Summary
我们目前用于演示程序，配体结合到膜表面的纤维素消化在使用荧光显微镜和配体与裂解肽台湾地下白蚁肠道原虫杀原虫这些
Abstract
我们正在开发一种新的方法，地下白蚁控制，这将导致减少对化学农药的使用的依赖。地下白蚁是依赖于工人的hindguts原生动物有效地消化木材。裂解肽已被证明杀死多种原虫（Mutwiri 等，2000），并在台湾地下白蚁， 家白蚁 （2009年Husseneder和科利尔）的肠道原虫。裂解肽真核生物的非特异性免疫系统的一部分，并破坏微生物膜（2004年Leuschner和汉塞尔）。大多数裂解肽不太可能损害高等真核生物，因为他们不影响电中性的含胆固醇高等真核生物（Javadpour 等，1996年）的细胞膜。裂解肽行动，才能有针对性地增加一个配体的特定的细胞类型。例如，汉塞尔等人 （2007）报道与癌症细胞膜受体的配体结合的裂解肽可以用来摧毁乳腺癌细胞，而单 独或与非特异性肽结合的裂解肽效果不理想。也有裂解肽结合人体激素对前列腺癌和睾丸癌的细胞（2004年Leuschner和汉塞尔）有针对性的破坏肿瘤细胞的受体结合。
在这篇文章中，我们目前的技术用来证明一个裂解肽，再加一个七肽配体的结合从台湾地下白蚁的肠道原虫膜表面（赫卡特）protozoacidal活动。这些技术包括从白蚁工人的肠道摘除，厌氧培养肠道原虫（Pseudotrichonympha grassii，Holomastigotoides hartmanni
Spirotrichonympha leidyi），用荧光染料标记的配体结合白蚁肠道原虫和其他自由生活的原生动物而不是细菌或肠道组织的微观确认。我们也表现出相同的配体，再加上一个裂解肽，有效地杀死白蚁肠道原虫在体外（原生动物文化）和体内（微量注射到工人肠），但低于单独的裂解肽bacteriacidal。在不到两个星期的白蚁死亡原虫导致的损失。
在未来，我们通过一个“特洛伊木马”，以表达配体催化肽，杀白蚁肠道内的原虫，并随后在殖民地杀死白蚁白蚁殖民地生存在白蚁后肠和传播的微生物，可以将基因工程。配体裂解肽，也可用于对原虫的药物发展。
Protocol
实验1：提取白蚁肠道原虫在厌氧条件下
- 在手套箱使用风扇框（腼腆实验室）不断通过干燥剂和D型催化剂Stak教材套分发的空气来控制湿度和氧气含量和消除不均匀的温度。手套箱填写的氮为20至30分钟的连续流。氧含量监测氧传感器1小时（C -平方，公司）用氮气以达到和保持无氧条件下，在需要的时候。
- 准备Trager ü媒体（Trager 1934年），并调整pH至7.0。喷雾用2.5％的氢，5％的二氧化碳和92.5％的氮气1 h，以除去氧气残留的混合物在手套箱的过滤消毒媒体。
- Silanize所有材料，包括显微镜载玻片，离心管，吸液管，玻璃器皿等使用Sigmacote的实验中使用，以防止吸附原生动物或表面的肽（Sigmacote，适马，＃SL - 2，http://www.sigmaaldrich.com/等/了mediaLib / DOCS / Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf）。
- 由于白蚁肠道原虫是严格厌氧的生物，他们绝不能暴露于氧气。因此，以下步骤是在手套箱（见1.1）的厌氧条件下进行。随着钳淹没在70％的乙醇，轻轻地约10秒的漩涡，以除去表面的污染物白蚁工人的整个身体。
- 工人从乙醇中取出，并允许干就清理了约20秒Kimwipe使用无菌的细尖镊子举行工人的腹部和另一双钳抓取腹部的一角，轻轻一拉成45度角向上或向下的肠道。如果在一条直线的角度和用力过猛拉肠是很容易掰开。将在100μLTrager ü载玻片媒体下降10胆量。
- 皮尔斯与无菌精细解剖探头对释放的胆量原生动物和轻轻地用200μL移液器转移成1毫升的离心管中含有900μLTrager ü媒体肠道内容。允许肠壁片段（5秒），转移900μL上清到一个新的管沉淀后。
- 转移10μL原生动物文化sigmacoted显微镜幻灯片和检查的条件显微镜下放大200 ×原生动物。
- 准备有氧原生动物四膜虫 ， 变形虫 SP， 眼虫藻， 草履虫 SP的控制文化。 （北卡罗来纳州生物供应公司，伯灵顿，数控），以及一个由供应商推荐的培养基中的大肠杆菌过夜培养。
实验2：添加配体与荧光染料，原生动物和细菌培养测试表面的细胞膜和细胞壁结合
