolysaccharide (LPS) à induire le passage à la classe IgG3 (pour les autres isotypes d'anticorps voir tableau 1). En outre, les cellules fluorescentes coloration colorants carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) est utilisé pour surveiller la division cellulaire des cellules stimulées, un processus crucial pour la commutation isotypique 1, 2.
Le règlement de l'AID et le mécanisme par lequel la RSE se sont pas encore claires et donc passer des tests in vitro de classe fournissent une méthode fiable pour les tests de ces processus dans les divers modèles de souris. Ces tests ont déjà été utilisés dans le contexte de déficience du gène en utilisant des souris knockout 3. Par ailleurs, in vitro, de commutation de cellules B peut être précédée par transduction virale pour moduler l'expression des gènes par ARN ou knockdown l'expression du transgène 4-6. Les données de ces types d'expériences ont influencé notre compréhension des activités d'aide, la résolution de la réaction de la RSE, et l'immunité à médiation d'anticorps chez la souris.
Protocol
Etape I: Isolement de cellules B spléniques via enrichissement magnétique
- Souris expérimentales doivent être âgés de 8-12 semaines pour assurer la maturation complète du système immunitaire.
- Euthanasier la souris par dislocation cervicale et tremper dans de l'éthanol à 70%. Enlever chirurgicalement la rate en faisant une incision à travers la peau et le muscle de l'hypochondre gauche de l'abdomen et le couper en trois gros morceaux dans du tampon phosphate salin (PBS). S'assurer que tous les outils et les réactifs sont stériles.
- Utilisation de l'extrémité en caoutchouc d'un plongeur 1 ml seringue, délicatement écrasez la rate dans une passoire 70 um de cellules dans le PBS. Veillez à utiliser un mouvement de poussée plutôt que d'une motion broyage broyage peut conduire à une rupture de plus (c'est à dire la prolifération) des cellules.
- Isoler les cellules à pas plus de 350 g pendant 5 minutes et resuspendre le culot dans du PBS. Compter les cellules resuspendues en utilisant un hématimètre.
- Préparer une suspension de 1x10 8 cellules / ml dans du PBS avec du sérum de rat normal de 5% dans un tube de polystyrène stériles de 5 ml avec un capuchon (volume maximal de 2 ml par tube).
- Ajouter 50 uL de EasySep Souris choix de cocktails négatif enrichissement cellules B pour chaque ml de cellules. Pipeter le mélange, le plafond du tube, et placer au réfrigérateur pendant 15 minutes.
- Ajouter 100 uL Cocktail EasySep sélection biotine pour chaque ml de cellules. Pipeter le mélange, le plafond du tube, et placer au réfrigérateur pendant 15 minutes.
- Ajouter 100 ul de EasySep nanoparticules magnétiques (s'assurer nanoparticules sont bien mélangés et la solution est homogène) pour chaque ml de cellules. Pipeter le mélange, le plafond du tube, et le placer dans le réfrigérateur pendant 5 minutes.
- Haut de la solution à 2,5 ml avec du PBS et placer dans un aimant EasySep pendant 5 minutes. Inverser l'aimant et le tube et verser rapidement dans un tube en polystyrène de nouvelles. Ne pas secouer le tube comme les cellules négativement sélectionnés seront magnétique lié aux parois du tube.
- Pour augmenter encore la pureté de la suspension de cellules, le tube peut être réinséré dans l'aimant pour 5 minutes supplémentaires et versé dans un nouveau tube. Cela peut réduire la récupération des cellules en général.
- La pureté des cellules B peut être évaluée par cytométrie de flux des marqueurs de surface des cellules B. Suite à l'enrichissement, nous avons constamment voir une pureté de> 95% B220 cellules positives.
Etape II: coloration des cellules CFSE
- Resuspendre les cellules chaudes isolées dans du PBS additionné de sérum bovin 0,1% d'albumine à une concentration finale de 1 x 10 6 cellules par ml.
- Préparer une solution stock de 5mm de CFSE (dilué dans du diméthylsulfoxyde stérile) et ajouter 2μL pour chaque ml de cellules dans le tube. La concentration finale de 10 uM est optimal pour la coloration des cellules B primaires.
