Summary
यहाँ हम दृश्य प्रांतस्था में न्यूरॉन्स और glia के फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए AAV वैक्टर intracranial इंजेक्शन उपस्थित थे.
Abstract
वायरल के लिए एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त इंजीनियर वैक्टर intracranial इंजेक्शन दोनों vivo में और मस्तिष्क वर्गों में अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में कोशिकाओं के विशिष्ट सबसेट के दृश्य के लिए एक बहुमुखी लेबलिंग तकनीक है. फ्लोरोसेंट रंजक के इंजेक्शन के विपरीत, वायरल लेबलिंग अलग - अलग सेल प्रकार का लक्ष्य प्रदान करता है और कम खर्चीला और समय ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की स्थापना की तुलना में काफ़ी है. इस तकनीक में एक एडिनो जुड़े वायरल सदिश (AAV) intracranially आसपास के ऊतकों को न्यूनतम क्षति के साथ वांछित क्षेत्र में stereotaxic निर्देशांक, एक micropipette और AAV की सटीक प्रसव के लिए एक स्वचालित पंप का उपयोग करने के लिए अंतःक्षिप्त है. इंजेक्शन मापदंडों इंजेक्शन के इंजेक्शन, इंजेक्शन स्थान, इंजेक्शन की मात्रा, दर, AAV सीरोटाइप और जीन अभिव्यक्ति ड्राइविंग प्रमोटर जानवरों की उम्र का समायोजन करके अलग - अलग प्रयोगों के लिए सिलवाया किया जा सकता है. चुना शर्तों पर निर्भर करता है, virally प्रेरित transgene अभिव्यक्ति कोशिकाओं, व्यक्तिगत कोशिकाओं या ठीक सेलुलर प्रक्रियाओं के समूहों के दृश्य, वृक्ष के समान spines के स्तर के नीचे की अनुमति कर सकते हैं. यहाँ दिखाया प्रयोग डबल असहाय AAV माउस प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था में न्यूरॉन्स और glia की लेबलिंग के लिए हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त का एक इंजेक्शन दर्शाया गया है.
Protocol
1. वायरस हैंडलिंग और भंडारण
- उचित संरक्षण और हैंडलिंग तकनीकों के लिए इस्तेमाल किया जा वायरस की जैव सुरक्षा स्तर पर आधारित चुना जाना चाहिए. इन पद्धतियों सूक्ष्मजीवविज्ञानी और बायोमेडिकल लेबोरेटरीज 5 वां संस्करण, सीडीसी वेबसाइट पर उपलब्ध में जैवसुरक्षा में पाया जा सकता
( http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm ). AAV वैक्टर उपयोग जैवसुरक्षा स्तर 1 (BSL-1) के लिए मंजूरी दे दी है. के लिए प्रयोग यहाँ दिखाया गया है, एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने जब वायरस से निपटने पहना जा BSL एक एजेंट से निपटने के लिए प्रक्रियाओं के साथ अनुसार,. - वायरस की गतिविधि के संरक्षण के लिए यह सबसे अच्छा है यह छोटे aliquots में विभाजित करने के लिए दोहराया ठंड और विगलन से बचने के.
- जैवसुरक्षा मंत्रिमंडल (बीएससी) द्वितीय श्रेणी को किसी भी अनावश्यक वस्तुओं के BSC समाशोधन और 70% EtOH के साथ सतह स्टरलाइज़ द्वारा वायरस aliquoting के लिए तैयार करें. AAV दूषित अपशिष्ट इकट्ठा करने के लिए हुड में एक 10% ब्लीच समाधान युक्त बीकर रखें. इसके अलावा बीएससी में रखा जाता है बाँझ 0.5ml ट्यूबों और सूखी बर्फ की एक कंटेनर है.
- BSC बाहर बर्फ पर वायरल शेयर पहले गला लें.
- भंवर वायरस और BSC अंदर ट्यूब खुला.
- एक 0.5ml ट्यूब में वांछित विभाज्य मात्रा (5 जैसे μL) पिपेट, ट्यूब बंद करें और इसे करने के लिए सूखी बर्फ में जगह वायरस फ्लैश फ्रीज.
- जब सभी वायरस aliquoted किया गया है, वायरस ट्यूब और बर्बाद 10% ब्लीच युक्त कंटेनर में विंदुक युक्तियाँ के निपटान.
