Summary
Após a exposição de antígenos, subpopulações de células ativadas B passam por um processo conhecido como recombinação mudança de classe (CSR) para produzir isotipos de anticorpos com diferentes funções efetoras. O protocolo apresentado neste relatório explica como a RSE pode ser induzido e analisados
Abstract
Imunidade humoral é o ramo do sistema imunológico mantido por células B e mediada através da secreção de anticorpos. Após a ativação de células B, o locus da imunoglobulina sofre uma série de modificações genéticas para alterar a capacidade de ligação e função efetora de anticorpos secretados. Este processo é destacado por um evento de recombinação do genoma conhecido como recombinação classe switch (CSR), no qual o padrão isotipo de anticorpos IgM é substituído por um de IgG, IgA ou IgE. Cada isotipo possui diferentes funções efetoras tornando CSR crucial para a manutenção da imunidade.
Diversificação do lócus imunoglobulina é mediada pela enzima citidina desaminase ativação induzida (AID). Um vídeo esquemáticos descrevendo esse processo em detalhes está disponível online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). Atividade da AID e na via de RSE são comumente estudados na avaliação da função das células B e imunidade humoral em camundongos. O protocolo apresentado neste relatório apresenta um método de isolamento de células B do baço de camundongos e estimulação subseqüente com lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) para induzir a mudança para classe IgG3 (para isotipos outro anticorpo ver Tabela 1). Além disso, a coloração fluorescente de células corante carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFSE) é usado para monitorar a divisão celular de células estimuladas, um processo crucial para a mudança isotipo 1, 2.
A regulamentação da AID e do mecanismo pelo qual ocorre RSE ainda não estão claros e, portanto, em ensaios in vitro interruptor classe fornecem um método confiável para testar esses processos em vários modelos de mouse. Estes testes têm sido utilizados anteriormente no contexto da deficiência do gene usando camundongos knockout 3. Além disso, in vitro comutação de células B pode ser precedida por transdução viral para modular a expressão gênica por RNA knockdown ou expressão do transgene 4-6. Os dados desses tipos de experimentos têm impactado a nossa compreensão da atividade AID, a resolução da reação de RSE, e mediada por anticorpos de imunidade no mouse.
Protocol
Etapa I: Isolamento de células B do baço via de enriquecimento magnética
- Camundongos experimentais devem ser envelhecidos 8-12 semanas para garantir a plena maturação do sistema imunológico.
- Euthanize o mouse por deslocamento cervical e mergulhar em etanol 70%. Remoção cirúrgica do baço por fazer uma incisão através da pele e do músculo do hipocôndrio esquerdo do abdômen e corte-o em três pedaços grandes em tampão fosfato salino (PBS). Assegurar que todas as ferramentas e os reagentes são estéreis.
- Usando o final de borracha de uma seringa de 1 mL êmbolo, gentilmente amasse o baço através de um filtro de células 70 mM em PBS. Certifique-se de usar um movimento de empurrar ao invés de um movimento de moagem como a moagem pode levar à ruptura de maior (ou seja, proliferação) das células.
- Girar as células, não superior a 350 g por 5 minutos e ressuspender o sedimento em PBS. Contar as células ressuspenso utilizando um hemocitômetro.
- Prepare uma suspensão de 1x10 8 células / mL em PBS com soro de ratos normais 5% em um tubo estéril de poliestireno 5 mL com uma tampa (volume máximo de 2 mL por tubo).
- Adicionar 50 mL de EasySep Seleção rato Negative B cocktail de Enriquecimento de células para cada mL de células. Pipeta a mistura, os tubos de tampa e coloque na geladeira por 15 minutos.
- Adicionar 100 mL EasySep Cocktail Seleção Biotina para cada mL de células. Pipeta a mistura, os tubos de tampa e coloque na geladeira por 15 minutos.
- Adicionar 100 mL de EasySep nanopartículas magnéticas (garantir nanopartículas são bem misturados ea solução é homogênea) para cada mL de células. Pipeta a mistura, os tubos de tampa e coloque na geladeira por 5 minutos.
- A solução de cima para 2,5 ml com PBS e colocar em um ímã EasySep por 5 minutos. Inverter o ímã e tubo e despeje rapidamente em um tubo de poliestireno novo. Não agite o tubo como células negativamente selecionados serão magneticamente ligado às paredes do tubo.
