Summary
Hier presenteren we de intracraniële injectie van AAV-vectoren voor TL-etikettering van neuronen en glia in de visuele cortex.
Abstract
Intracraniële injectie van virale vectoren ontwikkeld om een fluorescerend eiwit tot expressie is een veelzijdige labeling techniek voor visualisatie van specifieke subsets van cellen in verschillende hersengebieden, zowel in vivo en in de hersenen secties. In tegenstelling tot de injectie van fluorescerende kleurstoffen, virale etikettering biedt targeting van individuele celtypen en is minder kostbaar en tijdrovend dan het vaststellen van transgene muis lijnen. In deze techniek wordt een adeno-geassocieerde virale (AAV) vector geïnjecteerd met behulp van intracranially stereotaxische coördinaten, een micropipet en een automatische pomp voor precieze aflevering van AAV naar het gewenste gebied met minimale schade aan het omringende weefsel. Injectie parameters kunnen worden aangepast aan de individuele experimenten door het aanpassen van het dier leeftijd bij injectie, injectie locatie, het volume van de injectie, de mate van injectie, AAV serotype en de promotor rijden genexpressie. Afhankelijk van de gekozen omstandigheden kunnen viraal geïnduceerde transgenexpressie laten visualisatie van groepen cellen, individuele cellen of fijne cellulaire processen, tot op het niveau van de dendritische spines. Het experiment hier getoond toont een injectie van double-stranded AAV uiten van groen fluorescerend eiwit voor de etikettering van neuronen en glia in de muis primaire visuele cortex.
Protocol
1. Virus Hantering en opslag
- Een goede bescherming en handling technieken moeten worden gekozen op basis van het bioveiligheidsniveau van het virus te worden gebruikt. Deze praktijken zijn te vinden in Bioveiligheid in Microbiologische en Biomedische Laboratories 5 e editie, beschikbaar op de website van CDC
( http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm ). Het gebruik van AAV vectoren is goedgekeurd voor bioveiligheid van niveau 1 (BSL-1). Voor het experiment hier wordt weergegeven, wordt een laboratoriumjas en handschoenen worden gedragen bij het hanteren van het virus, in overeenstemming met de procedures voor de behandeling van BSL-1 agenten. - Voor het behoud van de activiteit van het virus is het het beste om het te verdelen in kleine porties naar Herhaald invriezen en ontdooien te voorkomen.
- Maak een bioveiligheid Cabinet (BSC) Klasse II voor aliquoting virus door het opruimen van de BSC van onnodige voorwerpen en steriliseren van het oppervlak met 70% EtOH. Plaats een bekerglas met 10% bleekwater oplossing in de kap voor het verzamelen van AAV-verontreinigd afval. Ook geplaatst in de BSC zijn steriel 0,5 ml buizen en een container van droog ijs.
- Dooi virale voorraad op ijs buiten de BSC.
- Vortex virus en open de tube in de BSC.
- Pipetteer de gewenste hoeveelheid volume (bijv. 5 pi) in een 0,5 ml buis, sluit de buis en in de droge ijs te plaatsen flash-vries het virus.
- Als alle virus is hoeveelheden verdeeld, ontdoen van het virus buis en pipetpunten in de afvalcontainer met 10% bleekwater.
- Verwijder het afval container van de motorkap en voeg nog eens 10% bleekmiddel, en giet dan het bleekmiddel in de gootsteen. Afvoeren van plastic afval in een container biohazard volgens de instructies van de bioveiligheid van uw instituut officer.
- Reinig alle apparatuur en oppervlakken die in contact kwamen met het virus met 10% bleekwater. Gooi handschoenen.
- Bewaar aliquots in -80 ° C vriezer.
2. Chirurgie
- Bedek de chirurgische gebied met absorberend labtafel papier. Chirurgische instrumenten moeten worden gesteriliseerd en chirurgie gedaan onder aseptische omstandigheden in overeenstemming met bioveiligheid van uw instelling en het gebruik van dieren richtlijnen.
- Kies een gebied grenzend aan de chirurgische gebied dat zal worden gewijd aan het laden van de micropipetten met het virus, en dek deze af met absorberend labtafel papier. Een hoeveelheid van het virus in een container van ijs in dit gebied, en laat het virus te ontdooien op ijs als de ingreep wordt uitgevoerd.
- Opzetten van een afvalcontainer van 10% bleekmiddel in de speciale virus handling gebied voor het storten van pipetpunten, etc. die in contact komen met het virus.
- Trek een glas Wiretrol micropipet om een tip diameter van ongeveer 20 micron. Plaats een kleine druppel van minerale olie op het stompe eind van de micropipet en steek de draad plunjer die bij de micropipetten.
