Summary
عقب التعرض لمستضد ، مجموعات سكانية فرعية من الخلايا باء يمكنهم الخضوع لعملية إعادة التركيب المعروفة باسم الطبقة التبديل (CSR) لإنتاج الأجسام المضادة مع وظائف isotypes المستجيب متميزة. بروتوكول المبينة في هذا التقرير يشرح كيف يمكن أن يتسبب المسؤولية الاجتماعية للشركات وتحليلها
Abstract
الحصانة الخلطية هي فرع من فروع الجهاز المناعي التي تحتفظ بها الخلايا البائية وتوسطت من خلال إفراز الأجسام المضادة. عند تنشيط خلايا B ، بموضع المناعي يخضع لسلسلة من التعديلات الوراثية لتغيير القدرة ملزمة وظيفة المستجيب يفرز الأجسام المضادة. ومن ابرز هذه العملية من خلال إعادة التركيب الجيني حدث المعروفة باسم التهجين تبديل فئة (CSR) التي يتم فيها استبدال الضد الغلوبولين المناعي isotype الافتراضي لأحد IgG و IgA ، أو إيج. كل isotype تمتلك وظائف متميزة المستجيب مما يجعل المسؤولية الاجتماعية للشركات حاسما في الحفاظ على الحصانة.
وتوسطت تنويع موضع المناعي من سيتيدين انزيم نازعة أمين التنشيط التي يسببها (AID). شريط فيديو التخطيطي اصفا هذه العملية بالتفصيل على شبكة الإنترنت (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). عادة يتم دراسة النشاط المعونة ومسار المسؤولية الاجتماعية للشركات في تقييم وظيفة الخلايا باء والحصانة الخلطية في الفئران. بروتوكول المبينة في هذا التقرير وسيلة لعزل الخلايا B من الطحال الفئران والتحفيز لاحقة مع lipopolysaccharide البكتيرية (LPS) للحث على التحول إلى فئة IgG3 (على الضد isotypes الأخرى أنظر الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام صبغة الفلورسنت تلوين الخلية Carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) لمراقبة تقسيم خلية من خلايا حفز ، وهي عملية حاسمة لisotype التبديل 1 و 2.
تنظيم المساعدات والآلية التي يحدث المسؤولية الاجتماعية للشركات لا تزال غير واضحة ، وبالتالي في فحوصات المختبر تبديل فئة توفر طريقة موثوق بها لاختبار هذه العمليات في نماذج الماوس المختلفة. كانت هذه المقايسات التي سبق استخدامها في سياق نقص الجينات باستخدام الفئران بالضربة القاضية 3. وعلاوة على ذلك ، يمكن التبديل في المختبر من خلايا B يسبقه تنبيغ الفيروسية لتعديل التعبير الجيني بواسطة الحمض النووي الريبي ضربة قاضية أو التحوير التعبير 4-6. أثرت البيانات من هذه الأنواع من التجارب فهمنا للنشاط AID ، القرار من ردود الفعل المسؤولية الاجتماعية للشركات ، والأجسام المضادة التي تتوسط فيها الحصانة في الماوس.
Protocol
الخطوة الأولى : عزل خلايا B الطحال عبر تخصيب المغناطيسي
- وينبغي أن الذين تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسابيع فئران التجارب لضمان النضج التام للنظام المناعي.
- الموت ببطء الماوس بواسطة الخلع عنق الرحم ونقع في الايثانول 70 ٪. إزالة الطحال جراحيا عن طريق شق طريق الجلد والعضلات من hypochondrium الأيسر من البطن وقطع عليه في ثلاث قطع كبيرة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). التأكد من أن كل الأدوات والكواشف ومعقمة.
- استخدام المطاط في نهاية المكبس من المحاقن 1 مل ، برفق الهريس والطحال من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني. تأكد من استخدام اقتراح دفع بدلا من الحركة وطحن طحن قد تؤدي إلى تمزق الخلايا أكبر (أي تكاثر).
- تدور باستمرار في الخلايا لا يزيد عن 350 جرام لمدة 5 دقائق وresuspend وبيليه في برنامج تلفزيوني. عد الخلايا باستخدام معلق عدادة الكريات.
