Summary
Här presenterar vi de intrakraniella injektion av AAV vektorer för fluorescerande märkning av nervceller och Glia i syncentrum.
Abstract
Intrakraniell injektion av virala vektorer konstruerad för att uttrycka en fluorescerande proteinet är en mångsidig märkning teknik för visualisering av specifika undergrupper av celler i olika områden i hjärnan både in vivo och i hjärnan sektioner. Till skillnad från injektion av fluorescerande färger, erbjuder virus märkning inriktning av enskilda celltyper och är billigare och tidskrävande än upprättandet transgen mus linjer. Med den här tekniken är en Adeno-associerad viral (AAV) vektor injiceras intracranially med stereotaxic koordinater, en mikropipett och en automatisk pump för exakt leverans av AAV till önskat område med minimal skada på omgivande vävnad. Injektion parametrar kan skräddarsys för enskilda experiment genom att anpassa djuret ålder vid injektion, injektionen plats, volym injektion, infusionshastighet, AAV serotyp och initiativtagaren körning genuttryck. Beroende på vald förhållanden kan viralt inducerad transgenen uttryck tillåter visualisering av grupper av celler, enskilda celler eller fina cellulära processer, ner till nivån Dendritutskotten. Experimentet visas här skildrar en injektion av dubbel-strängat AAV uttrycker grönt fluorescerande protein för märkning av nervceller och Glia i musens primära syncentrum.
Protocol
1. Virus Hantering och lagring
- Lämpligt skydd och tekniker hantering bör väljas utifrån biosäkerhetsnivån av viruset som ska användas. Dessa metoder kan hittas i biosäkerhet i mikrobiologiska och biomedicinska laboratorier 5: e upplagan, tillgänglig på CDC webbplats
( http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm ). Användningen av AAV vektorer är godkänd för Biosafety Level 1 (BSL-1). För experimentet visas här kommer en skyddsrock och handskar ska användas vid hantering av viruset, i enlighet med rutiner för hantering av BSL-1 agenter. - För att bevara verksamheten av viruset är det bäst att dela upp det i små portioner för att undvika upprepad frysning och upptining.
- Förbered en biosäkerhet skåp (BSC) Klass II för alikvotering virus genom att rensa BSC av onödiga föremål och sterilisera ytan med 70% EtOH. Placera en bägare som innehåller 10% blekmedelslösning i huven för att samla in AAV-förorenat avfall. Placeras också i BSC är sterila 0,5 mL rör och en behållare med torris.
- Tina viral lager på is utanför BSC.
- Vortex viruset och öppna röret inne i BSC.
- Pipettera önskad delmängd volym (t.ex. 5 mikroliter) i ett 0,5 mL rör, förslut röret och placera den i torr-is för att flash-frysa viruset.
- När alla viruset har konstaterat, att förfoga över viruset röret och pipettspetsar i avfallsbehållaren som innehåller 10% blekmedel.
- Avlägsna avfallsbehållaren från huven och lägga till ytterligare 10% blekmedel, häll sedan blekmedel i vasken. Kassera plastavfall i ett biologiskt behållare enligt instruktionen från din Institutets biosäkerhet officer.
- Rengör all utrustning eller ytor som kom i kontakt med viruset med 10% blekmedel. Släng handskar.
- Förvara alikvoter i -80 ° C frys.
2. Kirurgi
- Täck operationsområdet med absorberande lab bänk papper. Kirurgiska instrument ska steriliseras och operation görs under aseptiska förhållanden i enlighet med din institutions biosäkerhet och djur riktlinjer användning.
- Välj ett område i anslutning till det kirurgiska området som kommer att ägnas åt laddar mikropipetter med virus, och täck den med absorberande lab bänk papper. Placera en alikvot av virus i en behållare med is på detta område, och låta viruset att tina på is eftersom operationen utförs.
- Setup en papperskorg på 10% blekmedel i den särskilda virus hanteras för avsättning av pipettspetsar, etc. som kommer i kontakt med viruset.
