Summary
हम प्रदर्शन के लिए प्रक्रियाओं है कि ligands Formosan भूमिगत फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और कि ligands lytic पेप्टाइड के साथ युग्मित का उपयोग दीमक के पेट में प्रोटोजोआ सेलूलोज़ पचाने को मारने प्रोटोजोआ इन की सतह झिल्ली करने के लिए बाध्य वर्तमान
Protocol
1 प्रयोग: दीमक के पेट के निष्कर्षण anaerobic शर्तों के तहत प्रोटोजोआ
- लगातार एक desiccant और प्रकार विकास उत्प्रेरक Stak paks के माध्यम से हवा प्रसारित करने की नमी और ऑक्सीजन के स्तर को नियंत्रित करने और असमान तापमान को खत्म करने के लिए एक दस्ताना बॉक्स में एक प्रशंसक बॉक्स का उपयोग करें (विनीत प्रयोगशालाओं). 20 से 30 मिनट के लिए एक नाइट्रोजन की एक सतत स्ट्रीम के साथ दस्ताना बॉक्स भरें. एक एच. के लिए एक ऑक्सीजन सेंसर (सी - चुकता इंक) के साथ मॉनिटर ऑक्सीजन का स्तर नाइट्रोजन का प्रयोग करें तक पहुँचने के लिए और anaerobic स्थिति बनाए रखने के लिए जब जरूरत.
- Trager यू मीडिया (1934 Trager) तैयार है और 7.0 पीएच को समायोजित. 2.5% हाइड्रोजन, 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 1 घंटे के लिए ऑक्सीजन अवशेषों को हटाने के लिए 92.5% नाइट्रोजन का एक मिश्रण के साथ दस्ताने बॉक्स में फिल्टर मीडिया निष्फल सींचना.
- खुर्दबीन स्लाइड, microcentrifuge ट्यूब, pipettes, कांच के बने पदार्थ आदि Sigmacote का उपयोग कर प्रयोगों में इस्तेमाल के सोखना को रोकने सहित सभी सामग्री Silanize प्रोटोजोआ या सतहों के लिए पेप्टाइड्स (Sigmacote, सिग्मा, # SL-2, http://www.sigmaaldrich.com/ / etc / medialib / डॉक्स Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf).
- चूंकि दीमक प्रोटोजोआ पेट कड़ाई anaerobic जीव हैं वे ऑक्सीजन को उजागर नहीं करना चाहिए. इसलिए निम्नलिखित चरणों का एक दस्ताना बॉक्स (1.1 देखें) में anaerobic शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं. संदंश डूब 70% इथेनॉल और लगभग 10 के लिए धीरे ज़ुल्फ़ सतह contaminants को हटाने में एक दीमक कार्यकर्ता के पूरे शरीर के साथ.
- इथेनॉल से कार्यकर्ता निकालें और के बारे में 20 एस के लिए एक साफ Kimwipe पर सूखे की अनुमति कार्यकर्ता पेट पकड़ और संदंश की एक और जोड़ी के साथ पेट की नोक हड़पने के एक 45 डिग्री के कोण में धीरे पेट को ऊपर या नीचे खींच एक बाँझ ठीक इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग करें. यदि पेट एक सीधे कोण पर और बहुत अधिक बल के साथ खींच लिया है के अलावा तोड़ने की संभावना है. एक खुर्दबीन स्लाइड पर 100 μl Trager यू मीडिया की एक बूंद में 10 की हिम्मत रखें.
- बाँझ ठीक विदारक जांच करने के लिए जारी की एक जोड़ी के साथ हिम्मत पियर्स प्रोटोजोआ और धीरे से एक 200 μl विंदुक के साथ एक 1 मिलीलीटर microcentrifuge 900 μl Trager यू मीडिया युक्त ट्यूब में पेट सामग्री हस्तांतरण. आंत की दीवार (5 ओं) टुकड़े, स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला की एक ताजा ट्यूब 900 μl के अवसादन के लिए अनुमति के बाद.
