Summary
Qui vi presentiamo l'iniezione intracranica di vettori AAV per la marcatura fluorescente di neuroni e glia nella corteccia visiva.
Abstract
Intracranica iniezione di vettori virali ingegnerizzati per esprimere una proteina fluorescente è una tecnica di etichettatura versatile per la visualizzazione di sottoinsiemi di cellule nelle differenti regioni del cervello sia in vivo che in sezioni cerebrali. A differenza della iniezione di coloranti fluorescenti, etichettatura virale offre targeting di tipi di cellule individuali ed è meno costoso e richiede tempo che stabilire linee di topi transgenici. In questa tecnica, un virale adeno-associato (AAV) vettore viene iniettato intracranially usando le coordinate stereotassica, una micropipetta e una pompa automatica per la consegna precisa AAV alla zona desiderata con minimo danno al tessuto circostante. Parametri di iniezione può essere adattata alle singole sperimentazioni regolando l'età degli animali a velocità di iniezione, la posizione di iniezione, il volume di iniezione, di iniezione, AAV sierotipo e il promotore di guida l'espressione genica. A seconda delle condizioni scelte, virale indotta l'espressione del transgene può permettere la visualizzazione di gruppi di cellule, cellule singole o multa processi cellulari, fino al livello delle spine dendritiche. L'esperimento qui rappresenta una iniezione di AAV a doppio filamento che esprimono la proteina fluorescente verde per l'etichettatura dei neuroni e glia nella corteccia visiva primaria del mouse.
Protocol
1. Virus Manipolazione e stoccaggio
- Adeguata protezione e le tecniche di manipolazione devono essere scelti in base al livello di biosicurezza del virus da utilizzare. Queste pratiche possono essere trovati in biosicurezza in microbiologiche e Biomedica Laboratori 5 ° edizione, disponibile sul sito del CDC
( http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm ). L'uso di vettori AAV è approvato per la Biosicurezza Livello 1 (BSL-1). Per l'esperimento mostrato qui, un camice e guanti da indossare durante la manipolazione del virus, secondo le procedure per la gestione BSL-1 agenti. - Per preservare l'attività del virus è meglio dividerlo in piccole aliquote per evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti.
- Preparare una biosicurezza Cabinet (BSC) Classe II per aliquoting virus deselezionando la BSC di tutti gli oggetti inutili e sterilizzare la superficie con il 70% EtOH. Posizionare un bicchiere contenente una soluzione di candeggina al 10% nel cappuccio per la raccolta di AAV-rifiuti contaminati. Anche messo in BSC sono sterili tubi da 0,5 ml e un contenitore di ghiaccio secco.
- Disgelo magazzino virale sul ghiaccio al di fuori del BSC.
- Vortex virus e aprire il tubo all'interno del BSC.
- Pipettare il volume aliquota desiderata (ad esempio 5 mL) in una provetta da 0,5 ml, chiudere il tubo e posizionarlo nel ghiaccio secco di flash-congelare il virus.
- Quando tutti i virus è stato aliquotati, smaltire il tubo di virus e puntali nel contenitore dei rifiuti contenente il 10% di candeggina.
- Rimuovere il contenitore dal cofano e aggiungere ulteriori candeggina al 10%, poi versare la candeggina nel lavandino. Smaltire i rifiuti in plastica in un contenitore rischio biologico secondo le istruzioni del funzionario biosicurezza del vostro Istituto.
- Pulire le attrezzature e superfici che è venuto a contatto con il virus con il 10% di candeggina. Gettare i guanti.
- Aliquote da conservare in freezer -80 ° C.
2. Chirurgia
- Coprire l'area chirurgica con carta assorbente da banco di laboratorio. Strumenti chirurgici devono essere sterilizzati e chirurgia effettuata in condizioni asettiche secondo biosicurezza del vostro istituto e le linee guida sull'uso degli animali.
- Scegliere una zona adiacente all'area chirurgica che sarà dedicata al caricamento dei micropipette con il virus, e coprire con carta assorbente da banco di laboratorio. Inserire un aliquota del virus in un contenitore di ghiaccio in questo settore, e permettono al virus di disgelo sul ghiaccio, come l'intervento è in corso.
- Installazione di un contenitore dei rifiuti del 10% candeggina nell'area dedicata trattamento del virus per lo smaltimento di puntali, ecc che vengono a contatto con il virus.
- Tirare una micropipetta Wiretrol vetro a un diametro punta di circa 20 micron. Mettere una piccola goccia di olio minerale sulla punta smussata della micropipetta e inserire lo stantuffo cavo fornito con il micropipette.
