הזרקה תוך גולגולתי של Adeno הקשורים וקטורים ויראליים

Summary

כאן אנו מציגים את הזריקה תוך גולגולתי של וקטורים AAV תיוג הניאון של גליה נוירונים בקליפת המוח הראייתית.

Abstract

הזרקה תוך גולגולתי של וקטורים ויראליים שהונדסו חלבון פלואורסצנטי היא טכניקה תיוג תכליתי עבור להדמיה של תת מסוימים של תאים באזורים שונים במוח הן in vivo ו בסעיפים המוח. בניגוד הזרקה של צבעי ניאון, תיוג ויראלי מציעה המיקוד של סוגי תאים בודדים הוא זול יותר זמן רב יותר מאשר הקמת קווי עכבר מהונדס. בטכניקה זו, adeno הקשורים וקטור ויראלי (AAV) מוזרק intracranially באמצעות קואורדינטות stereotaxic, micropipette ואת משאבת אוטומטיות למסירה מדויקת של AAV לאזור הרצוי עם נזק מינימלי לרקמות שמסביב. פרמטרים של הזרקה ניתן להתאים את הניסויים הפרט על ידי התאמת גיל החיה בקצב הזרקה, מיקום הזריקה, עוצמת הזריקה, של הזרקה, AAV סרוטיפ ואת האמרגן נהיגה ביטוי גנים. בהתאם לתנאי הנבחר, virally-Induced ביטוי transgene יכול לאפשר ויזואליזציה של קבוצות של תאים, תאים בודדים או תהליכים תאיים בסדר, עד לרמה של הקוצים הדנדריטים. הניסוי שמוצג כאן מציג זריקה של AAV פעמיים תקועים לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק עבור תיוג של גליה נוירונים בקליפת המוח החזותית העיקרי בעכבר.

Protocol

1. וירוס טיפול ואחסון

1. הגנה נכונה טכניקות הטיפול יש לבחור בהתבסס על רמת בטיחות ביולוגית של הנגיף לשמש. שיטות אלה ניתן למצוא biosafety במהדורה מיקרוביולוגי ביו 5 ^th מעבדות, באתר האינטרנט של ה-CDC
   ( http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm ). השימוש וקטורים AAV מאושר biosafety רמה 1 (BSL-1). לצורך הניסוי שמוצג כאן, חלוק מעבדה וכפפות יהיה שחוק כאשר טיפול וירוס, בהתאם לנהלים לטיפול BSL-1 סוכנים.
2. כדי לשמר את הפעילות של הנגיף עדיף לחלק אותו aliquots קטן כדי למנוע הקפאת חוזרות הפשרה.
3. הכן הקבינט biosafety (BSC) Class II עבור aliquoting וירוס ידי ניקוי BSC של חפצים מיותרים לחיטוי את פני השטח עם EtOH 70%. מניחים כוס המכילה פתרון אקונומיקה 10% למכסה המנוע לאיסוף AAV-מזוהמים בפסולת. להציב גם BSC הם צינורות 0.5mL סטרילית מיכל של קרח יבש.
4. הפשירי מניות ויראלי על הקרח מחוץ BSC.
5. וורטקס הנגיף ופתח את הצינור הפנימי BSC.
6. פיפטה נפח aliquot הרצוי (למשל 5 μL) לתוך צינור 0.5mL, לסגור את הצינור ולשים אותו בקרח יבש יקפיא את הנגיף.
7. כאשר כל וירוס כבר aliquoted, להיפטר הצינור וירוס טיפים פיפטה במיכל פסולת המכילה אקונומיקה 10%.
8. הסר את מיכל הפסולת מכסה המנוע להוסיף אקונומיקה 10% נוספים, ואז לשפוך אקונומיקה בכיור. השליכו פסולת פלסטיק במיכל Biohazard כפי שהורה הקצין מכון שלך biosafety.
9. נקה כל ציוד או משטחים כי בא במגע עם הנגיף עם אקונומיקה 10%. בטל כפפות.
10. חנות aliquots למקפיא -80 מעלות צלזיוס.