- Dra en mikropipett glas Wiretrol till en spets diameter på cirka 20 mikrometer. Placera en liten droppe mineralolja på den trubbiga änden av mikropipett och för in kablarna kolven som följer med mikropipetter.
- Säkra mikropipett i klämman för micropump armen.
- Injicera en mus subkutant med buprenorfin i en dos på 0,5 mg / kg. Bedöva musen med Avertin via intraperitoneal injektion med en dos på 200 mg / kg och ta bort hår från toppen av huvudet med kirurgisk sax, och se till att lämna marginaler tillräckligt stor för att hindra håret från att komma in snittet.
- Bifoga en värme filt till foten av ett stereotax att hålla en kroppstemperatur på 37 ° C under hela operationen och säkra musen i stereotax.
- Bada i huvudet med tre växlande skurar av etanol och Betadine att sterilisera området.
- Placera en droppe Tobrasone ögonsalva på varje öga för att hålla ögonen fuktiga under operation.
- Gör ett snitt ner mittlinjen av huvudet och dra huden tillbaka att exponera skallen.
- Ta försiktigt bort fascian från skallen med spetsig pincett.
- Lokalisera det område som ska injiceras med stereotaxic koordinater och markera skallen med en kirurgisk penna.
- Med hjälp av en tand borrmaskin med en 1,4 mm Burr, tunna ett område i skallen ca 2 mm i diameter tills skallen spricker, dela tunnas området i flera segment.
- Under hela detta förfarande, hålla skallen fuktigt med tillämpningar av steril koksaltlösning.
- Gör en kraniotomi genom att försiktigt ta bort förtunnas skallen segment med extra fin spets pincett.
3. Injektion Förberedelser
- Med en KimWipe placerad över locket, öppna röret av virus och pipett 1.5uL (för en 1uL injektion) av virus på en liten bit av parafilm.
- Placera spetsen på mikropipett in i den virala lager och manuellt dra tillbaka kolven. Om det är svårt att dra virala lager i mikropipett kan spetsen utökas något vara piercing ett KimWipe med mikropipett för att bryta en liten del av glaset.
- Lägre micropump armen på kolven tills en liten mängd virus skingras från spetsen av mikropipetten. Ta bort denna lilla droppe med en bomull spets applikator och kasta applikatorn i Waste behållare.
- Applicera en droppe mineralolja till toppen av mikropipett för att förhindra igensättning som mikropipett sänks in i hjärnan.
4. Virus Injection
- Använda X-och Y stereotaxic koordinater, placera mikropipett över området som ska injiceras. I detta experiment samordnar stereotaxic användas för att lokalisera primära syncentrum är 2.7mm posteriort bregma och 2,5 mm i sidled med mittlinjen. Mycket långsamt sänker mikropipett (vid en ungefärlig hastighet på 1mm/1minute) till rätt Z-position.
- Ange önskad injektion parametrar i SYS Micro4 micropump controller rutan och inleda injektion. För det här experimentet kommer en mikroliter under 10 minuter kan användas som en infusionshastighet.
- När injektionen är klar, lämna pipett att vila för en-två minuter för att förhindra utflödet av virus under avlägsnande. Efter denna period, mycket sakta ut mikropipett från hjärnan (samma takt som ovan).
- Sutur hårbotten och försegla den med vävnad lim. Injicera djuret subkutant med buprenorfin i en dos på 0,1 mg / kg var 8-12 timmar under de närmaste 72 timmarna, eller så länge djuret uppvisar tecken på smärta. Låt djuret att återhämta sig under en värmelampa tills den är ambulerande och redo att skickas tillbaka till sin bur. Imaging experiment kan inledas efter önskad inkubationstiden (dagar till veckor efter virus injektion).
5. Cleanup
- Skölj mikropipett med 10% blekmedel och kasta den i en avfallsbehållare.
- Kassera avfallsbehållare på samma sätt som avsnitt 1.
- Släng papper lab bänk i biologiskt bin och torka alla ytor och instrument som kan ha kommit i kontakt med viruset med 10% blekmedel.
- Oanvända virus kan frysas igen, med tanke på att upprepad frysning / upptining orsaka nedbrytning av viruset.