- Para aumentar ainda mais a pureza da suspensão de células, o tubo pode ser reinserido no ímã para um adicional de 5 minutos e colocada em um novo tubo. Isto pode reduzir a recuperação das células em geral.
- B pureza celular pode ser avaliado por análise de citometria de fluxo de marcadores de superfície de células B. Após o enriquecimento, nós sempre ver uma pureza> 95% B220 células positivas.
Etapa II: A coloração celular CFSE
- Volte a suspender as células isoladas em PBS suplementado com calorosa 0,1% de soro albumina bovina a uma concentração final de 1 x 10 6 células por ml.
- Prepare uma solução estoque de 5mM CFSE (diluída em dimetil sulfóxido estéril) e adicione 2μL para cada mL de células no tubo. A concentração final de 10μM é ideal para a coloração de células B primário.
- Incubar a 37 ° C por 10 minutos no escuro (note: CFSE é sensível à luz e deve ser mantido no escuro, quando possível).
- Saciar a mancha, adicionando um volume igual de soro bovino para suas células e incubar no gelo por 5 minutos.
- Lave as células, completando-se os tubos com meio de cultura (veja a etapa III para a receita) e centrifugação a 350 g. Note-se que pelo menos 5 vezes o volume equivalente de mídia deve ser adicionado para neutralizar a viscosidade do soro bovino e para as células a produzir uma pelota.
- Lave as células duas vezes mais em meio de cultura. As células estão agora prontos para a estimulação.
Etapa III: estimulação celular com LPS
- Prepare o seu in vitro meio de cultura celular B, completando RPMI 1640 com soro bovino fetal 10% e 50 mM β-mercaptoetanol /.
- Prepare seu meio de estimulação, adicionando LPS numa concentração final de 50μg/mL. ML alíquota do meio de 125 a estimulação em cada poço de uma placa de cultura de fundo chato de 96 poços de tecido.
- Prepare suas células CFSE manchada de B em meio de cultura sem LPS na concentração final de 3,2 x 10 6 células / mL. Adicionar 125 mL da suspensão de células para os poços contendo o seu meio de estimulação e misture delicadamente por pipetagem.
- Cada poço contém agora 4 x 10 5 células em uma concentração de LPS final de 25 mcg / mL. Isto proporciona ótimos níveis de proliferação celular e mudança de classe, embora as alterações a estes valores podem ser feitas como desejado.
- Incubar as células a 37 ° C e 5% CO 2 por 72 a 96 horas. Após 48 horas, clusters de grandes células B proliferam será claramente visível ao microscópio.
Etapa IV: análise de citometria de fluxo de mudança de classe
- Quando estiver pronto para olhar para mudança de classe, remover as células de suas condições de cultura e lavá-los duas vezes em 1 mL de tampão de marcação (PBS com 2% de bovinos soro bovino).
- Para evitar que a coloração não específica de anticorpos de suas células, as células pellet girando-os em 350 g e incubaçãote-los em 100μL de coloração de buffer com soro de rato normal e 5% de 1μg FcBlock per106 células por 15 minutos no gelo. Bloqueio de celular deve ser realizada no gelo.
- Sem lavar as células, adicionar 1μg por 10 6 células de um anti-rato fluorescente etiquetado anticorpos IgG3 e permitir que as células a mancha por 30 minutos no gelo.
- Lave as células duas vezes por centrifugação e ressuspender em 200-300 mL de tampão de coloração. As células estão agora prontos para a avaliação por citometria de fluxo.
- CFSE é otimamente animado a 492 nm (por laser de argônio-ion) e emite a 517 nm. O espectro de excitação e emissão do anticorpo IgG3 é dependente de sua tintura conjugado fluorescente.
Resultados representante
Após o enriquecimento magnético, a suspensão celular deve ser semelhante a uma população homogênea de pequenas células indistinguíveis circular (Figura 1A). Após 48-72 horas de estimulação, núcleos isolados de células em proliferação alargada será claramente visível (Figura 1B). Uma grande parte das células não-proliferação aparecerá pequena e granular como eles sofrem apoptose.