- एक sigmacoted खुर्दबीन स्लाइड प्रोटोजोआ संस्कृति के 10 μl स्थानांतरण और 200 एक्स बढ़ाई पर एक खुर्दबीन के नीचे प्रोटोजोआ की हालत की जाँच करें.
- एरोबिक प्रोटोजोआ Tetrahymena pyriformis, अमीबा सपा, Euglena सपा, और Paramecium सपा के नियंत्रण संस्कृतियों तैयार. (कैरोलिना जैविक आपूर्ति कंपनी, Burlington, नेकां) के रूप में अच्छी तरह से संस्कृति आपूर्तिकर्ता द्वारा सिफारिश की मीडिया में Escherichia कोलाई की एक रात संस्कृति के रूप में.
प्रयोग 2: जोड़ें एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ मिलकर ligand प्रोटोजोआ और बैक्टीरिया संस्कृतियों सतह झिल्ली और सेल दीवारों के लिए बाध्य करने के लिए परीक्षण करने के लिए
हम पहले फेज प्रदर्शन पुस्तकालयों (न्यू इंग्लैंड Biolabs इंक, इप्सविच, एमए) का इस्तेमाल 19 heptapeptide दृश्यों कि करने के लिए प्रोटोजोआ (http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf पर उपलब्ध प्रोटोकॉल) बाँध की पहचान. एक पेप्टाइड (ALNLTLH) अनुक्रम कि ख्यात ट्रायपैनोसोमा brucei झिल्ली से जाना जाता है glycoproteins समानता दिखाया के साथ एक ligand संश्लेषित किया गया था और एक सी टर्मिनल फ्लोरोसेंट जांच (EDANS 5, के लिए मिलकर - (2 - Aminoethyl) अमीनो () नेफ़थलीन-1- सल्फोनिक एसिड, λmax = 341 एनएम, λem = 471 एनएम ठोस राज्य पेप्टाइड संश्लेषण (SSPS) EDANS NovaTag राल (ईएमडी बायोसाइंसेज) का उपयोग कर के माध्यम से). यहाँ हम दिखाना है कि ligand प्रोटोजोआ कि दीमक के पेट और मुक्त रहने वाले अन्य प्रोटोजोआ, लेकिन नहीं बैक्टीरिया से पृथक किया गया बांध.
- संस्कृति के रूप में प्रोटोजोआ ऍक्स्प में वर्णित है. 1. एच. 12 के लिए 4 में 10% formaldehyde ° सी के साथ प्रोटोजोआ फिक्स
- प्रोटोजोआ समाधान (30 XG, 10 मिनट) अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागने और तय 1ml Trager यू मीडिया में दो बार प्रोटोजोआ युक्त गोली धोने. 1 मिलीलीटर Trager यू मीडिया में गोली पुनः निलंबित. इसके अलावा, अन्य ठीक प्रोटोजोआ, और ई. नियंत्रण के लिए कोलाई बैक्टीरिया.
- 50 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता में फ्लोरोसेंट डाई EDANS (पानी में) तैयार करने के लिए मिलकर संश्लेषित ligand के समाधान के साथ 1-2 घंटे के लिए निर्धारित सूक्ष्मजीवों सेते हैं. ligand Trager यू मीडिया की तुलना में पानी में बेहतर घुल.
- 400 341 एनएम पर एक absorbance के अधिकतम और 471 एनएम नीले क्षेत्र में एक उत्सर्जन एक्स बढ़ाई पर एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे सूक्ष्मजीवों का निरीक्षण.
प्रयोग 3: परीक्षण इन विट्रो में lytic पेप्टाइड (प्रोटोजोआ संस्कृति) के लिए मिलकर ligand के protozoacidal गतिविधि
Ligand के एक संयुग्म और lytic पेप्टाइड हेकेटी (2000 Mutwiri एट अल.) पहले LSU प्रोटीन सुविधा में संश्लेषित किया गया था.
- Silanize सामग्री और anaerobic दस्ताने बॉक्स में दीमक पेट संस्कृति प्रोटोजोआ तैयारऍक्स्प में वर्णित है. 1.
