Summary
항원 노출에 따라 활성화된 B 세포의 subpopulations는 독특한 효과기 기능 항체 isotypes를 만들어 클래스 스위치 재조합 (CSR)으로 알려진 공정을 받고있다. 이 보고서에 제시된 프로토콜은 CSR을 유도하고 분석하는 방법을 설명합니다
Abstract
체액성 면역은 B 세포에 의해 유지 및 항체의 분비를 통해 중재 면역 시스템의 지점이다. B 세포 활성화되면 면역 글로불린 로커스는 바인딩 용량과 분비 항체의 이펙터 기능을 변경하는 유전자 수정 일련의를 겪습. 이 프로세스는 기본 IgM 항체의 isotype은 IgG, 이가, 또는 IGE 중 하나에 대체되는 클래스 스위치 재조합 (CSR)으로 알려진 게놈 재조합 이벤트로 강조 표시됩니다. 각 isotype되므로 면역의 유지 관리 CSR은 중요하고 독특한 이펙터 기능을 가지고 있습니다.
면역 글로불린 로커스의 다변화는 효소 활성 유발 cytidine deaminase의 (AID)에 의해 중재됩니다. 자세히이 과정을 설명하는 도식 동영상은 온라인 (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html)입니다. AID의 활동 및 CSR의 경로는 일반적으로 B 세포 기능과 마우스의 체액성 면역의 평가에서 공부하고 있습니다. 이 보고서에 제시된 프로토콜은 murine spleens와 클래스 (다른 항체 isotypes에 대한 표 1 참조) IgG3로 전환 유발하는 박테리아 lipopolysaccharide (LPS)와 후속 자극에서 B 세포 분리의 방법을 보여줍니다. 또한, 형광 세포 염색 얼룩 Carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE)를 자극 세포의 세포 분열, 스위칭 1, 2 isotype에 중요한 프로세스를 모니터하는 데 사용됩니다.
구호품과 CSR이 발생하는 메커니즘의 규정은 아직 불분명하고 있으므로 체외 클래스 스위치 assays 다양한 마우스 모델에서 이러한 프로세스를 테스트하기위한 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 이러한 assays는 이전에 다음 ID로 녹아웃 마우스 3를 사용하여 유전자 결핍의 맥락에서 사용되었습니다. 또한, 관내는 B 세포의 스위칭 RNA의 분해 또는 transgene 표현 4-6에 의해 유전자 발현을 조절하는 바이러스 전달 앞에 수 있습니다. 실험 이러한 종류의 데이터는 구호 활동, CSR 반응의 해상도 및 마우스에서 항체 - 매개 면역에 대한 우리의 이해에 영향을합니다.
Protocol
단계 I : 자기 강화를 통해 지라 B 세포의 절연
- 실험 생쥐는 면역 체계의 전체 성숙을 보장하기 위해 8~12주 이상되어야합니다.
- 자궁 경부 전위로 마우스를 안락사와 70 % 에탄올에서 만끽해보세요. 수술 복부의 왼쪽 hypochondrium의 피부와 근육을 통해 절개하여 비장을 제거하고 인산의 3 대 조각으로 잘라 (PBS) 살린 버퍼. 모든 도구와 시약은 멸균 수 있도록.
- 부드럽게 매쉬는 PBS로 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 1 ML 주사기 플런저의 고무 끝을 비장 사용합니다. 연삭가 큰 (proliferating 예) 세포의 파열로 이어질 수 있으므로 추진 운동보다는 연삭 모션을 사용해야합니다.
- 5 분 더 이상 350 이상 g에서 세포를 스핀 다운 및 PBS의 펠렛을 resuspend. hemocytometer를 사용하여 resuspended 세포를 계산합니다.
- 뚜껑이있는 멸균 5 ML의 폴리스티렌 튜브 5% 정상 쥐의 혈청 (튜브 당 2 ML 최대 볼륨)과 1x10 8 셀 / PBS에 ML의 정지를 준비합니다.
- 세포의 모든 ML에 대한 부정적 EasySep 선택 마우스 B 세포 농축 칵테일 50 μL를 추가합니다. 혼합물을 피펫, 튜브 캡, 15 분 동안 냉장고에 곳입니다.
- 세포의 모든 ML 100 μL EasySep 비오틴 선택 칵테일을 추가합니다. 혼합물을 피펫, 튜브 캡, 15 분 동안 냉장고에 곳입니다.
- 세포의 모든 ML에 대한 EasySep 마그네틱 Nanoparticles 100 μL를 (nanoparticles 잘 혼합되고 솔루션은 동질한지) 추가합니다. 혼합물을 피펫, 튜브 캡, 5 분 동안 냉장고에 곳입니다.
- PBS로 5 분 EasySep 자석의 장소 2.5mL 위로는 솔루션입니다. 자석과 튜브를 반전하고 새로운 폴리스티렌 튜브에 신속하게 부어. 부정적인 선택 세포가 자기 (磁 气) 튜브 벽에 바인딩되므로 튜브를 흔들지 마세요.