我们以前使用噬菌体展示库（New England Biolabs公司公司，伊普斯维奇，马），以确定绑定到原虫（协议http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf提供）19七肽序列。一个与肽序列（ALNLTLH）显示，从锥虫布氏膜公认的糖蛋白相似的配体合成并加上C -末端的荧光探针（EDANS，5 - （（2 -氨基乙基）氨基）萘1 -磺酸酸的λmax= 341 nm处，λem= 471 nm处）通过固态肽合成中使用EDANS NovaTag的树脂（EMD Biosciences公司）（SSPS）。在这里，我们展示的配体结合的原生动物从白蚁肠道和其他自由生活的原生动物，而不是细菌分离。
- 文化的原生动物中所述地契。 1。原虫12小时修复10％的甲醛在4 ° C
- 离心原生动物的解决方案（30 XG，10分钟），弃去上清液，并包含固定原虫1毫升Trager ü媒体两次洗颗粒。重新悬浮颗粒在1毫升Trager ü媒体。此外，修复其他原生动物和 E。控制大肠杆菌的细菌。
- 孵育1-2 h合成的配体的解决方案与荧光染料EDANS在终浓度为50微米（水配制）耦合固定微生物。的配位溶解于水比Trager ü媒体。
- 400 X放大倍率在341 nm处的吸光度最大，在471纳米的蓝色区域排放在荧光显微镜下观察微生物。
实验3：测试protozoacidal配体的活动， 再加上在体外裂解肽（原生动物文化）
一个共轭配体和裂解肽赫卡特（Mutwiri 等，2000）曾在路易斯安那州立大学蛋白质设施的合成。
- Silanize材料，并准备在无氧的手套箱一个白蚁肠道原虫文化小号在进出口描述。 1。
- 准备需氧控制微生物（如大肠杆菌和自由生活的原生动物物种T.膜虫 ）文化。
- 在手套箱，吸管6 198原生动物文化微升到0.5毫升的Eppendorf管分装的厌氧环境。加入2μL的配体催化肽100μmol解决方案白蚁肠道原虫文化等分的一半（最终浓度为1微米）。加入2μL水的等分的另一半（对照组）。
- 在台上，准备E.类似等分大肠杆菌和T.膜虫与1微米裂解肽，配体催化肽或水。
- 1小时后，转移10μL每个原生动物文化的幻灯片。比较显微镜下放大200 ×控制原虫治疗生存。
- 1小时后，板约100μL。 10-4稀释的E. BHI培养大肠杆菌培养于37℃过夜。比较板块上的菌落形成单位的数量。
实验4：配体注射到白蚁后肠中加上一个荧光染料
- 拉针（GD - 1型，1 × 900毫米），采用了双级耐热等级（65和48），获得一个针尖大小为20-30微米的一个Narishige PC - 10玻璃微管拉拔。确认使用千分尺的显微镜下，通过测量笔尖的大小。
- 与CA填充一针。 30μL荧光标记的配体50微米的悬浮于水中，使用附加的注射器。另一针装满水的控制。将一个微量（0.5μL能力和32毫米的长度，德拉蒙德科学公司）在显微持有人。将针在第二显微注射系统持有人。设置初始注入参数约1秒脉冲长度和10-12 PSI注射。进入微针慢慢推进，注入的解决方案，使用踏板驱动的高速电子喷射系统连接到一个控制氮气流量，从而保证一个恒定的量是可重复注射用脉冲长度控制。注射后，取出微量，并记录注射使用游标卡尺的解决方案的长度。计算从已知参数的微注射量。调整压力的氮气和驱逐0.3μL的解决方案，在单次注射的脉冲长度。
- 挤压与软钳白蚁工人腹部，直肠，以消除任何排泄物目前的结束。固定白蚁工人心寒冰浴5分钟。
- 100μL枪头，用手术刀刀片，切断了白蚁工人的接收器。切尖长度为10 - 12毫米，根据白蚁的大小和使用。
- 将接收到的显微。放在培养皿上背侧的工人和工人头到接收器的使用氮吸泵吸，所以，从接收的工人伸出总站。
- 手持接收机中的白蚁，仔细提前填写使用的显微针插入工人肛门。注入0.3μL的解决方案（荧光标记的配体或控制的水）。
- 放在单独的培养皿中，配体或水注入湿滤纸的工人和他们保持在26 ± 2 ° C，与78％RH
- 从注入白蚁消灭胆量和收集原虫24 h后如上图所示在进出口。 1。修复并观察原虫在进出口。 2。
实验5：测试protozoacidal配体的活动， 再加上在体内的裂解肽（注射到白蚁后肠）
- Silanize作为进出口描述的材料。 1。
- 准备一个500微米解决方案在水中的配体催化肽。
- 按照步骤3.1），通过3.4）准备玻璃针，接收器和白蚁工人。
- 继在3.5中描述的方法）注入0.3μL的配体催化肽溶液（治疗）或水（对照组）20白蚁工人肠。
- 几个工人举行24小时的白蚁，消灭胆量，并在显微镜下观察肠道内容，如3.6中所述）。和3.7）。
- 只要在白蚁肠道原虫的死亡被证实，其余处理的白蚁和控制，在培养皿中保持湿润滤纸，每天观察死亡率。
代表性的成果：
