Summary
Autoimmuna hypophysitis kan återges i möss genom att injicera ett utdrag ur mus hypofysen proteiner.
Abstract
Autoimmun hypophysitis är en kronisk inflammation i hypofysen orsakas eller åtföljas av autoimmunitet 1. Det har traditionellt ansetts vara en ovanlig sjukdom, men rapporteringen har ökat markant under senare år. Hypophysitis i själva verket utvecklas inte sällan som en "bieffekt" hos cancerpatienter som behandlas med antikroppar som blockerar inhibitoriska receptorer uttrycks på T-lymfocyter, som CTLA-4 2 och PD-1-receptorer. Autoimmuna hypophysitis kan induceras experimentellt genom att injicera möss med hypofysen proteiner blandat med ett adjuvans 3. I denna video artikeln visar vi hur du extraherar proteiner från mus hypofys och hur man förbereder dem i en form som lämpar sig för att inducera autoimmuna hypophysitis i SJL möss.
Protocol
Experimentell Protokoll
Det första steget i denna experimentella protokoll är att samla ett stort antal musen hypofys. Det andra steget är att homogenisera de körtlar att förbereda ett protein extrakt. Det tredje steget är att emulgera dessa proteiner med en fet blandning.
Steg 1: Insamling och lagring av mus hypofys
Musen hypofysen sitter vid basen av skallen i en depression av sphenoid ben kallas Sella turcica, omgiven sidled av trigeminus nerver och anteriorly av optiska chiasm. Körteln består av en större främre lob och mindre bakre och mellanliggande lober, och väger i genomsnitt 1,9 mg. Hypofys samlas in från möss av blandade stammar, kön och åldrar, avsedda att avlivas av djur-och sjukvårdsinrättning.
Att isolera hypofysen, är musen dödshjälp, huden ovanför dissekeras skallen och skallbenet skar upp med en sax. Hjärnan lyfts att exponera hypofysen, som sedan är isolerad från den omgivande dura mater, öste ur sphenoid ben och lagras i ett plaströr på torris.
Generellt använder vi 300 musen hypofys för ett protein beredning, en siffra som kan samlas in av en person i 9 timmar.
När insamlingen är klar röret med hypofys förvaras vid -80 ° C tills redo för nästa steg.
Steg 2. Utvinning av mus hypofys proteiner
- Lägg till homogenisering buffert för att en 15-ml Falcon rör (katalognummer 352.059) förvaras i ett isbad, med 250 mikroliter av buffert för varje 100 samlats hypofys. Använd en buffert av jonstyrka liknande den som är fysiologiskt närvarande inne i cytoplasman i cellen (0,2 M) och fysiologiskt pH (7,4). Vi använder fosfatbuffrad saltlösning (0,161 M, pH 7,4), kompletterat med en proteashämmare cocktail (Sigma-Aldrich, katalognummer P8340-1 ml).
- Lägg till hypofys till bufferten strax före homogenisering, och sedan placera generatorn (5-mm i diameter) av Polytron homogeniseringsblandare längst ner på Falcon röret. Homogenisera vid max rpm i 30 sekunder, försiktigt flytta Falcon röret upp och ner samtidigt som den i isbad. Sedan vila homogenatet på is i 1 min. Upprepa homogenisering och kyla steg två gånger till. Denna milda homogenisering bör bryta celler och släpp cytosoliskt proteiner utan att störa kärnor.
- För att ta bort kärnor, obruten vävnad och olösliga material (exempelvis bindväv och denaturerat proteinkomplex), centrifugera homogenatet i låg hastighet (1000g) i 10 min vid 4 ° C.
- Överför supernatanten (som nu kallas Post-Nuclear supernatanten PNS) till en ny Falcon rör, var noga med att lämna pellets ostörda, och lagra PNS på is.
- Återsuspendera pelleten i den ursprungliga volymen av homogenisering buffert (250 mikroliter av buffert för varje 100 som samlats in hypofys), homogenisera som ovan, centrifug enligt ovan, och sedan kombinera den andra PNS med den första.