6. Representativa resultat
Figur 1. Transduced neuron efter injektion av dubbel-strängat Adeno-associerad serotyp 1 (dsAAV S1) bär grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av CMV promotor. Cellkroppen och proximala och distala dendriter syns tydligt i fasta sektioner avbildas med en epifluorescent mikroskop. Skala bar = 100 ìm.
Figur 2. Märkning typiskt för en intrakraniell virus injektion i primära syncentrum med dsAAV S1 visar omfattningen av viral spridning samt märkta nervceller, Glia och processer. Skala bar = 250 ìm.
Figur 3. Märkning av celler i hippocampus med dsAAV S1. Skala bar = 250 ìm. Dessa siffror är anpassade från Lowery et al. 2009 1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viralt-medierad gen leverans innebär stora möjligheter för att studera neurologiska processer och behandling av sjukdomar i hjärnan 1,2,3. Den stora mångsidigheten hos denna teknik kan också utnyttjas för att fluorescerande etikett celler för avbildning både in vitro och in vivo 4. Här visar vi ett detaljerat förfarande för transduktion av nervceller och Glia i mus syncentrum med en dubbel-strängat Adeno-föreningen virus som uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein.
Även om denna teknik är relativt rakt fram, det finns ett antal tekniska detaljer som måste beaktas. En viktig faktor är injektion-inducerad vävnadsskador - därför är det viktigt att använda stor försiktighet under operation och insättning / borttagning av mikropipetten. En misslyckad operation kan leda till förändring av de strukturer som ska avbildas. Dessutom efter lastning viruset i mikropipett måste stor försiktighet vidtas för att klara eventuella luftbubblor i pipettspetsen och god volym injiceras. Sänka mikropipett något längre än de mål Z-koordinaten sedan dra den till rätt position kan hindra viruset från överfyllda ut från injektionsstället. När du väljer en inkubationstid, vilket gör att tillräcklig tid för viral genuttryck bör övervägas. Detta kommer att variera beroende på vilken viruset. En begränsad immunsvar kan framkallas av injektion. Enligt vår erfarenhet är denna inflammation i allmänhet begränsad till nålen spår och kan undvikas genom avbildning från injektionen syn (cirka 50 μms eller mer). Slutligen, om hjärnans delar skall monteras på bilderna, använda ett antifade monteringsmedium föreslås att upprätthålla fluorescens.
Intrakraniell injektion av virala vektorer har flera tekniska fördelar jämfört med andra märkning tekniker. Genom att använda stereotaxic koordinater och modulera volymen injicerats, kan en fluorescerande etikett exakt lokaliserad till ett område av intresse. Mängden transduktion kan ändras genom att justera volymen injiceras, viruset titer eller överlevnadstid, vilket möjliggör visualisering av antingen grupper av celler eller enskilda celler. Dessutom kan användningen av olika virus (t.ex. lentivirus, herpes-virus, adenovirus) modulera också tidpunkter och belopp för fluorescerande proteinet uttrycks liksom cellens riktade typer. Sammantaget kan denna teknik ge mycket mångsidig märkning av olika hjärnans element för avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Djuret och experimentella protokoll godkändes av University of Rochester University kommittén för djurs Resources (UCAR) i enlighet med PHS Policy för mänsklig omsorg och användning av försöksdjur.
Acknowledgments
Detta arbete har möjliggjorts genom anslag från NIH (EY012977), en karriär Award i biomedicin från Burroughs Wellcome Fund, Whitehall Foundation och Sloan Foundation (AKM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| St–lting Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting Co. | 51625 | Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled | Fine Science Tools | 11251-35 | Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Dental drill |
| Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-14 | |
| Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul | VWR international | 5-000-1001 or 53480-287 | |
| Mineral oil | VWR international | 29447-338 | |
| Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed) | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3-R | Used for determining stereotaxic co-ordinates |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | |
| Sutures | VWR international | 95056-952 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Tobradex | Available from your institution’s veterinary services |
References
- Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet. 8, 148-154 (1994).
- Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors. Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).
- Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression. Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).
- Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors. Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).