- Aerobe नियंत्रण सूक्ष्मजीवों (उदाहरण के लिए, ई. कोलाई और मुक्त रहने वाले प्रजातियों प्रोटोजोआ टी. pyriformis) की संस्कृतियों को तैयार करें.
- दस्ताना बॉक्स, पिपेट 0.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों में 198 प्रोटोजोआ संस्कृति के μl के 6 aliquots के anaerobic वातावरण में. Aliquots के दीमक पेट प्रोटोजोआ संस्कृति के आधे (अंत एकाग्रता सुक्ष्ममापी 1) के लिए एक 100 ligand-lytic पेप्टाइड सुक्ष्ममापी समाधान के 2 μl जोड़ें. Aliquots के दूसरे आधे (नियंत्रण) करने के लिए पानी की 2 μl जोड़ें.
- Benchtop पर, ई. की इसी तरह की aliquots तैयार कोलाई और टी. 1 सुक्ष्ममापी lytic पेप्टाइड, ligand-lytic पेप्टाइड या पानी के साथ pyriformis.
- 1 घंटे के बाद, स्लाइड के लिए प्रत्येक प्रोटोजोआ संस्कृति के 10 μl हस्तांतरण. 200 एक्स बढ़ाई पर एक खुर्दबीन के तहत नियंत्रण के प्रोटोजोआ इलाज के अस्तित्व की तुलना करें.
- 1 घंटे के बाद, थाली लगभग 100 μl. 10 ई. के कमजोर पड़ने -4 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर भी और सेते पर कोलाई संस्कृतियों. प्लेटों पर कॉलोनी बनाने इकाइयों की संख्या की तुलना करें.
4 प्रयोग: ligand में दीमक hindgut में एक फ्लोरोसेंट रंजक मिलकर इंजेक्शन
- सुई (मॉडल GD-1, 1 एक्स 900 मिमी) एक दोहरी चरण गर्मी (65 और 48) स्तर 20-30 सुक्ष्ममापी की टिप के आकार प्राप्त के साथ एक Narishige पीसी-10 गिलास micropipette खींचने का उपयोग खींचो. यह एक सुक्ष्ममापी का उपयोग कर खुर्दबीन के नीचे मापने के द्वारा टिप आकार की पुष्टि करें.
- Ca साथ एक सुई भरें. Fluorescently चिह्नित ligand के 50 सुक्ष्ममापी की 30 μl पानी में निलंबित एक संलग्न सिरिंज का उपयोग कर. पानी के साथ नियंत्रण के लिए एक सुई भरें. एक micropipette (0.5 μl क्षमता और 32 मिमी लंबाई, Drummond वैज्ञानिक कंपनी) micromanipulator में धारक के लिए संलग्न. एक सुई इंजेक्शन प्रणाली धारक को एक दूसरे micromanipulator में संलग्न. लगभग 1 पल्स लंबाई और 10-12 साई इंजेक्शन के लिए प्रारंभिक इंजेक्शन पैरामीटर सेट. सुई धीरे micropipette में अग्रिम एक नाड़ी की लंबाई नियंत्रित नाइट्रोजन गैस प्रवाह है, जो सुनिश्चित करता है कि एक निरंतर मात्रा reproducibly अंतःक्षिप्त है संलग्न करने के लिए नियंत्रण के साथ एक पेडल संचालित उच्च गति इलेक्ट्रॉनिक इंजेक्शन प्रणाली का उपयोग कर समाधान इंजेक्षन. इंजेक्शन के बाद, micropipette हटाने और इंजेक्शन एक वेर्निएर कैलीपर का उपयोग समाधान की लंबाई रिकॉर्ड है. Micropipette के ज्ञात मापदंडों से इंजेक्शन की मात्रा की गणना. नाइट्रोजन गैस के दबाव और एक इंजेक्शन में 0.3 μl समाधान निष्कासित पल्स लंबाई समायोजित करें.
- नरम संदंश के साथ एक दीमक कार्यकर्ता पेट के लिए मलाशय में किसी भी मलमूत्र वर्तमान निकालने के अंत दबाओ. उन्हें 5 मिनट के लिए बर्फ पर द्रुतशीतन द्वारा दीमक कार्यकर्ता स्थिर करना.