- Zet de micropipet in de klem van de micropomp arm.
- Subcutaan injecteren een muis met buprenorfine in een dosering van 0,5 mg / kg. Verdoven van de muis met Avertin via intraperitoneale injectie met een dosis van 200 mg / kg en verwijder het haar van de bovenkant van het hoofd met chirurgische scharen, en zorg ervoor dat de marges groot genoeg om haar te voorkomen dat de incisie te verlaten.
- Bevestig een warmte deken om de basis van een stereotax om een lichaamstemperatuur van 37 ° C gedurende de operatie te houden en de muis veilig in de stereotax.
- Baad het hoofd met drie afwisselende scrubs van ethanol en betadine om het gebied te steriliseren.
- Plaats een druppel Tobradex oogzalf op elk oog om de ogen vochtig te houden tijdens de operatie.
- Maak een incisie beneden de middellijn van het hoofd en trek de huid aan de schedel bloot te leggen.
- Verwijder voorzichtig de fascia van de schedel met behulp van fijne punt tang.
- Zoek de gebied dat moet worden geïnjecteerd met behulp van stereotaxische coördinaten en markeer de schedel met een chirurgische pen.
- Met behulp van een tandheelkundige boor met een 1,4 mm braam, dun een deel van de schedel ongeveer 2 mm in diameter tot aan de schedel scheuren, het verdelen van de verdunde gebied in meerdere segmenten.
- Gedurende deze procedure blijven de schedel vochtig met toepassingen van steriele zoutoplossing.
- Voer een craniotomie door voorzichtig het verwijderen van de verdunde schedel segmenten met behulp van extra-fijne getipt pincet.
3. Injectie Voorbereiding
- Met een KimWipe geplaatst over de deksel, opent de buis van het virus en de pipet 1.5uL (voor een 1uL injectie) van het virus op een klein stukje van Parafilm.
- Plaats de tip van de micropipet in het virale voorraad en handmatig te trekken van de zuiger. Als moeilijkheid is ervaren tekening virale voorraad in de micropipet, kan de punt vergroot worden enigszins worden piercing een KimWipe met de micropipet om een klein gedeelte van het glas te breken.
- Lagere micropomp arm op zuiger totdat er een kleine hoeveelheid van het virus is verdreven van het uiteinde van de micropipet. Verwijder deze kleine druppel met een wattenstaafje applicator en gooi applicator in zijte container.
- Breng een druppel van minerale olie aan de top van de micropipet om verstopping te voorkomen als de micropipet wordt neergelaten in de hersenen.
4. Virusinjectie
- Met behulp van X-en Y-coördinaten stereotaxische, plaatst u de micropipet over het gebied dat moet worden geïnjecteerd. In dit experiment, coördineert de stereotaxische gebruikt om de primaire visuele cortex te lokaliseren zijn 2.7mm posterior te bregma en 2,5 mm lateraal van de middellijn. Heel langzaam lager de micropipet (een geschatte snelheid van 1mm/1minute) naar de juiste Z-positie.
- Voer de gewenste injectie parameters in de SYS Micro4 micropomp controller box en start van de injectie. Voor dit experiment, zal een microliter meer dan 10 minuten worden gebruikt als een percentage van de injectie.
- Wanneer de injectie is voltooid, laat de pipet te rusten voor een-twee minuten efflux van het virus te voorkomen tijdens het verwijderen. Na deze periode, heel langzaam verwijder de micropipet van de hersenen (hetzelfde tarief als hierboven).
- Suture de hoofdhuid en verzegelt het met weefsel lijm. Subcutaan injecteren het dier met buprenorfine in een dosering van 0,1 mg / kg om de 8-12 uur in de komende 72 uur, of zo lang als het dier vertoont tekenen van pijn. Laat het dier te laten bekomen onder een warmtelamp totdat het ambulating en klaar om te worden teruggestuurd naar zijn kooi. Imaging experimenten kan worden gestart nadat de gewenste incubatie tijd (dagen tot weken na de virale injectie).
5. Schoonmaken
- Spoel de micropipet met 10% bleekwater en gooi het in een naaldencontainer.
- Afvoeren van afval container op dezelfde manier als afdeling 1.
- Gooi labtafel papier in biohazard bin en veeg alle oppervlakken en instrumenten die mogelijk in contact komen met het virus met 10% bleekwater.
- Ongebruikte virus kan opnieuw worden ingevroren, rekening houdend met dat herhaalde vries / dooi cycli afbraak van het virus kan veroorzaken.