- हुड से बर्बाद कंटेनर निकालें और अतिरिक्त 10% ब्लीच जोड़ने, तो सिंक के नीचे ब्लीच डालना. एक biohazard कंटेनर में प्लास्टिक कचरे के निपटान के रूप में अपने संस्थान जैव सुरक्षा अधिकारी द्वारा निर्देश दिए.
- साफ किसी भी उपकरण या सतहों कि 10% ब्लीच के साथ वायरस के साथ संपर्क में आया. दस्ताने त्यागें.
- -80 ° सी फ्रीजर में स्टोर aliquots.
2. सर्जरी
- शोषक प्रयोगशाला बेंच कागज के साथ शल्य चिकित्सा के क्षेत्र को कवर. सर्जिकल उपकरण और निष्फल होना चाहिए और अपनी संस्था के जैव सुरक्षा और पशु दिशानिर्देशों का उपयोग करें के अनुसार में सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत सर्जरी किया.
- शल्य चिकित्सा क्षेत्र है कि वायरस के साथ लोड हो रहा है micropipettes समर्पित किया जाएगा करने के लिए आसन्न क्षेत्र चुनें, और यह शोषक प्रयोगशाला बेंच कागज के साथ कवर. इस क्षेत्र में बर्फ का एक कंटेनर में वायरस का एक विभाज्य प्लेस, और वायरस पर बर्फ पिघलना करने के लिए के रूप में शल्य चिकित्सा प्रदर्शन किया जा रहा है की अनुमति.
- विंदुक युक्तियाँ, आदि के निपटान है कि वायरस के संपर्क में आने के लिए समर्पित वायरस से निपटने के क्षेत्र में 10% ब्लीच का एक बेकार कंटेनर सेटअप.
- लगभग 20 microns के एक टिप व्यास के लिए एक गिलास Wiretrol micropipette खींचो. Micropipette की कुंद छोर पर एक खनिज तेल की एक छोटी सी बूंद प्लेस और तार micropipettes के साथ प्रदान सवार सम्मिलित.
- Micropump हाथ के दबाना में micropipette सुरक्षित.
- 0.5 मिलीग्राम / किलो की एक खुराक पर buprenorphine साथ एक माउस subcutaneously इंजेक्षन. Intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से 200 मिलीग्राम / किग्रा की एक खुराक के साथ Avertin के साथ माउस और anesthetize शल्य कैंची के साथ सिर के ऊपर से बालों को हटाने, करने के लिए काफी बड़ा चीरा में प्रवेश करने से बालों को रोकने हाशिये छोड़ सुनिश्चित करने के.
- Stereotax के आधार पर एक गर्म कंबल संलग्न करने के लिए 37 ° सी सर्जरी भर के एक शरीर का तापमान बनाए रखने और stereotax में माउस सुरक्षित.
- इथेनॉल और क्षेत्र बाँझ betadine के तीन बारी scrubs के साथ सिर स्नान.
- Tobradex आँख मरहम की सर्जरी के दौरान आंखों को नम रखने के लिए प्रत्येक आँख पर एक बूंद रखें.
- सिर के midline नीचे एक चीरा और त्वचा वापस खींचने के लिए खोपड़ी को बेनकाब.
- ध्यान ठीक इत्तला दे दी संदंश का उपयोग खोपड़ी से प्रावरणी हटा दें.
- क्षेत्र का पता लगाएँ stereotaxic निर्देशांक का उपयोग इंजेक्शन जा और एक शल्य कलम के साथ खोपड़ी निशान.
- एक 1.4mm गड़गड़ाहट, खोपड़ी दरारें जब तक व्यास में पतली खोपड़ी लगभग 2mm के एक क्षेत्र के साथ एक दंत ड्रिल का प्रयोग, thinned क्षेत्र को कई खंडों में विभाजित.
- इस प्रक्रिया के दौरान खोपड़ी बाँझ खारा के अनुप्रयोगों के साथ नम रखने.
- धीरे thinned खोपड़ी अतिरिक्त ठीक इत्तला दे दी संदंश का उपयोग क्षेत्रों को हटाने के द्वारा एक craniotomy प्रदर्शन.
3. इंजेक्शन तैयार
- ढक्कन पर रखा KimWipe के साथ, parafilm का एक छोटा सा टुकड़ा पर वायरस के वायरस और विंदुक 1.5uL (एक 1uL इंजेक्शन के लिए) की ट्यूब खुला.
