Summary
Autoimmune hypophysitis माउस पीयूषिका प्रोटीन के एक उद्धरण इंजेक्शन लगाने के द्वारा चूहों में reproduced किया जा सकता है.
Abstract
Autoimmune hypophysitis पिट्यूटरी ग्रंथि के कारण या एक autoimmunity के साथ एक जीर्ण सूजन है. यह परंपरागत एक दुर्लभ बीमारी है माना गया है लेकिन रिपोर्टिंग स्पष्ट रूप से हाल के वर्षों में बढ़ गया है. Hypophysitis, वास्तव में, अपूर्व कैंसर एंटीबॉडी कि निरोधात्मक 2 CTLA 4 और PD-1 रिसेप्टर्स के रूप में टी lymphocytes, पर व्यक्त रिसेप्टर्स ब्लॉक के साथ इलाज के रोगियों में एक "पक्ष प्रभाव" के रूप में नहीं विकसित. Autoimmune hypophysitis पीयूषिका के साथ एक सहायक 3 मिश्रित प्रोटीन के साथ चूहों को इंजेक्शन लगाने के द्वारा प्रयोगात्मक प्रेरित कर सकते हैं. हम इस वीडियो लेख में प्रदर्शन कैसे निकालने के लिए माउस पिट्यूटरी ग्रंथि और कैसे उन्हें एक SJL चूहों में autoimmune hypophysitis उत्प्रेरण के लिए उपयुक्त प्रपत्र में तैयार से प्रोटीन.
Protocol
प्रायोगिक प्रोटोकॉल
इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में पहला कदम के लिए माउस पिट्यूटरी ग्रंथि की एक बड़ी संख्या में जमा है. दूसरे चरण के लिए ग्रंथियों homogenize करने के लिए एक प्रोटीन निकालने को तैयार है. तीसरे चरण के लिए एक तेल के मिश्रण के साथ ये प्रोटीन रासायनिक पायसी है.
चरण 1: माउस पिट्यूटरी ग्रंथि का संग्रह भंडारण
माउस पिट्यूटरी ग्रंथि Sella turcica बुलाया फन्नी के आकार की हड्डी के एक अवसाद, laterally त्रिपृष्ठी और नसों ऑप्टिक chiasm द्वारा पूर्व से घिरा में खोपड़ी के आधार पर बैठता है. ग्रंथि एक बड़ा पूर्वकाल पालि और छोटे पीछे और मध्यवर्ती lobes से बना है, और औसत 1.9 मिलीग्राम पर वजन. पिट्यूटरी ग्रंथियों मिश्रित उपभेदों, लिंगों, और उम्र, जानवरों की देखभाल की सुविधा से euthanized हो किस्मत के चूहों से एकत्र कर रहे हैं.
पिट्यूटरी ग्रंथि को अलग करने के लिए, माउस euthanized है dissected खोपड़ी ऊपर त्वचा और खोपड़ी की हड्डी कैंची के साथ खुला कटौती. मस्तिष्क के पिट्यूटरी ग्रंथि है, जो फिर आसपास के dura मेटर से अलग है बेनकाब करने के लिए उठाया है, फन्नी के आकार की हड्डी के बाहर पकड़े जाते और सूखी बर्फ पर एक प्लास्टिक ट्यूब में संग्रहीत.
आम तौर पर हम एक प्रोटीन तैयारी, एक संख्या है कि 9 घंटे में एक व्यक्ति द्वारा एकत्र किया जा सकता है है के लिए 300 माउस पिट्यूटरी ग्रंथियों का उपयोग करें.
एक बार संग्रह पूरा हो गया है, पिट्यूटरी ग्रंथि युक्त ट्यूब -80 डिग्री सेल्सियस जब तक तैयार अगले कदम के लिए संग्रहीत किया जाता है.