- Fissare la micropipetta nel morsetto del braccio micropompa.
- Iniettare un mouse con buprenorfina per via sottocutanea alla dose di 0,5 mg / kg. Anestetizzare il mouse con Avertin tramite iniezione intraperitoneale con una dose di 200 mg / kg e togliere i capelli dalla parte superiore della testa con le forbici chirurgiche, avendo cura di lasciare margini abbastanza grandi per evitare che i capelli di entrare l'incisione.
- Fissare una coperta riscaldamento alla base di un stereotax di mantenere una temperatura corporea di 37 ° C durante tutto l'intervento e fissare il mouse nella stereotax.
- Bagnano la testa con tre scrub alternati di etanolo e betadine per sterilizzare la zona.
- Mettere una goccia di unguento oculare Tobradex su ciascun occhio a tenere gli occhi umidi durante l'intervento.
- Fare un'incisione lungo la linea mediana della testa e tirare la pelle torna a esporre il cranio.
- Rimuovere con attenzione la fascia dal cranio con punta fine pinze.
- Individuare l'area per essere iniettato usando le coordinate stereotassica e segnare il cranio con una penna chirurgica.
- Utilizzando un trapano per l'odontoiatria a 1,4 millimetri radica, sottile una zona del cranio circa 2mm di diametro fino a quando le crepe del cranio, dividendo l'area diluito in diversi segmenti.
- In tutta questa procedura, tenere il cranio umido con le applicazioni di soluzione fisiologica sterile.
- Eseguire una craniotomia con delicatezza eliminando i segmenti cranio diluito con pinze a punta extra-fine.
3. Iniezione di preparazione
- Con un KimWipe posto sopra il coperchio, aprire il tubo da virus e pipetta 1.5uL (per una iniezione 1UL) di virus su un piccolo pezzo di parafilm.
- Posizionare la punta della micropipetta in azioni virali e ritirare manualmente lo stantuffo. In caso difficoltà disegno magazzino virale nel micropipetta, la punta può essere allargato leggermente pungente essere uno KimWipe con la micropipetta per rompere una piccola parte del vetro.
- Micropompa braccio inferiore sul stantuffo fino a quando una piccola quantità di virus è dissipato dalla punta della micropipetta. Rimuovere questa piccola goccia con un cotton-fioc e applicatore scartare in ericontenitore e.
- Applicare una goccia di olio minerale per la punta della micropipetta per evitare l'intasamento come la micropipetta è abbassato nel cervello.
4. Virus iniezione
- Utilizzo di X e Y stereotassica coordinate, la posizione del micropipetta sopra la zona da iniettare. In questo esperimento, il stereotassica coordinate utilizzato per individuare corteccia visiva primaria sono posteriori al bregma 2,7 millimetri e 2,5 mm laterale alla linea mediana. Molto lentamente abbassare la micropipetta (ad un tasso di circa 1mm/1minute) nella posizione corretta Z.
- Immettere i parametri di iniezione desiderato nel controller SYS Micro4 casella micropompa e avviare l'iniezione. Per questo esperimento, 1 microlitro in 10 minuti sarà utilizzato come un tasso di iniezione.
- Quando l'iniezione è terminata, lasciare la pipetta riposare per 1-2 minuti per evitare di efflusso del virus durante la rimozione. Dopo questo periodo, molto lentamente la micropipetta rimuovere dal cervello (tasso come sopra).
- Sutura al cuoio capelluto e sigillare con la colla dei tessuti. Iniettare l'animale con buprenorfina per via sottocutanea alla dose di 0,1 mg / kg ogni 8-12 ore per i prossimi 72 ore, o fino a quando l'animale è mostrano segni di dolore. Permettere agli animali di recuperare sotto una lampada di calore fino a quando non è deambulazione e pronto per essere restituito alla sua gabbia. Esperimenti di imaging possono essere avviate dopo il tempo di incubazione desiderato (giorni o settimane dopo l'iniezione virale).
5. Pulizia
- Sciacquare la micropipetta con il 10% di candeggina e smaltirlo in un apposito contenitore.
- Smaltire i contenitori dei rifiuti nello stesso modo come Sezione 1.
- Eliminare la carta banco di laboratorio in bin rischio biologico e pulire tutte le superfici e gli strumenti che possano essere venuti in contatto con il virus con il 10% di candeggina.