实验1：通常情况下，前肠，中肠和后肠是在一块时遵循正确的程序（图1a）。原虫肠厌氧部分驻留在高密度，可释放的肠穿孔钳（图1b 1＆2）。最大的原佐阿种在台湾的地下白蚁肠道是纺锤状的体育grassii，这是长200-300微米，宽150微米，可以用肉眼看到。第二个最大的品种是梨状H。 hartmanni（50-140微米长，宽30-80微米）。最小的品种是圆锥状S. leidyi（15-50微米长，宽8-30微米;丽等人 1983年） 。如图2所示的原生动物物种。
最佳培养条件下，从台湾地下白蚁肠道原虫三个孤立的物种将保持健康地活着，至少72 h在厌氧Trager ü媒体（图3a）。然而，如果不是最佳的培养条件原生动物会死快。如果有氧气残留在媒体中，原生动物的运动将立即停止。如果渗透压过高或细胞膜的完整性受到损害原生动物将凸出的细胞破裂（图3b）膜表面。如果渗透压过低或膜受到损害，原生动物将萎缩，萎缩（图3c）。
实验2：我们证实，再加上配体绑定到所有三个品种从台湾地下白蚁后肠中检出密度原生动物的荧光探针。配体结合发生在整个细胞表面（图4）。结合位点都集中在axostyle（表微管）在P.核原生动物前地区grassii。
我们观察到一些修修补补的自体荧光的原生动物摄入的木颗粒。然而，自体荧光通常是便于识别的配体的特异性结合，因为没有从表面上看，axostyle和细胞核（图4）自体荧光。
我们也发现在所有测试的自由生活的有氧原生动物物种（图5），这表明，配体结合结构通用，以原生动物荧光。然而，没有观察到配体结合为E.大肠杆菌 。
实验3：一个配体催化肽微米杀害所有三个从台湾地下白蚁工作者的肠道和自由生活的T.的原生动物物种膜虫在体外 ，在不到10分钟，而对照停留活着。图6显示了膜的完整性与配体催化肽治疗的白蚁肠道原虫逐渐丧失。膜隆起和断裂，原生动物走向枯萎和死亡。在E.数量无明显差异治疗的配体催化肽和水之间的大肠杆菌菌落。然而，没有配体的裂解肽减少大肠杆菌的数量大肠杆菌菌落（图7）。这表明，配体的附着在一定程度上保护非目标微生物，从裂解。
实验4：当0.3μL50μM荧光标记的配体注入白蚁工人肠，结合到 P grassii，S. leidyi和H 。 hartmanni被确认通过荧光显微镜类似进出口。 2（图4）。白蚁肠道组织没有显示出荧光。
实验5：0.3μL500微米配体催化肽注射液的所有三个物种在台湾的地下白蚁肠道原虫在24小时内死亡。白蚁死亡后10天之内失去他们的共生原生动物。此前，Husseneder和Collier（2009）注入白蚁胆量裂解肽的浓度相同。没有连接的配体，它把更多的时间，直到原虫在肠道内（72小时）和白蚁死亡（6周）。这表明，配体提高效率，最有可能通过有约束力的裂解肽原虫的裂解肽protozoacidal。
图1。答：台湾在一个幻灯片显示肠道的主要部分（前，中，后肠）的地下白蚁肠道; B 1＆2：肠刺穿钳释放含有原虫肠道内容。
图2。种的鞭毛原虫在台湾地下白蚁后肠发现：一）Pseudotrichonympha grassii，B）Holomastigotoides hartmanni，和c）Spirotrichonympha leidyi。
图3。一）健康文化的原生动物，原生动物，B）与膜膨出原生动物，C）干瘪的原生动物。
图4。确认配体结合，再加上白蚁肠道荧光探针原虫（从上到下：P. grassii，H. hartmanni，S. leydi），与荧光标记的配体和未经处理的对照（自体荧光显示）的处理。
图5。配体结合自由生活的有氧原虫，一） 变形虫 ， 四膜虫 ，B）C） 眼虫 ，和D） 草履虫 。
图6。治疗a）水（对照组）和B）1微米的配体催化肽原生动物。
图7。 大肠杆菌大肠杆菌菌落板（10 -4稀释）：）处理与水（对照组），B）治疗1微米配体催化肽，C）1微米裂解肽治疗。
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Discussion
配体裂解肽已成功地用于有效地定位和摧毁癌细胞（汉塞尔和Leuschner 2004年， 汉塞尔等2007年） 。基于这种理念，我们开发了一个七肽配体结合的表面，在台湾地下白蚁肠道原虫，再加上它与目标裂解肽摧毁这些预留的纤维素消化白蚁肠道共生，实现白蚁控制（2009年Husseneder和科利尔）。
我们成功地证实的3种在台湾地下白蚁在体外和体内肠道原虫使用荧光探针（EDANS）在蓝色的范围内排放的配体结合的配体。在白蚁肠道管腔自体荧光木颗粒，由原生动物摄入会干扰检测的特异性结合。虽然经验丰富的观察者能分辨荧光标记的配体和自体荧光（图4）的信号，一些修改可能使信号检测。我们建议使用在远红外频谱白蚁肠道和木材颗粒显示相当少的自体荧光的荧光染料（如mPlum，Clontech公司安全检测实验室公司）。