- 100 μl विंदुक युक्तियाँ एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर बंद काटने से दीमक कार्यकर्ताओं धारण करने के लिए रिसीवर करें. 10 की लंबाई के लिए टिप कट - 12 मिमी और दीमक के आकार के अनुसार उपयोग.
- Micromanipulator रिसीवर संलग्न. अपनी पृष्ठीय पक्ष पर एक पेट्री डिश पर एक कार्यकर्ता प्लेस और कार्यकर्ता सिर एक नाइट्रोजन चूषण पंप का उपयोग रिसीवर में पहली बार aspirate ताकि रिसीवर से कार्यकर्ता protrudes टर्मिनस.
- रिसीवर में दीमक होल्डिंग, ध्यान से भरा micromanipulator का उपयोग करने के लिए कार्यकर्ता गुदा में डालने सुई अग्रिम. समाधान के 0.3 μl (fluorescently चिह्नित या नियंत्रण के लिए ligand के पानी) इंजेक्षन.
- अलग पेट्री डिश में ligand या पानी के साथ नम फिल्टर पेपर के साथ इंजेक्शन कामगारों प्लेस और उन्हें 26 पर रख ± 2 ° सी के साथ 78% आरएच
- इंजेक्शन दीमक से हिम्मत उखाड़ना और जमा के बाद 24 घंटे के रूप में ऍक्स्प में ऊपर दिखाए प्रोटोजोआ. 1. फिक्स और ऍक्स्प में दिखाया प्रोटोजोआ निरीक्षण. 2.
प्रयोग 5: परीक्षण ligand के protozoacidal गतिविधि vivo में lytic पेप्टाइड (दीमक hindgut में इंजेक्शन) करने के लिए युग्मित
- सामग्री Silanize ऍक्स्प में वर्णित के रूप में. 1.
- पानी में ligand-lytic पेप्टाइड का एक 500 सुक्ष्ममापी समाधान तैयार करें.
- 3.4) के माध्यम से 3.1 कदम) का पालन करने के लिए कांच की सुइयों, रिसीवर और दीमक कार्यकर्ताओं को तैयार है.
- 3.5 में वर्णित विधि) के बाद 20 दीमक श्रमिकों के hindgut में ligand-lytic पेप्टाइड (उपचार) समाधान या पानी (नियंत्रण) के 0.3 μl इंजेक्षन.
- कई कामगारों से 24 घंटे के लिए दीमक, उखाड़ना हिम्मत पकड़ो और माइक्रोस्कोप के अंतर्गत पेट सामग्री का पालन के रूप में 3.6 में वर्णित). और 3.7).
- जल्द ही के रूप में दीमक के पेट में प्रोटोजोआ के एक मौत की पुष्टि की है, नम फिल्टर पेपर के साथ पेट्री डिश में शेष इलाज और दीमक नियंत्रण और रखने मृत्यु दर दैनिक निरीक्षण.
प्रतिनिधि परिणाम:
प्रयोग 1: आमतौर पर, foregut midgut, और hindgut एक टुकड़ा में प्राप्त कर रहे हैं जब प्रक्रिया सही ढंग से पीछा किया जाता है (चित्र 1a). hindgut का anaerobic भागों में उच्च घनत्व में रहते प्रोटोजोआ और संदंश (चित्रा 1b 1 & 2) के साथ hindgut भेदी द्वारा जारी किया जा सकता है है. सबसे बड़ा आद्यFormosan भूमिगत दीमक के पेट में zoa प्रजातियों धुरी - आकार पी. grassii, जो 200-300 सुक्ष्ममापी लंबा और 150 सुक्ष्ममापी चौड़ा है और नग्न आंखों से देखा जा सकता है . दूसरी सबसे बड़ी प्रजाति एच. नाशपाती के आकार का है hartmanni (50-140 सुक्ष्ममापी लंबी और 30-80 सुक्ष्ममापी चौड़ा). छोटी प्रजातियों एस शंकु के आकार का है leidyi (15-50 सुक्ष्ममापी लंबा और 8-30 सुक्ष्ममापी चौड़ा, लाइ एट अल 1983). प्रोटोजोआ प्रजातियों चित्रा 2 में दिखाया जाता है.