चरण 2. माउस पीयूषिका प्रोटीन के निकालना
- एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब (352,059 कोई सूची) homogenization बफर जोड़ें एक बर्फ स्नान में रखा है, हर 100 पिट्यूटरी ग्रंथियों एकत्र के लिए बफर की μL 250 का उपयोग कर. ईओण कि physiologically सेल (0.2 एम) और शारीरिक पीएच (7.4) के cytoplasm के अंदर मौजूद है करने के लिए इसी तरह की ताकत का एक बफर का उपयोग करें. हम का उपयोग फॉस्फेट buffered खारा (0.161 एम, पीएच 7.4), एक protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल (सिग्मा Aldrich, कोई P8340 - 1ml सूची) के साथ पूरक.
- Homogenization में बस से पहले बफर करने के लिए पिट्यूटरी ग्रंथि जोड़ें, और तब (5 मिमी व्यास) Polytron homogenizer फाल्कन ट्यूब के नीचे जनरेटर जगह. 30 सेकंड के लिए अधिकतम rpm पर homogenize, धीरे फाल्कन ट्यूब ऊपर और नीचे जा रहा है जबकि यह बर्फ स्नान में रखते हुए. फिर, 1 मिनट के लिए बर्फ पर homogenate आराम करो. Homogenization दोहराएँ और ठंडा दो से अधिक बार कदम है. इस कोमल homogenization कोशिकाओं को तोड़ने के लिए और नाभिक में बाधा पहुँचा के बिना साइटोसोलिक प्रोटीन जारी करना चाहिए.
- नाभिक, अटूट ऊतक और अघुलनशील सामग्री (जैसे कि संयोजी ऊतक और विकृत प्रोटीन परिसरों के रूप में) को हटाने के लिए, कम गति (1000g) पर 10 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए homogenate अपकेंद्रित्र
- स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला (अब पोस्ट परमाणु सतह पर तैरनेवाला कहा जाता है, पीएन) एक नए फाल्कन ट्यूब देखभाल लेने के लिए गोली undisturbed छोड़, और बर्फ पर पीएन की दुकान.
- Homogenization बफर (हर 100 पिट्यूटरी ग्रंथियों एकत्र के लिए बफर के 250 μL) के मूल मात्रा में गोली Resuspend, जैसा कि ऊपर homogenize, इसके बाद के संस्करण के रूप में अपकेंद्रित्र, और तब पहले एक के साथ दूसरा पीएन गठबंधन.
- विभाज्य दो जमा -80 पर microcentrifuge ट्यूब और दुकान में पीएन नमूने ° C अगले कदम के लिए तैयार है जब तक. इस प्रोटीन की तैयारी -80 पर संग्रहीत किया जा सकता · सी लेकिन धीरे - धीरे अपनी शक्ति हारता है, तो हम इसे तैयारी से 6 महीने के भीतर उपयोग करने की अनुशंसा करते है. बीसीए परख द्वारा प्रोटीन उपज और एकाग्रता (पियर्स कोई सूची 23225.), और जेल वैद्युतकणसंचलन प्रोटीन की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए एक छोटे से विभाज्य का प्रयोग करें. सामान्य में, हम 300 माउस pituitaries से लगभग 40 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता पर homogenization में बफर के 1.5 एमएल में प्रोटीन की 60 मिलीग्राम के बारे में में प्राप्त करने के लिए,.
चरण 3. प्रतिरक्षण के लिए पायस की तैयारी
- तेजी से जमे हुए प्रयोग के लिए प्रोटीन की जरूरत aliquots पहले गला लें और 20 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन एकाग्रता को समायोजित. यह प्रोटीन निकालने पूरा Freund सहयोगी (CFA सिग्मा एफ - 5881) 5 मिलीग्राम / माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग (Becton Dickinson, 231,141) मारे गर्मी के एमएल युक्त के साथ 1:1 emulsified हो जाएगा. प्रत्येक माउस पायस के 100 μL में पिट्यूटरी निकालने के 1 मिलीग्राम प्राप्त होगा.