- Virus non utilizzati possono essere ricongelato, tenendo presente che ripetuti cicli gelo / disgelo causa la degradazione del virus.
6. Rappresentante Risultati
Figura 1. Trasdotte neurone dopo l'iniezione del doppio filamento del virus adeno-associato sierotipo 1 (dsAAV S1) portando la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore CMV. Il corpo della cellula e dendriti prossimale e distale sono chiaramente visibili in sezioni fisse fotografato con un microscopio epifluorescente. Barra di scala = 100 micron.
Figura 2. Etichettatura tipici di una iniezione di virus intracranica in corteccia visiva primaria con S1 dsAAV indicando la misura della propagazione virale così come neuroni marcati, glia e processi. Barra di scala = 250 micron.
Figura 3. Etichettatura delle cellule dell'ippocampo con S1 dsAAV. Barra di scala = 250 micron. Queste cifre sono adattate da Lowery et al. 2009 1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Virale mediata consegna del gene ha un grande potenziale per lo studio di processi neurologici e trattamento dei disturbi cerebrali 1,2,3. La grande versatilità di questa tecnica può anche essere sfruttato per un'etichetta fluorescente cellule per l'imaging sia in vitro che in vivo 4. Qui mostriamo una procedura dettagliata per la trasduzione di neuroni e glia nella corteccia visiva del mouse utilizzando un doppio filamento del virus adeno-associazione che esprime maggiore proteina verde fluorescente.
Mentre questa tecnica è relativamente semplice, ci sono una serie di dettagli tecnici che devono essere prese in considerazione. Un fattore importante è l'iniezione indotto danni tissutali - perciò è fondamentale usare molta cautela durante l'intervento e l'inserimento / rimozione del micropipetta. Un intervento chirurgico non può comportare l'alterazione delle strutture da acquisire. Inoltre, dopo il caricamento del virus nella micropipetta, grande cura deve essere presa per eliminare eventuali bolle d'aria sulla punta della pipetta e garantire il volume corretto viene iniettato. Abbassamento del micropipetta leggermente oltre l'obiettivo coordinata Z poi ritirarsi nella posizione corretta può prevenire virus traboccante fuori dal sito di iniezione. Quando si sceglie un tempo di incubazione, che permette un tempo adeguato per l'espressione genica virale dovrebbe essere considerato. Questa varierà in base al virus utilizzato. Una risposta immunitaria limitata può essere suscitata da iniezione. Nella nostra esperienza, questa infiammazione è generalmente limitato al percorso dell'ago e si può evitare di imaging lontano dalla vista di iniezione (circa 50 μms o più). Infine, se le sezioni del cervello devono essere montati su vetrini, l'uso di un mezzo di montaggio Antifade è suggerita per mantenere la fluorescenza.
Intracranica iniezione di vettori virali ha diversi vantaggi tecnici rispetto alle tecniche di etichettatura altri. Attraverso l'uso di coordinate stereotassiche e modulando il volume iniettato, etichetta fluorescenti possono essere localizzate con precisione ad una zona di interesse. La quantità di trasduzione può essere modificato regolando il volume di iniezione, il titolo del virus o il tempo di sopravvivenza, consentendo la visualizzazione di entrambi i gruppi di cellule o di singole celle. Inoltre, l'utilizzo di virus diversi (ad esempio lentivirus, herpes virus, l'adenovirus) può anche modulare i tempi e le quantità di proteine fluorescenti espressa così come i tipi di cellule bersaglio. Nel complesso, questa tecnica può fornire per l'etichettatura molto versatile di elementi differenti del cervello per l'imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
I protocolli di sperimentazione animale e sono stati approvati dalla University of Rochester University commissione Animal Resources (UCAR) in conformità con la Politica PHS sulla cura umanitaria ed uso di animali da laboratorio.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato reso possibile da finanziamenti del NIH (EY012977), un Premio alla Carriera nel Scienze Biomediche dal Fondo Burroughs Wellcome, la Fondazione Whitehall, e la Fondazione Sloan (AKM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| St–lting Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting Co. | 51625 | Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled | Fine Science Tools | 11251-35 | Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Dental drill |
| Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-14 | |
| Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul | VWR international | 5-000-1001 or 53480-287 | |
| Mineral oil | VWR international | 29447-338 | |
| Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed) | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3-R | Used for determining stereotaxic co-ordinates |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | |
| Sutures | VWR international | 95056-952 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Tobradex | Available from your institution’s veterinary services |
References
- Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet. 8, 148-154 (1994).
- Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors. Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).
- Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression. Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).
- Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors. Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).