प्रोटोजोआ के इष्टतम संस्कृति शर्तों के तहत तीन प्रजातियों Formosan भूमिगत दीमक के पेट से अलग anaerobic Trager यू मीडिया (चित्र 3a) में कम से कम 72 घंटे के लिए जीवित और स्वस्थ रहेंगे. हालांकि, अगर संस्कृति की शर्तों इष्टतम नहीं हैं प्रोटोजोआ तेजी से मर जाएगा. यदि मीडिया में ऑक्सीजन के अवशेष हैं, प्रोटोजोआ के आंदोलन को तुरंत बंद हो जाएगा. यदि आसमाटिक दबाव बहुत अधिक या झिल्ली प्रोटोजोआ जाएगा बाहर उभाड़ना कोशिकाओं और टूटना (3b चित्रा) की सतह झिल्ली अखंडता समझौता किया है. यदि आसमाटिक दबाव बहुत कम है या झिल्ली से समझौता कर रहे हैं, प्रोटोजोआ सूखना और हटना (चित्रा -3 सी).
प्रयोग 2: हम पुष्टि की है कि ligand एक फ्लोरोसेंट जांच के सभी तीन प्रजातियों detectable घनत्व में Formosan भूमिगत दीमक की hindgut से प्रोटोजोआ के लिए बाध्य करने के लिए युग्मित. Ligand बंधन पूरे कोशिका की सतह पर (चित्रा 4) होता है. बाध्यकारी साइटों axostyle (सूक्ष्मनलिकाएं के एक पत्रक) और पी. में नाभिक पर प्रोटोजोआ के पूर्वकाल क्षेत्र में केंद्रित कर रहे हैं grassii.
हम लकड़ी प्रोटोजोआ द्वारा किया जाता कणों के कुछ बद autofluorescence मनाया. हालांकि, आमतौर पर autofluorescence ligand की विशिष्ट बंधनकारी से विचार करने के लिए आसान है, के बाद से वहाँ सतह, axostyle और नाभिक (चित्रा 4) का कोई autofluorescence है.
हम भी सभी परीक्षण मुक्त रहने वाले एरोबिक प्रोटोजोआ (चित्रा 5) प्रजातियों, जो पता चलता है कि प्रोटोजोआ के लिए सामान्य संरचनाओं के लिए ligand बांध में प्रतिदीप्ति का पता चला. हालांकि, कोई ligand बंधन ई. के लिए मनाया गया कोलाई.
3 प्रयोग: ligand-lytic पेप्टाइड का एक सुक्ष्ममापी के सभी तीन प्रजातियों Formosan भूमिगत दीमक श्रमिकों के पेट और मुक्त रहने वाले टी. से प्रोटोजोआ को मार डाला कम से कम 10 मिनट में इन विट्रो में pyriformis, जबकि नियंत्रण जिंदा रुके. चित्रा 6 दीमक ligand-lytic पेप्टाइड के साथ इलाज प्रोटोजोआ पेट की झिल्ली अखंडता की प्रगतिशील हानि से पता चलता है. झिल्ली उभाड़ना और टूटना, प्रोटोजोआ सूखना और मरने. ई की संख्या में कोई फर्क नहीं मनाया गया ligand-lytic पेप्टाइड और पानी के उपचार के बीच कोली कालोनियों . कोई ligand साथ lytic पेप्टाइड, तथापि, ई. की संख्या कम कोलाई काफी कालोनियों (चित्रा 7). यह पता चलता है ligand है कि कुछ हद तक लगाव lysis से गैर लक्ष्य सूक्ष्मजीवों की रक्षा.
4 प्रयोग: जब 0.3 fluorescently चिह्नित ligand के μl 50 सुक्ष्ममापी दीमक श्रमिकों के hindgut में इंजेक्ट किया गया था, पी. के लिए बाध्य grassii, एस leidyi और होम्योपैथी hartmanni ऍक्स्प करने के लिए इसी तरह की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से पुष्टि की गई. 2 (चित्रा 4). दीमक आंत ऊतक प्रतिदीप्ति नहीं दिखा था.