A RSE pode ser normalmente detectado nos níveis mais altos entre 72 e 96 horas após a estimulação antes da maioria das células começam a morrer 7. Nesta fase, as células devem ter sido submetidos a uma série de divisões celulares com células ligado aparecer na população mais tarde células filhas. Um gráfico de fluxo representante citometria de diluição CFSE e expressão de superfície de IgG3 após 96 horas de estimulação LPS pode ser visto na Figura 2.
Tabela 1. Isotype comutação cocktails. Nota: Os valores de concentração de estimulantes são apenas recomendações. Titulações podem ser necessárias.
| Isotype desejado | Cocktail estimulação |
| IgG1and IgE | LPS (25μg/mL) e IL-4 (10 ng / mL) |
| IgG1and IgE | Anti-CD40 (10μg/mL) e IL-4 (10 ng / mL) |
| IgG2a | LPS (25μg/mL) e IFN-γ (10 ng / mL) |
| IgG2b e IgG3 | LPS (25μg/mL) |
| IgA | LPS (25μg/mL), TGF-β (2 ng / mL) e IL-5 (1,5 ng / mL) |
Figura 1. Isolamento e LPS estimulação das células B do baço. (A) magneticamente enriquecido células B esplênicas antes da estimulação LPS. (B) 48 horas após a estimulação com 25 mg / mL de LPS. As células em crescimento são vistos como clusters em um fundo de células apoptóticas e explodir.
Figura 2. Proliferação e recombinação mudança de classe após 96 horas. (A) diluição CFSE para LPS estimulou as células após 96 horas de cultura. Cada pico independente representa uma diluição de fluorescência CFSE correspondente a uma divisão celular independente. (B) a expressão IgG3 mostrando o surgimento de uma população IgG3 positivo após várias rodadas de divisão celular.
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Discussion
O protocolo descrito acima fornece um ensaio padrão para analisar a expressão de AID e função durante a mudança de classe de células primárias de B murinos. Este protocolo usa LPS bacteriano para induzir a mudança de IgM para IgG3, apesar de modificações para a mídia estimulação pode ser feita para induzir a mudança para outros isotipos (resumidos na Tabela 1 8, 9).
Temos notado que, por razões ainda desconhecidas, soro fetal bovino pode afetar o nível de classe de comutação observados in vitro. É crucial que o mesmo número de lote ser usado para todos os experimentos CSR para assegurar a consistência experimental. Também pode ser benéfico para a tela de um painel de fontes de SFB para atingir as taxas de mudança ideal em vitro. Linhagens de camundongos também pode afetar o grau de mudança de classe visto in vitro 10. Dependendo do ensaio em questão, mal comutação modelos murinos, como o mouse SJL, deve ser suficientemente backcrossed ao C57BL / 6 de fundo para atingir as taxas de mudança apreciável.
Eu passo pode ser omitido se uma cultura de células B puro não é desejada. A estimulação de uma mistura de células esplênicas ainda induzir a mudança de classe, embora possa resultar em uma população maior de apoptose não-B células. Além disso, a análise do fluxo subseqüente citometria deve incluir um marcador de células B estabelecido (por exemplo, B220, CD19). O kit de purificação utilizado neste protocolo é fornecido pelo StemCell Technologies (ver tabela reagentes). Kits alternativos que utilizam um processo de enriquecimento negativo também pode ser utilizado de acordo com as instruções do fabricante.
Fluorescência CFSE pode ser muito intenso e, portanto, cada experimento requer um controle de compensação adequada para a análise de citometria de fluxo. Além disso, CFSE lentamente vai vazar para fora das células, resultando em uma redução de fluorescência em geral ao longo do tempo. Por estas razões, é recomendado que todos os experimentos incluem uma população de células não estimuladas CFSE manchada. Durante um curto período de tempo, essas células permanecerão estáticos em cultura e pode assim ser usado como um controle de compensação para CFSE e identificar a população de células não-proliferação.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Somos gratos ao laboratório Martin para discussões úteis. Esta publicação é apoiada por uma bolsa do Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (MOP-89783). AM é apoiado por um presidente de Pesquisa do Canadá Nível II Prêmio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| Polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Bovine Calf Serum | Hyclone | SH30072.03 | |
| RPMI 1640 Culture Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Rat Anti-Mouse IgG3 | BD Biosciences | 553401 |
References
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