- 더욱 세포 현탁액의 순도를 높이려면, 튜브가 추가 5 분 자석에 다시 삽입하고 새로운 튜브로 부어있을 수 있습니다. 이것은 전체 세포 복구를 줄일 수 있습니다.
- B 세포의 순도는 B 세포 표면 마커의 흐름 cytometric 분석에 의해 평가하실 수 있습니다. 농축 다음, 우리는 지속적으로> 95% B220 긍정적인 세포의 순도를 참조하십시오.
CFSE 세포 얼룩 : II 단계
- ML 당 1 × 10 6 세포의 최종 농도에서 알부민 0.1 % 소 혈청과 보충 따뜻한 PBS에서 분리된 세포를 Resuspend.
- CFSE (무균 디메틸 sulfoxide에 희석)의 5mM 재고 솔루션을 준비하고 튜브에 세포의 모든 ML에 대한 2μL를 추가합니다. 10μM의 최종 농도는 기본 B 세포의 얼룩에 최적입니다.
- 37 품어 ° 어둠 속에서 10 분 동안 C (참고 : CFSE 빛을 민감한하고 가능하면 어둠에 보관한다.)
- 당신의 세포에 소 송아지 혈청의 동일한 볼륨을 추가하고 5 분 얼음 잠복기로 얼룩을 끄다.
- G.를 (제조법 단계 III 참조) 문화 매체로 튜브를 토핑하고 350에 centrifuging하여 세포 와시 미디어 적어도 5 배 부피 상응하는이 소 송아지 혈청의 점도를 중화하고 세포의 펠렛 생산에 추가할 수 있어야합니다.
- 문화 매체에 두 번 더 세포를 씻으십시오. 세포는 이제 자극에 대한 준비가되어 있습니다.
III 단계 : LPS와 함께 세포 자극을
- 10% 소태아 혈청 및 50 μm의 β - 메르 캅 토 에탄올 /로 RPMI 1640을 보완하여 체외의 B 세포 배양 매체에서를 준비합니다.
- 50μg/mL의 최종 농도에서 LPS를 추가하여 자극 미디어를 준비합니다. 평평한 바닥의 각 잘 96 - 웰 조직 배양 플레이트에 자극을 매체의 나누어지는 125 μL.
- 3.2 X 10 6 세포 / ML의 최종 농도에서 LPS없는 배지에서 CFSE - 스테인드 B 전지를 준비합니다. 귀하의 자극 미디어 부드럽게 pipetting으로 혼합을 포함하고있는 우물에 세포 현탁액 125 μL를 추가합니다.
- 각 물론 지금은 25 μg / ML의 최종 LPS 농도 4 X 10 5 세포가 포함되어 있습니다. 이러한 값을 변경을 원하는대로 만들 수 있지만 이것은 세포 증식 및 클래스 스위칭의 최적 수준을 제공합니다.
- 37 세포를 품어 ° C와 5% 72~96시간에 대한 CO 2. 48 시간 후, 큰 proliferating B 세포의 클러스터는 현미경으로 명확하게 볼 수 있습니다.
단계 IV : 클래스 스위칭의 흐름 cytometric 분석
- 이 클래스 스위칭 볼 준비가되면, 그들의 문화 조건에서 세포를 제거하고 얼룩 버퍼 (2 % 소 송아지 혈청 PBS) 1 ML 두 번 그들을 씻으십시오.
- 350g과 incuba에서 그들을 회전하여 세포 펠릿 세포가 아닌 특정 항체 얼룩을 방지하기 위해5% 정상 마우스 혈청 얼음에 15 분 동안 FcBlock per106 세포의 1μg과 버퍼를 얼룩의 100μL에 테 그들. 셀 차단은 얼음에서 수행되어야합니다.
- 당신의 세포를 세척하지 않고, 찬란 태그를 방지 마우스 IgG3 항체의 10 6 세포 당 1μg을 추가하고 세포가 얼음에 30 분 동안 착색 수 있습니다.
- 얼룩 버퍼의 200-300 μL에서 원심 분리하고 resuspend에 의해 두 번 세포를 씻으십시오. 세포는 이제 유동세포계측법에 의해 평가를위한 준비가되어 있습니다.
- CFSE는 최적의 492 nm의에서 흥분 (아르곤 이온 레이저로)와 517 nm의에서 방출됩니다. IgG3 항체의 여기 및 발광 스펙트럼은 형광 염료 공액에 따라 달라집니다.
대표 결과
자기 강화에 따라 세포 현탁액은 분간 작은 원형 세포 (그림 1A)의 동질적인 인구처럼 보이게한다. 자극 48~72시간 후, 확대 proliferating 세포의 격리 클러스터 (그림 1B) 명확하게 볼 수 있습니다. 그들은 apoptosis를 받아야 같은 비 - proliferating 세포의 큰 비율은 작은 입상 나타납니다.