6. Representatieve resultaten
Figuur 1. Getransduceerde neuron na de injectie van double-stranded adeno-geassocieerd virus serotype 1 (dsAAV S1) uitvoeren groen fluorescerend eiwit (GFP) onder controle van de CMV promotor. De cel zowel lichaam als proximale en distale dendrieten zijn duidelijk zichtbaar in de vaste rubrieken beeld gebracht met behulp van een epifluorescerende microscoop. Schaalbalk = 100 micrometer.
Figuur 2. Labeling typisch zijn voor een intracraniële virus injectie in primaire visuele cortex met behulp van dsAAV S1 waaruit de omvang van de virusverspreiding en gelabelde neuronen, glia en processen. Schaalbalk = 250 pm.
Figuur 3. Etikettering van cellen in de hippocampus met behulp van dsAAV S1. Schaalbalk = 250 pm. Deze cijfers zijn aangepast van Lowery et al.. 2009 1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viraal gemedieerde genafgifte biedt veel mogelijkheden voor de studie van neurologische processen en behandeling van hersenaandoeningen 1,2,3. De grote veelzijdigheid van deze techniek kan ook worden benut om fluorescent label-cellen voor het afbeelden van zowel in vitro als in vivo 4. Hier laten we zien een gedetailleerde procedure voor de transductie van neuronen en glia in de muis visuele cortex met behulp van een double-stranded adeno-vereniging virus dat versterkt groen fluorescent eiwit.
Hoewel deze techniek is relatief eenvoudig, er zijn een aantal technische details die moeten worden overwogen. Een belangrijke factor is injectie-geïnduceerde weefselschade - daarom is het cruciaal om grote voorzichtigheid te gebruiken tijdens de operatie en het inbrengen / verwijderen van de micropipet. Een mislukte operatie zou kunnen resulteren in de wijziging van de structuren worden afgebeeld. Bovendien, na het laden van het virus in de micropipet, moet grote zorg worden genomen om eventuele luchtbellen duidelijk op de pipetpunt en het juiste volume wordt geïnjecteerd te verzekeren. Het verlagen van de micropipet iets voorbij het doel Z-coördinaat dan intrekking van het naar de juiste positie kan voorkomen dat virus overlopen uit de injectieplaats. Bij het kiezen van een incubatietijd, waardoor voldoende tijd voor het virale gen-expressie moet worden overwogen. Dit zal variëren, afhankelijk van het gebruikte virus. Een beperkt immuunrespons kan worden opgewekt door de injectie. In onze ervaring, is deze ontsteking het algemeen beperkt tot de naald volgen en kan worden vermeden door beeldvorming uit de buurt van de injectie zicht (ongeveer 50 μms of meer). Ten slotte, als de hersenen secties worden gemonteerd op dia's, het gebruik van een antifade montage medium wordt voorgesteld te onderhouden fluorescentie.
Intracraniële injectie van virale vectoren heeft een aantal technische voordelen ten opzichte van andere labeling technieken. Door het gebruik van stereotaxische coördinaten en het moduleren van het geïnjecteerde volume, kan fluorescent label precies worden gelokaliseerd op een gebied van belang. De hoeveelheid transductie kan worden gewijzigd door het aanpassen van het geïnjecteerde volume, het virus titer of de overlevingstijd, waardoor voor de visualisatie van een van beide groepen van cellen of individuele cellen. Bovendien kan het gebruik van verschillende virussen (bijvoorbeeld lentivirus, herpes virus, adenovirus) ook moduleren de timing en omvang van fluorescerend proteïne uitgedrukt als de beoogde celtypen. Al met al kan deze techniek zorgen voor zeer veelzijdige etikettering van verschillende hersengebieden elementen voor imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Het dier en experimentele protocollen zijn goedgekeurd door de Universiteit van Rochester University Comite voor de Resources (UCAR) in overeenstemming met de PHS beleid inzake Humane zorg en het gebruik van proefdieren.
Acknowledgments
Dit werk werd mogelijk gemaakt door subsidies van de NIH (EY012977), een Career Award in de Biomedische Wetenschappen aan de Burroughs Wellcome Fonds, de Stichting Whitehall, en de Sloan Foundation (AKM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| St–lting Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting Co. | 51625 | Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled | Fine Science Tools | 11251-35 | Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Dental drill |
| Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-14 | |
| Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul | VWR international | 5-000-1001 or 53480-287 | |
| Mineral oil | VWR international | 29447-338 | |
| Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed) | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3-R | Used for determining stereotaxic co-ordinates |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | |
| Sutures | VWR international | 95056-952 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Tobradex | Available from your institution’s veterinary services |
References
- Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet. 8, 148-154 (1994).
- Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors. Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).
- Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression. Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).
- Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors. Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).