- Incuber à 37 ° C pendant 10 minutes dans l'obscurité (à noter: CFSE est sensible à la lumière et doit être conservé dans l'obscurité quand c'est possible).
- Étancher la tache en ajoutant un volume égal de sérum de veau bovin à vos cellules et incubation sur la glace pendant 5 minutes.
- Laver les cellules en complétant les tubes avec milieu de culture (voir l'étape III pour la recette) et centrifugation à 350 g. Notez qu'au moins cinq fois l'équivalent du volume des médias doivent être ajoutés pour neutraliser la viscosité du sérum de veau bovin et pour les cellules à produire une boulette.
- Laver les cellules deux fois plus en milieu de culture. Les cellules sont maintenant prêts pour la stimulation.
Etape III: stimulation cellulaire par le LPS
- Préparez votre in vitro, B milieu de culture cellulaire en complétant RPMI 1640 avec du sérum de veau foetal à 10% et 50 uM β-mercaptoéthanol /.
- Préparez votre support de stimulation par l'ajout de LPS à une concentration finale de 50μg/mL. Aliquoter 125 ul du milieu de stimulation dans chaque puits d'un fond plat de 96 puits plaque de culture tissulaire.
- Préparez vos cellules B CFSE teinté en milieu de culture sans LPS à une concentration finale de 3,2 x 10 6 cellules / ml. Ajouter 125 ul de la suspension cellulaire dans les puits contenant votre support de stimulation et mélanger délicatement à la pipette.
- Chaque puits contient maintenant 4 x 10 5 cellules à une concentration finale de LPS de 25 pg / mL. Cela fournit un niveau optimal de la prolifération cellulaire et la commutation de classe, bien que des modifications à ces valeurs peuvent être faites comme vous le souhaitez.
- Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 72 à 96 heures. Après 48 heures, des grappes de grandes cellules B proliférantes sera clairement visible sous un microscope.
Etape IV: cytométrie de flux de commutation de classe
- Lorsque vous êtes prêt à regarder le changement de classe, retirez vos cellules de leurs conditions de culture et de les laver deux fois dans 1 ml de tampon de coloration (PBS avec 2% de sérum bovin de veau).
- Pour prévenir les taches d'anticorps non spécifiques de vos cellules, un culot cellulaire en les faisant tourner vers le bas à 350 g et incubateursTE eux dans 100 pi de tampon avec coloration du sérum de souris normales et 5% des 1 pg FcBlock per106 cellules pendant 15 minutes sur la glace. Bloquant la cellule doit être effectué sur la glace.
- Sans se laver les cellules, ajouter 1 pg par 10 6 cellules d'une souris fluorescente taggés IgG3 anti-anticorps et permettre aux cellules de coloration pendant 30 minutes sur la glace.
- Laver les cellules deux fois par centrifugation et resuspendre dans 200-300 ul de tampon de coloration. Les cellules sont maintenant prêts pour l'évaluation par cytométrie en flux.
- CFSE est parfaitement excité à 492 nm (par un laser à l'argon-ion) et émet à 517 nm. Le spectre d'excitation et d'émission de l'anticorps IgG3 est dépendante de ses colorant fluorescent conjugué.
Les résultats représentatifs
Après enrichissement magnétique, la suspension cellulaire doit ressembler à une population homogène de petites cellules indiscernables circulaire (figure 1A). Après 48-72 heures de stimulation, des groupes isolés de cellules proliférantes élargie sera clairement visible (figure 1B). Une grande proportion des cellules non-proliférantes apparaîtra petites et granuleuses comme ils subissent l'apoptose.
La RSE peut normalement être détectée au plus haut niveau entre 72 et 96 heures après la stimulation avant la plupart des cellules commencent à mourir 7. A ce stade, les cellules doivent avoir subi un certain nombre de divisions cellulaires avec les cellules tension apparaissant dans la population cellule fille plus tard. Une parcelle de flux représentant cytométrie de dilution CFSE et d'expression de surface de l'IgG3 après 96 heures de stimulation par le LPS peut être vu dans la figure 2.