- يعد الوقف من الخلايا 1x10 8 / مل في برنامج تلفزيوني مع 5 ٪ مصل الفئران العادية في معقمة 5 مل أنبوب البوليسترين مع قبعة (حجم أقصى 2 مل في أنبوب).
- إضافة 50 ميكرولتر من EasySep ماوس اختيار السلبية كوكتيل B التخصيب خلية لكل مليلتر من الخلايا. ماصة الخليط ، وكأب للأنابيب ، ووضعه في البراد لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 100 ميكرولتر اختيار البيوتين EasySep كوكتيل لكل مليلتر من الخلايا. ماصة الخليط ، وكأب للأنابيب ، ووضعه في البراد لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 100 ميكرولتر من النانوية المغناطيسية EasySep (ضمان النانوية تمتزج جيدا ، والحل هو متجانسة) لكل مليلتر من الخلايا. ماصة الخليط ، وكأب للأنابيب ، ووضعه في البراد لمدة 5 دقائق.
- أعلى الحل ل2.5mL مع برنامج تلفزيوني وتجري في المغناطيس EasySep لمدة 5 دقائق. عكس المغناطيس وأنبوب بسرعة وتصب في أنبوب البوليسترين جديدة. لا تهزه أنبوب كما سيتم تحديد الخلايا مغناطيسيا ملزمة سلبا على جدران الأنبوب.
- وذلك لزيادة نقاء التعليق الخلية ، قد يتم إعادة إدراج أنبوب إلى المغناطيس لمدة 5 دقائق إضافية ، وسكب في أنبوب جديد. هذا قد خفض إجمالي الانتعاش الخلية.
- ويمكن تقييم B نقاء خلية تحليل تدفق cytometric علامات B سطح الخلية. بعد تخصيب ، ونحن نرى دائما نقاء من الخلايا> 95 ٪ ايجابي B220.
الخطوة الثانية : CFSE تلوين الخلية
- Resuspend الخلايا المعزولة في برنامج تلفزيوني الدافئة تستكمل مع المصل البقري بنسبة 0.1 ٪ عند تركيز الألبومين النهائي 1 × 6 10 خلايا لكل مليلتر.
- إعداد محلول المخزون من 5mM CFSE (مخفف في سلفوكسيد ثنائي ميثيل العقيمة) وإضافة 2μL لكل مليلتر من الخلايا في الأنبوب. التركيز النهائي لل10μM هو الأمثل لتلطيخ من الخلايا باء الابتدائي.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في الظلام (ملاحظة : CFSE خفيفة حساسة ويجب أن تبقى في الظلام عندما يكون ذلك ممكنا).
- إخماد صمة عار عن طريق إضافة حجم مساو من مصل العجل البقري إلى خلاياك وتفرخ على الجليد لمدة 5 دقائق.
- غسل الخلايا التي تحتل المرتبة الاولى تصل الأنابيب مع الثقافة المتوسطة (انظر الخطوة الثالثة للصفة) والطرد المركزي في 350 غرام. علما أنه يجب أن يضاف ما لا يقل عن 5 مرات ما يعادل حجم وسائل الإعلام للتصدي لزوجة من المصل البقري والعجل للخلايا لانتاج بيليه.
- غسل الخلايا أكثر مرتين في المتوسط الثقافة. الخلايا هي الآن جاهزة للتحفيز.
الخطوة الثالثة : تحفيز الخلية مع LPS
- إعداد المختبر الخاص في الخلية B مستنبت من خلال استكمال RPMI 1640 مع 10 ٪ مصل العجل الجنين و 50 ميكرومتر / β - المركابتويثانول.
- إعداد المتوسطة التحفيز الخاص بإضافة LPS بتركيز نهائي 50μg/mL. قسامة 125 ميكرولتر من التحفيز المتوسطة في كل جانب من قاع مسطح 96 - جيدا وحة زراعة الأنسجة.
- تحضير الخلايا B CFSE الملطخة في مستنبت دون LPS بتركيز نهائي قدره 3.2 × 10 6 خلية / مل. إضافة 125 ميكرولتر لتعليق الخلية إلى الآبار التي تحتوي على التحفيز والمتوسطة الخاص الخليط بواسطة pipetting بلطف.