2. כירורגיה

1. מכסים את אזור הניתוח עם נייר סופג מעבדה הספסל. כלים כירורגיים צריך להיות מעוקר ניתוח נעשה בתנאים aseptic בהתאם biosafety המוסד שלך והנחיות לשימוש בבעלי חיים.
2. בחר אזור הסמוך לאזור כירורגית אשר יוקדש טעינת micropipettes בווירוס, ולכסות עם נייר סופג מעבדה הספסל. הצב aliquot של הנגיף במיכל קרח באזור זה, ולאפשר הנגיף להפשיר על הקרח כמו הניתוח מתבצע.
3. הגדרת מיכל פסולת של 10% אקונומיקה באזור וירוס ייעודי לטיפול עבור סילוק טיפים פיפטה, וכו 'כי בא במגע עם הנגיף.
4. משוך micropipette Wiretrol זכוכית בקוטר טיפ של כ 20 מיקרון. המקום טיפה קטנה של שמן מינרלי בקצה הקהה של micropipette והכנס את הבוכנה חוט מסופק עם micropipettes.
5. אבטח את micropipette בתוך מלחציים של הזרוע micropump.
6. הזרק עכבר תת עורי עם עצירות במינון של 0.5 מ"ג / ק"ג. להרדים את העכבר עם Avertin באמצעות הזרקה intraperitoneal עם מינון של 200 מ"ג / ק"ג ולהסיר את השיער מהחלק העליון של הראש עם מספריים כירורגיות, מוודא להשאיר שוליים גדולים מספיק כדי למנוע שיער מלהיכנס את החתך.
7. צרף שמיכה חימום לבסיס stereotax לשמור על טמפרטורת גוף של 37 מעלות צלזיוס במשך הניתוח לאבטח את העכבר על stereotax.
8. לרחוץ את הראש עם שלושה עלובי לסירוגין של אתנול בבטאדין לחטא את האזור.
9. מניחים ירידה של משחה עין Tobradex על כל עין כדי לשמור על עיניים לחות במהלך הניתוח.
10. עושים חתך לאורך קו האמצע של הראש למשוך את העור לאחור כדי לחשוף את הגולגולת.
11. הסר בזהירות את fascia מהגולגולת באמצעות קנס שקצהו מלקחיים.
12. אתר את האזור להיות מוזרק באמצעות קואורדינטות stereotaxic ולסמן את הגולגולת עם עט כירורגית.
13. בעזרת מקדח דנטלי עם אזור 1.4mm בר, דקה של הגולגולת כ 2 מ"מ בקוטר עד סדקים בגולגולת, חלוקת שטח דליל למקטעים שונים.
14. במהלך הליך זה, לשמור על הגולגולת לח עם יישומים של תמיסת מלח סטרילית.
15. בצע craniotomy בעדינות על ידי הסרת חלקי הגולגולת באמצעות דליל במיוחד קנס מלקחיים מוטה.

3. הזרקת הכנה

1. עם KimWipe להציב מעל המכסה, פתח את הצינור של וירוס פיפטה 1.5uL (להזרקה 1uL) של הנגיף על חתיכה קטנה של parafilm.
2. הניחו את קצה micropipette לתוך המניה ויראלי ידני למשוך את הבוכנה. אם הקושי הוא מנוסה ציור מניות נגיפי אל תוך micropipette, הטיפ יכול להיות מוגדל מעט להיות פירסינג KimWipe עם micropipette לשבור חלק קטן של זכוכית.
3. זרוע micropump תחתון על הבוכנה עד כמות קטנה של וירוס הוא הפיג מקצה micropipette. הסר ירידה קטנה עם המוליך כותנה טיפ המוליך להשליך על wastמיכל דואר.
4. למרוח טיפת שמן מינרלי אל קצה micropipette כדי למנוע סתימת כמו micropipette מונמך לתוך המוח.

4. הזרקת וירוס

1. שימוש ב X ו-Y stereotaxic קואורדינטות, עמדת micropipette על השטח להיות מוזרק. בניסוי זה, stereotaxic את הקואורדינטות משמש לאיתור קליפת המוח החזותית העיקריים הם האחורי 2.7mm ל 2.5mm גבחת ו לרוחב קו האמצע. לאט לאט להוריד את micropipette (בקצב משוער של 1mm/1minute) לתפקיד Z הנכון.
2. הזן את הפרמטרים הרצויים הזרקה לתוך תיבת Micro4 בקר micropump SYS וליזום את הזריקה. לצורך ניסוי זה, 1 microliter מעל 10 דקות ישמש בשיעור של זריקה.
3. כאשר הוא סיים את הזריקה, לעזוב את פיפטה לנוח 1-2 דקות כדי למנוע בזרימת של הנגיף במהלך ההסרה. לאחר תקופה זו, לאט לאט להסיר את micropipette מהמוח (שיעור זהה לזה לעיל).
4. תפר את הקרקפת ואת החותם אותו עם דבק רקמות. הזרק את החיה מתחת לעור עם עצירות במינון של 0.1 מ"ג / ק"ג כל 8-12 שעות במשך 72 השעות הבאות, או כל עוד בעל החיים הוא מציג סימנים של כאב. אפשר לשחזר את החיה מתחת לפנס חום עד שהוא ambulating ומוכן להחזיר את הכלוב שלה. ניסויי הדמיה יכול להיות יזם לאחר זמן דגירה הרצוי (ימים עד שבועות לאחר ההזרקה נגיפי).

5. ניקוי

1. שוטפים את micropipette עם אקונומיקה 10% וזורקים אותו במיכל החדים.
2. השלך את מיכל הפסולת באותו אופן כמו בסעיף 1.
3. בטל ספסל נייר מעבדה לפח Biohazard ולנגב את כל המשטחים ומכשירים שייתכן לבוא במגע עם הנגיף עם אקונומיקה 10%.
4. הווירוס יכול להיות בשימוש קפוא שוב, תוך התחשבות כי חזר להקפיא / להפשיר מחזורים לגרום השפלה של הנגיף.