- वायरल शेयर में micropipette के टिप प्लेस और मैन्युअल सवार वापस लेने. यदि कठिनाई micropipette में वायरल शेयर ड्राइंग का अनुभव है, टिप थोड़ा micropipette कांच के एक छोटे से हिस्से को तोड़ने के साथ एक KimWipe भेदी होने के लिए विस्तारित किया जा सकता है.
- लोअर सवार पर वायरस की एक छोटी राशि तक micropump हाथ micropipette की नोक से dispelled है. एक कपास टिप applicator और wast में त्यागें applicator के साथ इस छोटी सी बूंद निकालेंई कंटेनर.
- खनिज तेल के रूप micropipette मस्तिष्क में उतारा है clogging रोकने के micropipette की नोक के लिए ड्रॉप लागू करें.
4. वायरस इंजेक्शन
- एक्स और वाई stereotaxic निर्देशांक का प्रयोग, इंजेक्शन क्षेत्र पर micropipette स्थिति. इस प्रयोग में, stereotaxic प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया निर्देशांक bregma 2.7mm पीछे और 2.5mm midline के लिए पार्श्व हैं. बहुत धीरे धीरे micropipette उचित Z स्थिति के लिए (1mm/1minute की एक अनुमानित दर पर) कम है.
- SYS Micro4 micropump नियंत्रक बॉक्स में वांछित इंजेक्शन पैरामीटर दर्ज करें और इंजेक्शन आरंभ. इस प्रयोग के लिए 10 मिनट से अधिक 1 microliter इंजेक्शन की दर के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा.
- जब इंजेक्शन समाप्त हो गया है, पिपेट छोड़ने के लिए एक - दो मिनट को हटाने के दौरान वायरस के तपका को रोकने के लिए आराम. इस अवधि के बाद, बहुत धीरे धीरे मस्तिष्क (ऊपर के रूप में एक ही दर) से micropipette हटाने.
- सीवन खोपड़ी और यह गोंद के साथ ऊतक मुहर. पशु buprenorphine साथ अगले 72 घंटे में 0.1 मिलीग्राम / किग्रा हर 8-12 घंटे की एक खुराक पर subcutaneously इंजेक्षन, या के रूप में जानवर के रूप में लंबे समय से दर्द के लक्षण प्रदर्शित है. जानवर एक गर्मी दीपक के तहत ठीक करने के लिए जब तक यह ambulating है और अपने पिंजरे में लौट बनने के लिए तैयार की अनुमति दें. इमेजिंग प्रयोगों वांछित ऊष्मायन समय (वायरल इंजेक्शन के बाद सप्ताह के दिन) के बाद शुरू किया जा सकता है.
5. सफाई
- 10% ब्लीच के साथ micropipette कुल्ला और यह एक sharps कंटेनर में त्यागें.
- धारा 1 के रूप में एक ही तरीके में बर्बाद कंटेनर को फेंक.
- Biohazard बिन में प्रयोगशाला बेंच कागज त्यागें और नीचे सभी सतहों और उपकरणों कि 10% ब्लीच के साथ वायरस के साथ संपर्क में आया हो सकता है है मिटा.
- अप्रयुक्त वायरस फिर से जमे हुए किया जा सकता है, को ध्यान में रखते हुए कि दोहराया / फ्रीज पिघलना चक्र वायरस के कारण गिरावट.
6. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 डबल असहाय एडिनो - जुड़े वायरस एक सीरोटाइप (dsAAV S1) सीएमवी promotor के नियंत्रण के तहत हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) ले जाने के इंजेक्शन के बाद न्यूरॉन Transduced. सेल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से शरीर प्रॉक्सिमल और डिस्टल dendrites तय वर्गों में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं एक epifluorescent खुर्दबीन का उपयोग imaged. स्केल बार = 100 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 2 dsAAV वायरल प्रसार की हद तक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लेबल न्यूरॉन्स, glia और प्रक्रियाओं दिखा S1 का उपयोग प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था में एक intracranial वायरस के इंजेक्शन के विशिष्ट लेबल. स्केल बार = 250 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 3 dsAAV S1 का उपयोग कर हिप्पोकैम्पस में कोशिकाओं का लेबल. स्केल बार = 250 सुक्ष्ममापी. ये आंकड़े Lowery एट अल से अनुकूलित कर रहे हैं. 2009 1
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Discussion
Virally की मध्यस्थता जीन डिलीवरी स्नायविक प्रक्रियाओं और मस्तिष्क 1,2,3 विकारों के उपचार के अध्ययन के लिए महान क्षमता रखती है . इस तकनीक के महान बहुमुखी प्रतिभा भी fluorescently दोनों इन विट्रो में और vivo में 4 इमेजिंग के लिए कोशिकाओं लेबल शोषण किया जा सकता है . यहाँ हम न्यूरॉन्स और माउस दृश्य प्रांतस्था में glia एक डबल असहाय एडिनो - संघ बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त वायरस का उपयोग के पारगमन के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदर्शित करता है.