- 10 चूहों, जहां प्रत्येक माउस पिट्यूटरी प्रोटीन के 1 मिलीग्राम से युक्त पायस के 100 μL के साथ अंतःक्षिप्त किया जाएगा immunizing यहाँ दिए गए उदाहरण के लिए है. तैयारी के दौरान सामग्री घटाने के लिए दो अतिरिक्त चूहों की अनुमति दें, तो पिट्यूटरी प्रोटीन की 12 मिलीग्राम का उपयोग करें. 600 μL अस्पायर 20 मिलीग्राम / एमएल पिट्यूटरी प्रोटीन निकालने के एक 2.5 एमएल हैमिल्टन gastight सिरिंज का उपयोग करके उपरोक्त वर्णन. झटकों से CFA Resuspend, और एक और 2.5 एमएल हैमिल्टन सिरिंज में संघर्ष विराम समझैते को 600 μL ख्वाहिश. संलग्न हैं और सिरिंज CFA साथ भरा एक 22 गेज सुई सूक्ष्म पायसीकारी सुरक्षित. धीरे धीरे ऐसी है कि सुई CFA से भरा है CFA सिरिंज के सवार धक्का, तो देते हैं और के दूसरे छोर सुरक्षितपिट्यूटरी निकालने के साथ भरा सिरिंज सुई.
- धीरे धीरे CFA सिरिंज के सवार अग्रिम acqueous पिट्यूटरी निकालने, ऐसी है कि केवल एक छोटी राशि मिलाया जाता है में तेल घटक धक्का. फिर वापस पिट्यूटरी निकालने सिरिंज के CFA सिरिंज में सवार धक्का. इस क्रिया को दोहराएँ धीरे धीरे मिश्रित सामग्री की राशि में वृद्धि. जारी रखें जब तक दो सीरिंज की संपूर्ण सामग्री को मिश्रित कर रहे हैं. आप एक सफेद और समान रूप से वितरित समाधान है कि पानी में तेल पायसन का प्रतिनिधित्व करता है प्राप्त करेंगे.
- एक बार पायसन गठन किया है, गति वापस और आगे कम से कम 500 बार दोहराने के लिए सुनिश्चित करें पायस अच्छी तरह से मिश्रित है. अंतिम मिश्रण चक्र के बाद, 01:01 पायस और पानी में तेल का उपयोग करने के लिए तैयार है और 10 मिलीग्राम / एमएल के एक पीयूषिका प्रोटीन एकाग्रता शामिल है. उसी दिन पायस anesthetized SJL चूहों में subcutaneously इंजेक्शन जाएगा, के रूप में साथी जौव लेख में विस्तृत.
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Discussion
तथ्य यह है कि autoimmune hypophysitis के साथ पहली रोगी 4 +१९६२ रिपोर्ट में किया गया था के बावजूद, रोगजनक पिट्यूटरी autoantigens 5 पहचाना जा रह है. पशु मॉडल बहुत इन autoantigens की पहचान करने के लिए उपयोगी हो सकता है, biomarkers कि रोगी देखभाल करने के लिए अनुवाद कर रहे हैं की खोज की सहायता कर सकते हैं. इस अनुच्छेद के एक फार्म है कि प्रायोगिक पशुओं में autoimmune hypophysitis उत्प्रेरण के लिए पर्याप्त है में पिट्यूटरी प्रोटीन तैयार करने के लिए एक सरल प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम पीसी NIH अनुदान DK080351 द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15-ml Falcon tubes | |||
| homogenization buffer | |||
| phosphate buffered saline | |||
| protease inhibitor cocktail | |||
| Polytron homogenizer | |||
| BCA assay | Pierce, Thermo Scientific | 23225 | |
| Complete Freund’s Adjuvant (CFA) | Sigma-Aldrich | F-5881 | |
| Mycobacterium tuberculosis | BD Biosciences | 231141 | |
| 2.5 mL Hamilton gastight syringe | |||
| 22-gauge micro-emulsifying needle |
References
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