- كل بئر يحتوي الآن على 10 5 4 × الخلايا في تركيز LPS النهائية من 25 ميكروغرام / مل. وهذا يوفر المستويات المثلى من تكاثر الخلايا والتحول الطبقي ، على الرغم من التعديلات التي قد تكون لهذه القيم كما هو مطلوب.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 لمدة 72 إلى 96 ساعة. بعد 48 ساعة ، ومجموعات كبيرة الخلايا المتكاثرة B تكون مرئية بوضوح تحت المجهر.
رابعا الخطوة : تحليل تدفق cytometric التحول الطبقي
- عندما كنت على استعداد للنظر في تبديل الطبقة ، وإزالة الخلايا الخاصة بك من ظروف ثقافتهم وغسلها مرتين في 1 مل من تلطيخ العازلة (PBS مع 2 ٪ مصل العجل البقري).
- لمنع غير محددة تلوين الأجسام المضادة لخلايا الخاص بك ، بيليه الخلايا من خلال الدوران عليهم في 350 غرام وincubaالشركة المصرية للاتصالات لهم في 100μL من تلطيخ العازلة مع 5 ٪ مصل الفأر العادي و1μg الخلايا per106 FcBlock لمدة 15 دقيقة على الجليد. يجب أن يتم تنفيذ حظر خلية على الجليد.
- دون غسل خلايا الجسم ، إضافة 1μg في الخلايا 6 10 من الأضداد المضادة الموسومة fluorescently IgG3 الماوس وتسمح للخلايا لصبغ لمدة 30 دقيقة على الجليد.
- غسل الخلايا بواسطة الطرد المركزي ، ومرتين في resuspend 200-300 ميكرولتر من تلطيخ العازلة. الخلايا على استعداد الآن للتقييم من قبل التدفق الخلوي.
- هو متحمس بشكل أمثل في CFSE 492 نانومتر (بواسطة ليزر أيون الأرجون) وتنبعث في 517 نانومتر. الطيف الإثارة وانبعاث الجسم المضاد IgG3 يعتمد على صبغة الفلورسنت المتقارن لها.
ممثل النتائج
بعد تخصيب المغناطيسي ، ينبغي تعليق خلية تبدو وكأنها متجانسة من السكان الخلايا تمييزه دائرية صغيرة (الشكل 1A). بعد 48-72 ساعة من التحفيز ، ومجموعات معزولة من تضخم الخلايا المتكاثرة تكون مرئية بشكل واضح (الشكل 1B). وهناك نسبة كبيرة من الخلايا غير الصغيرة وتتكاثر تظهر حبيبات لأنها تخضع لموت الخلايا المبرمج.
يمكن عادة يتم الكشف عن المسؤولية الاجتماعية للشركات على أعلى المستويات بين 72 و 96 ساعة بعد التحفيز قبل معظم الخلايا تموت 7. في هذه المرحلة ، يجب أن خضعت لعدد من الخلايا الانقسامات الخلوية مع تبديل الخلايا التي تظهر في الخلية في وقت لاحق ابنة السكان. ويمكن رؤية تدفق مؤامرة ممثل cytometric التخفيف CFSE والتعبير سطح IgG3 بعد 96 ساعة من التحفيز LPS في الشكل 2.
الجدول 1. Isotype التبديل الكوكتيلات. ملاحظة : قيم تركيز المنشطات هي توصيات فقط. قد يكون من الضروري المعايرة.
| المطلوب Isotype | التحفيز كوكتيل |
| IgG1and إيج | LPS (25μg/mL) و IL - 4 (10 نانوغرام / مل) |
| IgG1and إيج | مكافحة CD40 (10μg/mL) و IL - 4 (10 نانوغرام / مل) |
| IgG2a | LPS (25μg/mL) ، والإنترفيرون γ (10 نانوغرام / مل) |
| وIgG2b IgG3 | LPS (25μg/mL) |
| ايغا | LPS (25μg/mL) ، TGF - β (2 نانوغرام / مل) و IL - 5 (1.5 نانوغرام / مل) |
الشكل 1. عزل وLPS تحفيز خلايا B الطحال. (أ) المخصب مغناطيسيا خلايا B الطحال قبل التحفيز LPS. (ب) بعد 48 ساعة من التحفيز مع 25 ميكروغرام / مل من LPS. وتعتبر الخلايا المتكاثرة في شكل مجموعات من الخلايا خلفية التفجير وأفكارك.
