Summary
Auto-immune hypophysitis kan worden gereproduceerd bij muizen door het injecteren van een uittreksel van de muis hypofyse eiwitten.
Abstract
Auto-immuun hypophysitis is een chronische ontsteking van de hypofyse veroorzaakt of vergezeld door auto-immuniteit 1. Het is van oudsher beschouwd als een zeldzame ziekte, maar de verslaglegging is sterk toegenomen in de afgelopen jaren. Hypophysitis, in feite, ontwikkelt zich niet zelden als een "side-effect" bij patiënten met kanker die behandeld worden met antilichamen die remmende receptoren tot expressie gebracht op T-lymfocyten, zoals CTLA-4 2 en PD-1-receptoren te blokkeren. Auto-immune hypophysitis kan experimenteel worden veroorzaakt door het injecteren van muizen met hypofyse eiwitten gemengd met een adjuvans 3. In deze video artikel zullen we laten zien hoe eiwitten uit de muis hypofyse en hoe u hen voor te bereiden in een vorm die geschikt is voor het induceren van auto-immune hypophysitis in SJL muizen extract.
Protocol
Experimentele Protocol
De eerste stap in deze experimentele protocol is het verzamelen van een groot aantal van de muis hypofyse. De tweede stap is om de klieren homogeniseren om een proteïne-extract te bereiden. De derde stap is om deze eiwitten emulgeren met een vette mix.
Stap 1: Verzameling en opslag van de muis hypofyse klieren
De muis hypofyse zit aan de basis van de schedel in een depressie van het sphenoïd bot genaamd de sella turcica, zijdelings omgeven door de nervus zenuwen en naar voren door de optische chiasma. De klier bestaat uit een grotere voorkwab en kleinere posterior en intermediair lobben, en weegt gemiddeld 1,9 mg. Hypofyse worden verzameld van muizen van gemengde stammen, geslachten en leeftijden, bestemd om te worden gedood door het dier zorginstelling.
Het isoleren van de hypofyse, wordt de muis gedood, de huid boven ontleed de schedel, en de schedel bot opengesneden met een schaar. De hersenen zijn opgeheven om de hypofyse, die vervolgens wordt geïsoleerd van de omringende dura mater bloot te leggen, schepte uit de sphenoïd bot en opgeslagen in een plastic buisje op droog ijs.
In het algemeen gebruiken we 300 muis hypofyse voor een eiwit voorbereiding, een aantal dat kan worden verzameld door een persoon in 9 uur.
Zodra de collectie is voltooid, wordt de buis met de hypofyse opgeslagen bij -80 ° C tot klaar voor de volgende stap.
Stap 2. Extractie van de muis hypofyse eiwitten
- Voeg de homogenisering buffer om een 15 ml Falcon buis (catalogus geen 352.059), bewaard in een ijsbad, met behulp van 250 ul buffer voor elke 100 verzamelde hypofyse. Gebruik een buffer van ionische sterkte vergelijkbaar met degene die is fysiologisch aanwezig is in het cytoplasma van de cel (0,2 M) en van de fysiologische pH (7.4). We maken gebruik van fosfaat gebufferde zoutoplossing (0,161 M, pH 7,4), aangevuld met een proteaseremmer cocktail (Sigma-Aldrich, catalogus geen P8340-1 ml).
- Voeg de hypofyse om de buffer vlak voor homogenisering en plaats van de generator (5-mm diameter) van de Polytron homogenisator op de bodem van de Falcon buis. Homogeniseren op maximum toerental gedurende 30 seconden voorzichtig het verplaatsen van de Falcon buis op en neer terwijl het in het ijsbad. Dan rest de homogenaat op ijs gedurende 1 minuut. Herhaal de homogenisering en koeling stappen nog twee keer. Deze zachte homogenisering zou breken van de cellen en laat cytosolische eiwitten zonder verstoring van de kernen.
- Voor het verwijderen van kernen, ononderbroken weefsel en onoplosbare materialen (zoals bindweefsel en gedenatureerd eiwit-complexen), centrifuge de homogenaat bij lage snelheid (1000g) gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Breng het supernatans (nu genoemd Post-Nuclear supernatant, PNS) om een nieuw Falcon buis, zorg om te vertrekken van de pellet ongestoord, en opslaan van de PNS op het ijs.
- Resuspendeer de pellet in het oorspronkelijke volume van homogenisering buffer (250 ul buffer voor elke 100 verzamelde hypofyse), meng zoals hierboven, centrifuge zoals hierboven, en deze vervolgens samen de tweede PNS met de eerste.