Tableau 1. Isotype commutation cocktails. Remarque: Les valeurs de concentration de stimulants sont que des recommandations. Titrages peut être nécessaire.
| Isotype désiré | Cocktail de stimulation |
| IgG1and IgE | LPS (25μg/mL) et de l'IL-4 (10 ng / ml) |
| IgG1and IgE | Anti-CD40 (10μg/mL) et de l'IL-4 (10 ng / ml) |
| IgG2a | LPS (25μg/mL) et l'IFN-γ (10 ng / ml) |
| IgG2b et IgG3 | LPS (25μg/mL) |
| IgA | LPS (25μg/mL), le TGF-β (2 ng / mL) et IL-5 (1,5 ng / mL) |
Figure 1. Isolement et stimulation par le LPS des cellules B spléniques. (A) magnétiquement enrichi cellules B spléniques, avant stimulation par le LPS. (B) 48 heures après la stimulation avec 25 pg / mL de LPS. Les cellules en prolifération sont considérés comme des clusters dans un fond de cellules apoptotiques et de dynamitage.
Figure 2. Prolifération et la commutation isotypique après 96 heures. (A) dilution CFSE pour les cellules stimulées par LPS après 96 heures de culture. Chaque pic indépendante représente une dilution de la fluorescence CFSE correspondant à une division cellulaire indépendant. (B) l'expression IgG3 montrant l'émergence d'une population IgG3 positif après plusieurs cycles de division cellulaire.
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Discussion
Le protocole décrit ci-dessus donne un dosage standard pour analyser l'expression AID et la fonction lors de la commutation de classe du primaire des cellules B murines. Ce protocole utilise LPS bactérien pour induire le passage d'IgM IgG3, même si des modifications aux médias stimulation peut être faite pour induire le passage à d'autres isotypes (résumées dans le Tableau 1 8, 9).
Nous avons noté que, pour des raisons encore inconnues, du sérum de veau fœtal peut affecter le niveau de classe de commutation observée in vitro. Il est crucial que le même numéro de lot sera utilisé pour toutes les expériences en matière de RSE afin d'assurer la cohérence expérimental. Il peut également être bénéfique à l'écran d'un panel de sources sérum de veau foetal optimal à atteindre des taux de commutation in vitro. Souches de souris peut aussi affecter le degré de commutation de classe observée in vitro 10. Selon le test en question, mal de commutation des modèles murins, tels que la souris SJL, doit être suffisamment à l'rétrocroisés C57BL / 6 de fond pour atteindre des taux appréciables de commutation.
Étape I peuvent être omises si une culture de cellules pures B n'est pas souhaitée. La stimulation d'un mélange de cellules spléniques seront encore induisent la commutation de classe, mais il peut en résulter une plus grande population de l'apoptose des cellules non-B. Par ailleurs, l'analyse des flux ultérieurs cytométrie doit inclure un marqueur B créé la cellule (par exemple, B220, CD19). Le kit de purification utilisés dans ce protocole est fourni par StemCell Technologies (voir le tableau des réactifs). Autre kits qui utilisent un processus d'enrichissement négative peut aussi être utilisé conformément aux instructions du fabricant.
Fluorescence CFSE peut être très intense et donc chaque expérience nécessite une commande de compensation appropriée pour l'analyse par cytométrie en flux. En outre, CFSE va lentement s'échapper des cellules résultant en une réduction globale de la fluorescence au cours du temps. Pour ces raisons, il est recommandé que toutes les expériences comprennent une population de cellules non stimulées CFSE-tachés. Sur une courte période de temps, ces cellules restent statiques dans la culture et peut donc être utilisé comme une commande de compensation pour les CFSE et d'identifier la population de cellules non-proliférantes.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants au laboratoire Martin pour des discussions utiles. Cette publication est soutenue par une subvention de l'Institut canadien de recherche en santé (MOP-89783). AM est soutenu par une recherche du Canada Chaire de niveau II Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| Polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Bovine Calf Serum | Hyclone | SH30072.03 | |
| RPMI 1640 Culture Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Rat Anti-Mouse IgG3 | BD Biosciences | 553401 |
References
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