세포의 대부분 7 죽기 시작하기 전에 CSR은 일반적으로 자극 후 72 96시간 사이에서 가장 높은 수준에서 검색하실 수 있습니다. 이 단계에서, 세포는 나중에 딸 세포 인구에 나타나는 전환 세포와 세포 분열의 번호를받은 것입니다. CFSE 희석과 LPS의 자극 96 시간 후 IgG3의 표면 표현의 대표적인 흐름 cytometric 플롯은 그림 2에서 볼 수 있습니다.
표 1. 칵테일 스위칭 Isotype. 참고 : 흥분제 농도 값은 권장 사항입니다. Titrations가 필요할 수 있습니다.
| 원하는 Isotype | 자극 칵테일 |
| IgG1and IGE | LPS (25μg/mL)와 IL - 4 (10 NG / ML) |
| IgG1and IGE | 안티 CD40 (10μg/mL)와 IL - 4 (10 NG / ML) |
| IgG2a | LPS (25μg/mL)와 IFN - γ (10 NG / ML) |
| IgG2b 및 IgG3 | LPS (25μg/mL) |
| 이가 | LPS (25μg/mL), TGF - β (2 NG / ML)와 IL - 5 (1.5 NG / ML) |
그림 1. 지라 분리 및 B 세포의 LPS의 자극. (A) 자기 (磁 气) LPS의 자극 전 지라 B 세포를 풍부하게. (B) 48시간 25 μg / LPS의 ML과 자극 후. Proliferating 세포 가공 및 apoptotic 세포의 배경에 클러스터로 볼 수 있습니다.
그림 2. 96시간 후 확산 및 클래스 스위치 재조합. (A) LPS에 대한 CFSE 희석은 문화에 96시간 후 세포를 자극. 각각의 독립적인 피크는 독립적인 세포 분열에 대응하는 CFSE의 형광에 희석을 나타냅니다. (B) IgG3 표현은 세포 분열의 여러 순찰 다음 IgG3 긍정적인 인구의 출현을 보여주는.
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Discussion
위에서 설명한 프로토콜은 기본 murine B 세포의 클래스 스위칭하는 동안 보조 표현과 기능을 분석하기위한 표준 분석을 제공합니다. 자극 미디어에 수정이 다른 isotypes (표 1 8, 9에 요약)으로 전환 유도하기 위해 만들 수 있지만이 프로토콜은, IgM에서 IgG3로 전환 유발하는 박테리아 LPS를 사용합니다.
우리는 아직 알려지지 않은 이유로, 태아 송아지 혈청 클래스 체외에서 관찰 전환 수준에 영향을 미칠 수 있다고 지적했습니다. 그것은 같은 많은 번호가 실험 일관성을 보장하기 위해 모든 CSR 실험에 사용하는 것이 중요합니다. 또한 체외 스위칭 속도에 최적의 달성 소태아 혈청 소스 패널을 화면으로 도움이 될 수 있습니다. 마우스 변종은 또한 체외 10 본 클래스 스위칭의 정도에 영향을 줄 수 있습니다. 충분히 C57BL / 감지할 수있을 정도의 스위칭 속도를 달성 6 배경 backcrossed해야 저조한 등 SJL 마우스로 murine 모델을 전환, 문제의 분석에 따라 다릅니다.
순수의 B 세포 배양이 원하는하지 않은 경우 내가 생략 수 있습니다 단계. 그것이 apoptotic 비 - B 세포의 더 큰 인구에 발생할 수 있지만 지라 세포의 혼합물의 자극은 여전히 클래스 전환을 유도합니다. 또한, 후속 흐름 cytometric 분석 설립 B 세포의 마커 (예 : B220, CD19) 포함해야합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 정화 키트 (시약 테이블 참조) StemCell 기술에 의해 제공됩니다. 부정 농축 프로세스를 사용 대체 키트는 또한 제조 업체의 지시에 따라 사용할 수 있습니다.
CFSE의 형광은 매우 강렬한 수 있으며, 따라서 각각의 실험 흐름 cytometric 분석을위한 적절한 보상 제어가 필요합니다. 또한, CFSE 천천히 시간이 지남에 따라 전반적인 형광의 감소로 인한 세포의 날겁니다. 이러한 이유로, 그것은 모든 실험 unstimulated CFSE - 스테인드 세포 인구를 포함하는 것이 좋습니다. 짧은 기간 동안,이 세포는 문화에 정적 남아 있으므로 CFSE에 대한 보상 컨트롤로 사용할 수 있으며, 이외 proliferating 세포 인구를 식별합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 도움이 토론에 대한 마틴의 실험실에 감사하고 있습니다. 이 책자는 건강 연구의 캐나다 연구소 (걸레 - 89783)에서 부여로 지원됩니다. AM은 캐나다 연구 의자 티어 II 수상에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| Polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Bovine Calf Serum | Hyclone | SH30072.03 | |
| RPMI 1640 Culture Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Rat Anti-Mouse IgG3 | BD Biosciences | 553401 |
References
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