我们发现，在低浓度的配体催化肽从台湾地下白蚁在体外和体内的肠道原虫种纤维素消化所有三个死亡。裂解肽配体的附件，以原生动物的毒性增加相比，仅裂解肽，而减少对非目标生物的毒性，如 E。 大肠杆菌 ，很可能是因为配体没有绑定到细菌的细胞膜。因此，它可应用在控制白蚁毒饵的有效成分尽快高效输送系统的设计。
我们不能提供配体催化肽肽喂养不加修改的白蚁，白蚁殖民地。裂解肽正在迅速消化，才到达肠（2009年Husseneder和科利尔）。因此，我们用白蚁灌肠提供测试其在体内的protozoacidal活性肠肽。实际应用中，我们将测试，如果喂养白蚁蛋白酶抑制剂前喂养它们将导致裂解肽裂解肽到达后肠，同时保留其protozoacidal活动的足够数量的。此外，D型合成肽裂解，无法消化由肠道蛋白酶（2009年Husseneder和科利尔），可纳入作为一个白蚁诱饵的有效成分。最终交付的系统很可能会基于paratransgenesis，“特洛伊木马”，是一种微生物基因工程提供和传播的一个白蚁殖民地（Husseneder等人，2005年，Husseneder和格雷斯2005年，Husseneder和Collier 2009）裂解肽。
配体催化肽的使用，将提供一个特定的城市和农业环境的常规农药来控制昆虫的方法。诱饵系统可开发，引进微生物生产的配体催化肽目标害虫的品种，如其他白蚁，蟑螂的生存依赖于原生动物，。社会交往，有可能蔓延殖民地成员（Husseneder等人，2005年，Husseneder和格雷斯2005年）之间的微生物，并消除了殖民地。非社会性昆虫，也可以针对个别诱饵和摧毁特定组织的特定配体。
此外，白蚁肠道原虫，配体催化肽文章也被杀害了的自由生活的鞭毛虫和纤毛虫原生动物
（ 四膜虫，变形虫，眼虫，草履虫 ）。这可能是有用的反对， 如利什曼原虫，锥虫，Trichomona，和疟原虫原虫的药物发展。目前用于治疗人类和家畜的原虫的药物很多脊椎动物的毒性高，特别是原生动物的寄生虫，内有脊椎动物宿主细胞内的生命阶段和低特异性。配体催化肽复合物，可以选择目标外原虫内脊椎动物或无脊椎动物媒介或含有细胞内原虫阶段的细胞表面。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢艾利森理查德博士，前任董事荧光配体的合成，对生物技术研究Interdisciplinaray中心，用友为配体催化肽合成，和Socolovsky提供荧光显微镜显微镜设施LSU肽设施。经费是由美国国防部SERDP探索发展计划（SEED），能源和环境保护局，生物AgCenter跨学科的团队计划和路易斯安那州。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | |
| EDANS | Novabiochem, EMD Millipore | ||
| Anaerobic glove box | Coy Laboratories, Inc. | Custom made | |
| Intellus environmental controller | Percival Scientific, Inc. | I36NL | |
| PC-10 Glass micropipette puller | Narishige International | PC-10 | |
| Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm) | Narishige International | GD-1 | |
| Leitz micromanipulators | Vermont Optechs, Inc. | ACS01 | |
| Microinjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-1 | |
| Microcaps | Drummond Scientific | 1-000-0005 | |
| LEICA fluorescence imaging system | Leica Microsystems | DMRxA2 | |
| LEICA dissecting scope | Leica Microsystems | MZ16 | |
| LEICA microscope | Leica Microsystems | DMLB | |
| Olympus dissecting scope | Olympus Corporation | SZ61 |
References
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