5 प्रयोग: 0.3 μl 500 ligand-lytic पेप्टाइड सुक्ष्ममापी इंजेक्शन के सभी तीन प्रजातियों के 24 घंटों के भीतर Formosan भूमिगत दीमक के पेट में प्रोटोजोआ को मार डाला. दीमक उनके सहजीवी प्रोटोजोआ के नुकसान के बाद 10 दिनों के भीतर मृत्यु हो गई. इससे पहले, Husseneder और खनक (2009) दीमक हिम्मत में lytic पेप्टाइड का एक ही एकाग्रता इंजेक्शन. संलग्न ligand के बिना, यह अधिक समय ले लिया जब तक पेट (72 घंटे) में प्रोटोजोआ और दीमक (छह सप्ताह) मर चुके थे. यह पता चलता है कि ligand lytic पेप्टाइड, प्रोटोजोआ के लिए lytic पेप्टाइड बंधन द्वारा सबसे अधिक संभावना के protozoacidal क्षमता बढ़ जाती है.
चित्रा 1. : पेट के मुख्य वर्गों (सामने, मध्य, hindgut) दिखा स्लाइड पर Formosan भूमिगत दीमक पेट, ख 1 & 2: Hindgut संदंश के साथ छेदा पेट प्रोटोजोआ सामग्री वाले रिलीज.
चित्रा 2. flagellate के तीन प्रजातियों प्रोटोजोआ Formosan भूमिगत दीमक की hindgut में पाया:) Pseudotrichonympha grassii, ख) Holomastigotoides hartmanni, और ग) Spirotrichonympha leidyi.
चित्रा 3. संस्कृति में प्रोटोजोअन) स्वस्थ प्रोटोजोआ, ख उभड़ा झिल्ली के साथ प्रोटोजोअन) ग) प्रोटोजोआ shriveled.
चित्रा 4. एक फ्लोरोसेंट करने के लिए आंत दीमक की जांच करने के लिए मिलकर ligand के बंधन की पुष्टि(ऊपर से नीचे तक: पी. grassii, एच. hartmanni एस leydi) प्रोटोजोआ fluorescently चिह्नित ligand और अनुपचारित नियंत्रण (autofluorescence दिखा) के साथ इलाज किया.
चित्रा 5. Ligand बंधन से मुक्त रहने वाले एरोबिक) Tetrahymena, ख) अमीबा, ग) Euglena प्रोटोजोआ, और घ) Paramecium.
चित्रा 6. ) पानी (नियंत्रण) और ख) 1 सुक्ष्ममापी ligand-lytic पेप्टाइड के साथ प्रोटोजोआ के उपचार.
7 चित्रा ई.. प्लेटों पर कोली कालोनियों (10 -4 कमजोर पड़ने): एक) पानी (नियंत्रण), ख के साथ व्यवहार) 1 ligand-lytic पेप्टाइड, ग सुक्ष्ममापी के साथ व्यवहार) 1 lytic पेप्टाइड सुक्ष्ममापी के साथ व्यवहार.
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Discussion
Ligand-lytic पेप्टाइड सफलतापूर्वक किया गया है को प्रभावी ढंग से लक्ष्य और कैंसर की कोशिकाओं (बयाना और Leuschner 2004, बयाना एट अल 2007.) को नष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया. इस अवधारणा के आधार पर, हम एक heptapeptide ligand है कि की सतह के लिए बांध विकसित Formosan भूमिगत दीमक के पेट में प्रोटोजोआ और यह लक्ष्य के साथ एक lytic पेप्टाइड दीमक के पेट में इन लाचार सेलूलोज़ पचाने symbionts को नष्ट करने के लिए दीमक को प्राप्त करने के लिए युग्मित नियंत्रण (Husseneder और खनक 2009).