- Aliquot de twee samengevoegde PNS monsters in microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 ° C tot aan de volgende stap. Dit eiwit preparaat kan worden opgeslagen bij -80 ° C, maar langzamerhand verliest zijn kracht, dus we raden om het te gebruiken binnen 6 maanden na de voorbereiding. Gebruik een kleine hoeveelheid aan het eiwit opbrengst en concentratie door de BCA assay (Pierce catalogus zonder. 23.225) en het eiwit kwaliteit door gelelektroforese te bepalen. In het algemeen krijgen we ongeveer 60 mg van het eiwit van 300 muis hypofyse in 1,5 ml van homogenisering buffer, bij een concentratie ongeveer 40 mg / ml.
Stap 3. Voorbereiding van de emulsie voor immunisatie
- Ontdooi snel de bevroren eiwit fracties die nodig zijn voor het experiment en stel de eiwit concentratie tot 20 mg / ml. Dit eiwit extract wordt geëmulgeerd 1:1 met Compleet Freund's adjuvans (CFA, Sigma F-5881) met 5 mg / ml van de warmte gedode Mycobacterium tuberculosis (Becton Dickinson, 231141). Elke muis krijgt 1 mg van de hypofyse-extract in 100 ul van de emulsie.
- Het voorbeeld dat hier gegeven wordt voor het immuniseren 10 muizen, waarbij elke muis zal worden geïnjecteerd met 100 pi van de emulsie met 1 mg van de hypofyse eiwitten. Laat twee extra muizen voor materiële schade tijdens de voorbereiding, dus gebruik 12 mg van de hypofyse eiwitten. Aspire 600 pi van de 20 mg / ml hypofyse eiwitextract beschrijven boven met behulp van een 2,5 mL Hamilton gasdicht spuit. Resuspendeer de CFA door schudden, en streven 600 pi van de CFA in de andere 2,5 ml Hamilton spuit. Hechten en zorgen voor een 22-gauge micro-emulgerende naald aan de spuit gevuld met CFA. Duw de zuiger langzaam van de CFA spuit zodanig dat de naald is gevuld met CFA, bevestig vervolgens en zet de andere uiteinde vande naald aan de spuit vol met hypofyse-extract.
- Duw de zuiger van de CFA spuit om de olie component duwen in de waterige hypofyse-extract, zodanig dat slechts een kleine hoeveelheid wordt gemengd. Duw de zuiger van de hypofyse extract spuit in de CFA spuit. Herhaal deze handeling geleidelijk verhogen van de hoeveelheid materiaal gemengd. Ga verder tot de gehele inhoud van de twee spuiten worden gemengd. U krijgt een witachtige en gelijkmatig verdeeld oplossing die de water-in-olie emulsie vertegenwoordigt.
- Nadat de emulsie is gevormd, herhaalt u de heen-en-weer gaande beweging van ten minste 500 keer om ervoor te zorgen de emulsie wordt grondig gemengd. Na de laatste mengen cyclus, de 1:1 water-in-olie emulsie is klaar voor gebruik en bevat een hypofyse eiwit concentratie van 10 mg / ml. De emulsie zal worden geïnjecteerd op dezelfde dag subcutaan in verdoofde SJL muizen, zoals beschreven in de metgezel Jupiter artikel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ondanks het feit dat de eerste patiënt met een auto-hypophysitis werd gemeld in 1962 vier, de pathogene hypofyse autoantigenen nog moeten worden geïdentificeerd 5. Diermodellen kan heel nuttig zijn om deze autoantigenen identificeren, medeplichtigheid aan de ontdekking van biomarkers die vertaalbaar zijn naar de patiëntenzorg. Dit artikel heeft aangetoond een eenvoudige procedure voor het bereiden van hypofyse eiwitten in een vorm die geschikt is voor het induceren van auto-immune hypophysitis bij proefdieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie DK080351 naar de PC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15-ml Falcon tubes | |||
| homogenization buffer | |||
| phosphate buffered saline | |||
| protease inhibitor cocktail | |||
| Polytron homogenizer | |||
| BCA assay | Pierce, Thermo Scientific | 23225 | |
| Complete Freund’s Adjuvant (CFA) | Sigma-Aldrich | F-5881 | |
| Mycobacterium tuberculosis | BD Biosciences | 231141 | |
| 2.5 mL Hamilton gastight syringe | |||
| 22-gauge micro-emulsifying needle |
References
- Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).
- Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer. J Immunother. 28, 593-598 (2005).
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).
- Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman. J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).
- Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).