الشكل 2. الانتشار وإعادة التركيب الطبقي التبديل بعد 96 ساعة. (أ) لحفز تخفيف CFSE LPS الخلايا بعد 96 ساعة في الثقافة. كل مستقل يمثل الذروة في التخفيف مضان CFSE المقابلة لانقسام الخلايا المستقلة. (ب) IgG3 التعبير تبين ظهور السكان IgG3 إيجابية بعد عدة جولات من انقسام الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول المبينة أعلاه يوفر الفحص القياسية لتحليل التعبير AID وظيفة خلال تبديل طبقة من الخلايا الأولية باء الفئران. هذا البروتوكول يستخدم LPS البكتيرية للحث على التحول من الغلوبولين المناعي لIgG3 ، على الرغم من أن تتمكن من إجراء تعديلات على وسائل الإعلام للحث على تحفيز التحول إلى isotypes أخرى (موجز في الجدول 1 8 ، 9).
لاحظنا أنه ، ولأسباب مجهولة حتى الآن ، مصل العجل الجنين يمكن أن تؤثر على مستوى التحول احظ الطبقة في المختبر. فمن الأهمية بمكان أن يتم استخدام نفس العدد الكثير للجميع التجارب المسؤولية الاجتماعية للشركات لضمان الاتساق التجريبية. قد يكون من المفيد أيضا أن الشاشة لجنة من مصادر العجل الجنين مصل الأمثل لتحقيق التحول في معدلات المختبر. ويمكن للسلالات الفأر تؤثر أيضا على درجة من الطبقة التبديل ينظر في المختبر 10. اعتمادا على فحص في السؤال ، والتحول نماذج سيئة الفئران ، مثل الماوس SJL ، يجب أن تكون كافية لbackcrossed C57BL / 6 الخلفية لتحقيق معدلات التحول الملموس.
الخطوة قد تكون أغفلت أنني إذا لم يتم المطلوب خلية B نقية الثقافة. وحفز من خليط من خلايا الطحال لحث يزال التحول الطبقي ، على الرغم من أنه قد يؤدي إلى عدد أكبر من السكان من الخلايا غير B أفكارك. وعلاوة على ذلك ، يجب تحليل تدفق لاحقة تشمل cytometric خلية المنشأ علامة B (B220 على سبيل المثال ، CD19). يتم توفير عدة تستخدم في تنقية هذا البروتوكول بواسطة تقنيات StemCell (انظر الجدول الكواشف). ويمكن أيضا مجموعات البديل التي تستخدم في عملية تخصيب السلبية أن تستخدم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
يمكن مضان CFSE تكون مكثفة للغاية ، وبالتالي كل تجربة يتطلب مراقبة التعويض المناسب لتحليل تدفق cytometric. بالإضافة إلى ذلك ، سوف CFSE تسرب ببطء للخروج من الخلايا مما يؤدي إلى الحد من مضان العام بمرور الوقت. لهذه الأسباب ، فمن المستحسن أن جميع التجارب التي تشمل السكان unstimulated الخلية CFSE الملطخة. خلال فترة قصيرة من الزمن ، فإن هذه الخلايا لا تزال ثابتة في الثقافة ، وبالتالي يمكن استخدامها كعنصر تحكم التعويض عن CFSE والتعرف على السكان الخلية غير المتكاثرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونحن ممتنون إلى المختبر لإجراء مناقشات مفيدة مارتن. ويدعم هذا المنشور من خلال منحة من المعهد الكندي للبحوث الصحية (MOP - 89783). معتمد بواسطة كرسي أبحاث كندا جائزة الفئة الثانية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| Polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Bovine Calf Serum | Hyclone | SH30072.03 | |
| RPMI 1640 Culture Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Rat Anti-Mouse IgG3 | BD Biosciences | 553401 |
References
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