- Alikvotera de två sammanslagna PNS prov till mikrocentrifugrör och förvara vid -80 ° C tills redo för nästa steg. Detta protein preparatet kan förvaras vid -80 ° C men gradvis förlorar sin styrka, så vi rekommenderar att använda det inom 6 månader från förberedelser. Använd en liten delmängd att fastställa proteinets avkastning och koncentration av BCA analysen (Pierce katalog nr. 23.225) och proteinkvalitet med gelelektrofores. I allmänhet får vi ca 60 mg protein från 300 mus hypofysen i 1,5 ml av homogenisering buffert, med en koncentration kring 40 mg / ml.
Steg 3. Beredning av emulsion för immunisering
- Tina snabbt frysta proteinet alikvoter som behövs för försöket och justera proteinkoncentration till 20 mg / ml. Detta protein extrakt kommer att emulgerade 1:1 med Complete Freunds Adjuvant (CFA, Sigma F-5881) innehållande 5 mg / ml av värme dödades Mycobacterium tuberculosis (Becton Dickinson, 231.141). Varje mus kommer att få 1 mg av hypofysen extrakt i 100 mikroliter av emulsion.
- Exemplet här är för att vaccinera 10 möss, där varje mus injiceras med 100 mikroliter av emulsion innehåller 1 mg hypofysen proteiner. Låt två extra möss för materiella förluster under förberedelserna, så använd 12 mg hypofysen proteiner. Aspire 600 mikroliter av 20 mg / ml hypofysen proteinextrakt beskriver ovan med hjälp av en 2,5 mL Hamilton gastäta spruta. Resuspendera CFA genom att skaka, och strävar efter 600 mikroliter av CFA till en annan 2,5 ml Hamilton spruta. Fäst och säkra en 22-gauge mikro-emulgerande nålen på sprutan fylld med CFA. Tryck långsamt upp kolven i CFA-sprutan så att nålen är fylld med CFA, anslut sedan och säkra den andra änden avnålen på sprutan fylld med hypofysen extrakt.
- Sakta föra kolven i CFA sprutan pressa oljan komponenten i acqueous hypofysen extrakt, så att endast en liten mängd blandas. Tryck sedan in tillbaka kolven i hypofysen extrakt sprutan i CFA sprutan. Upprepa denna åtgärd gradvis ökande mängden material blandas. Fortsätt tills hela innehållet i de två sprutorna är blandade. Du får en vitaktig och jämnt distribuerad lösning som representerar vatten-i-olja emulsion.
- När emulsionen bildas, upprepa back-och-tillbaka rörelse minst 500 gånger för att säkerställa att emulsionen grundligt blandas. Efter den sista blandningen cykeln är 1:01 vatten-i-olja emulsion klar att använda och innehåller en hypofysen protein koncentration på 10 mg / ml. Emulsionen kommer att injiceras samma dag subkutant i sövda SJL möss, enligt beskrivningen i sällskap JUPITER artikeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trots att den första patienten med autoimmuna hypophysitis rapporterades år 1962 fyra, patogena hypofysen autoantigener återstår att identifiera 5. Djurmodeller kan vara mycket användbara för att identifiera dessa autoantigener, medhjälp upptäckten av biomarkörer som är att överföra till patientvård. Denna artikel har visat ett enkelt förfarande för att förbereda hypofysen proteiner i en form som är tillräcklig för att inducera autoimmuna hypophysitis hos försöksdjur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag DK080351 till PC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15-ml Falcon tubes | |||
| homogenization buffer | |||
| phosphate buffered saline | |||
| protease inhibitor cocktail | |||
| Polytron homogenizer | |||
| BCA assay | Pierce, Thermo Scientific | 23225 | |
| Complete Freund’s Adjuvant (CFA) | Sigma-Aldrich | F-5881 | |
| Mycobacterium tuberculosis | BD Biosciences | 231141 | |
| 2.5 mL Hamilton gastight syringe | |||
| 22-gauge micro-emulsifying needle |
References
- Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).
- Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer. J Immunother. 28, 593-598 (2005).
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).
- Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman. J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).
- Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).