6. נציג תוצאות

באיור 1. Transduced נוירון לאחר הזרקה של פעמיים תקועים adeno הקשורים וירוס סרוטיפ 1 (dsAAV S1) נושאת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטה של promotor CMV. גוף התא, כמו גם הדנדריטים הפרוקסימלית ומ דיסטלי גלויים לעין בסעיפים קבוע צילמו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent. בר סולם = 100 מיקרומטר.

איור 2. תיוג אופייני זריקה וירוס תוך גולגולתי בקליפת הראייה העיקרית באמצעות S1 dsAAV מראה את מידת התפשטות הנגיף, כמו גם נוירונים שכותרתו, גליה ותהליכים. בר סולם = 250 מיקרומטר.

איור 3. תיוג של תאים בהיפוקמפוס באמצעות S1 dsAAV. בר סולם = 250 מיקרומטר. נתונים אלה מעובדים Lowery et al. 2009 ¹

Discussion

Virally בתיווך משלוח גן בעל פוטנציאל גדול למחקר של תהליכים נוירולוגיות וטיפול בהפרעות במוח ^1,2,3. צדדיות הגדול של טכניקה זו יכולה גם להיות מנוצלת כדי fluorescently תווית תאים הדמיה הן במבחנה in vivo ^4. כאן אנו מדגימים נוהל מפורט עבור התמרה של נוירונים גליה בעכבר קליפת המוח החזותית באמצעות פעמיים תקועים adeno אסוציאציה וירוס להביע משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק.

בעוד טכניקה זו היא יחסית ישר קדימה, יש מספר פרטים טכניים שצריכים להילקח בחשבון. אחד השיקולים החשובים הוא הזרקה-Induced נזק לרקמות - ולכן הוא חיוני כדי להשתמש בזהירות רבה במהלך הניתוח ואת הכניסה / הסרת micropipette. הניתוח נכשל עלול להביא שינוי של מבנים להיות צילמו. בנוסף, לאחר טעינת הוירוס לתוך micropipette, בזהירות רבה יש לנקוט כדי לנקות את כל בועות האוויר בקצה פיפטה ולהבטיח את נפח תקין מוזרק. הפחתת micropipette מעט מעבר ליעד Z-לתאם אז נסיגה אותו במקום הנכון יכולה למנוע מהווירוס גדותיו מתוך הזריקה. בעת בחירת זמן דגירה, המאפשר זמן מספיק לצורך ביטוי גנים נגיפיים צריך להיחשב. זה ישתנה בהתאם הנגיף בשימוש. התגובה החיסונית מוגבל עשוי להיות שהושרו על ידי הזריקה. מניסיוננו, דלקת זו מוגבלת בדרך כלל כדי לעקוב אחר המחט יכול להימנע על ידי הדמיה הרחק מן העין את הזריקה (כ 50 μms או יותר). לבסוף, אם חלקים במוח יש רכוב על שקופיות, להשתמש במדיום הרכבה antifade הוא הציע לקיים פלואורסצנטי.

הזרקה תוך גולגולתי של וקטורים ויראליים יש יתרונות טכניים על מספר טכניקות תיוג אחרים. באמצעות שימוש קואורדינטות stereotaxic נפח ויסות מוזרק, פלורסנט התווית יכול להיות מקומי בדיוק לאזור של עניין. כמות התמרה ניתן לשנות על ידי התאמת מוזרק בנפח, titer וירוס או את זמן ההישרדות, המאפשר ויזואליזציה של או קבוצות של תאים או תאים בודדים. בנוסף, השימוש של וירוסים שונים (למשל, lentivirus הרפס וירוס, adenovirus) יכול גם לווסת את העיתוי והכמות של חלבון פלואורסצנטי לידי ביטוי, כמו גם את סוגי התאים הממוקדים. בסך הכל, טכניקה זו יכולה לספק עבור תיוג מאוד תכליתי של גורמים שונים במוח הדמיה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
St–lting Mouse and Neonatal Rat Adaptor	Stoelting Co.	51625	Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm	Fine Science Tools	14084-08
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved	Fine Science Tools	11152-10
Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled	Fine Science Tools	11251-35	Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm	Fine Science Tools	11000-12
Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece	Ram Products, Inc.	TECH2000ON/OFF	Dental drill
Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter	Fine Science Tools	19008-14
Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul	VWR international	5-000-1001 or 53480-287
Mineral oil	VWR international	29447-338
Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed)	World Precision Instruments, Inc.	M3301-M3-R	Used for determining stereotaxic co-ordinates
UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller	World Precision Instruments, Inc.	UMP3-1
Sutures	VWR international	95056-952
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Tobradex			Available from your institution’s veterinary services