हालांकि इस तकनीक अपेक्षाकृत सीधे आगे है, वहाँ तकनीकी जानकारी है कि विचार किया जाना चाहिए की एक संख्या हैं. एक महत्वपूर्ण कारक इंजेक्शन प्रेरित ऊतकों को नुकसान है - इसलिए यह सर्जरी और सम्मिलन / micropipette को हटाने के दौरान काफी सावधानी उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक असफल सर्जरी imaged किया जा संरचनाओं के परिवर्तन में परिणाम सकता है. इसके अतिरिक्त, micropipette में वायरस को लोड करने के बाद, महान देखभाल विंदुक नोक पर किसी भी हवाई बुलबुले स्पष्ट और सुनिश्चित करें कि उचित मात्रा इंजेक्शन है लिया होना चाहिए. थोड़ा लक्ष्य से परे micropipette कम Z-समन्वय तो यह उचित स्थिति को वापस लेने के इंजेक्शन साइट के बाहर बह निकला से वायरस को रोका जा सकता है. वायरल जीन की अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त समय चाहिए, जब एक ऊष्मायन समय चुनने की अनुमति पर विचार किया जा. यह प्रयोग किया जाता वायरस के आधार पर अलग अलग होंगे. एक सीमित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया इंजेक्शन द्वारा हासिल किया जा सकता है. हमारे अनुभव में, यह सूजन आम तौर पर सुई ट्रैक के लिए प्रतिबंधित है और इमेजिंग से बचा जा सकता इंजेक्शन दृष्टि (लगभग 50 μms या अधिक) से दूर. अन्त में, अगर मस्तिष्क वर्गों के लिए स्लाइड्स पर रखा जा रहे हैं, एक antifade बढ़ते मध्यम के उपयोग प्रतिदीप्ति बनाए रखने का सुझाव दिया है.
वायरल vectors के intracranial इंजेक्शन अन्य लेबलिंग तकनीक पर कई तकनीकी फायदे हैं. Stereotaxic निर्देशांक और modulating के इंजेक्शन मात्रा के उपयोग के माध्यम से, फ्लोरोसेंट लेबल ठीक ब्याज की एक क्षेत्र के लिए स्थानीयकृत किया जा सकता है. पारगमन की राशि मात्रा इंजेक्शन, वायरस टिटर या अस्तित्व के समय को समायोजित, कक्षों या व्यक्ति की कोशिकाओं के दोनों समूहों के दृश्य के लिए अनुमति द्वारा बदला जा सकता है. इसके अतिरिक्त, अलग वायरस (जैसे lentivirus, दाद वायरस, adenovirus) का उपयोग भी समय और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की मात्रा व्यक्त के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल लक्षित प्रकार न्यूनाधिक कर सकते हैं. कुल मिलाकर, इस तकनीक इमेजिंग के लिए अलग मस्तिष्क तत्वों की बहुत बहुमुखी लेबलिंग के लिए प्रदान कर सकते हैं.
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Disclosures
जानवर और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पशु संसाधन (UCAR) पर रोचेस्टर विश्वविद्यालय समिति की इंसानियत और प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग पर PHS नीति के अनुसार विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया.
Acknowledgments
यह काम (EY012977) एनआईएच, Burroughs Wellcome कोष, व्हाइटहॉल फाउंडेशन, और स्लोअन फाउंडेशन (AKM) से जैव चिकित्सा विज्ञान में एक कैरियर पुरस्कार से अनुदान द्वारा संभव बनाया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| St–lting Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting Co. | 51625 | Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled | Fine Science Tools | 11251-35 | Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Dental drill |
| Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-14 | |
| Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul | VWR international | 5-000-1001 or 53480-287 | |
| Mineral oil | VWR international | 29447-338 | |
| Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed) | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3-R | Used for determining stereotaxic co-ordinates |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | |
| Sutures | VWR international | 95056-952 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Tobradex | Available from your institution’s veterinary services |
References
- Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet. 8, 148-154 (1994).
- Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors. Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).
- Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression. Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).
- Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors. Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).