हम सफलतापूर्वक ligand के तीन प्रजातियों नीले रंग की रेंज में उत्सर्जन के साथ एक फ्लोरोसेंट जांच (EDANS) के साथ ligand का उपयोग करके इन विट्रो में और vivo में Formosan भूमिगत दीमक के पेट में प्रोटोजोआ के लिए बाध्य की पुष्टि की. दीमक आंत की लुमेन में लकड़ी के कणों के autofluorescence और प्रोटोजोआ द्वारा किया जाता है विशिष्ट बंधनकारी का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. हालांकि अनुभवी पर्यवेक्षक प्रतिदीप्ति चिह्नित ligand और autofluorescence (चित्रा 4) से संकेत के बीच भेद कर सकते हैं, कुछ संशोधनों के संकेत का पता लगाने और कम चुनौतीपूर्ण बना सकता है. हम दूर लाल स्पेक्ट्रम में एक फ्लोरोसेंट रंजक है (उदाहरण के लिए, mPlum, Clontech लेबोरेटरीज इंक) जहां दीमक पेट और लकड़ी कणों काफी कम autofluorescence दिखाने का उपयोग कर सुझाव देते हैं.
हम पता चला है कि कम सांद्रता में ligand-lytic पेप्टाइड में इन विट्रो में और vivo में Formosan भूमिगत दीमक के पेट से प्रोटोजोआ सेलूलोज़ पचाने के सभी तीन प्रजातियों मारे गए. ligand के lytic पेप्टाइड अनुलग्नक प्रोटोजोआ के लिए विषाक्तता अकेले lytic पेप्टाइड करने के लिए तुलना में वृद्धि हुई, जबकि यह गैर लक्ष्य जीवों के लिए विषाक्तता कम ऐसे ई. के रूप में में, कोलाई, सबसे अधिक संभावना है क्योंकि ligand बैक्टीरिया कोशिका झिल्ली के लिए बाध्य नहीं किया. इस प्रकार, यह दीमक नियंत्रण के लिए फँसाना चाहे में एक सक्रिय संघटक के रूप में लागू किया जा सकता है के रूप में जल्द ही एक कुशल वितरण प्रणाली के रूप में बनाया गया है.
हम ligand-lytic पेप्टाइड संशोधन के बिना दीमक पेप्टाइड्स खिला द्वारा एक दीमक कॉलोनी के लिए वितरित कर सकते हैं. Lytic पेप्टाइड तेजी से पचा रहे हैं इससे पहले कि वे hindgut (Husseneder और खनक 2009) तक पहुँचने. इसलिए, हम दीमक एनीमा इस्तेमाल hindgut में vivo में उनके protozoacidal गतिविधि के परीक्षण के लिए पेप्टाइड्स देने. व्यावहारिक अनुप्रयोग के लिए हम अगर दीमक protease inhibitors के पहले खिला उन्हें lytic पेप्टाइड खिला परीक्षण lytic hindgut तक पहुँचने जबकि उनके protozoacidal गतिविधि को बनाए रखना है पेप्टाइड्स की पर्याप्त मात्रा में परिणाम होगा. इसके अलावा, lytic पेप्टाइड, जो पेट proteases (Husseneder और खनक 2009) द्वारा किया जा नहीं पचा सकता है सिंथेटिक D फार्म, एक दीमक प्रलोभन में एक सक्रिय संघटक के रूप में शामिल किया जा सकता है. परम वितरण प्रणाली की संभावना paratransgenesis, जहां एक माइक्रोबियल "ट्रोजन हॉर्स" आनुवंशिक रूप देने और एक दीमक कॉलोनी (Husseneder एट अल 2005. Husseneder, और अनुग्रह 2005, Husseneder और 2009 खनक) में lytic पेप्टाइड का प्रसार करने के लिए इंजीनियर के आधार पर किया जाएगा.
ligand-lytic पेप्टाइड का उपयोग करने के लिए एक विशिष्ट शहरी और कृषि पारंपरिक कीटनाशकों के मुक्त वातावरण में कीड़े नियंत्रण दृष्टिकोण प्रदान करेगा. चारा सिस्टम को विकसित किया जाना है कि ligand-lytic पेप्टाइड उत्पादन के लिए कीट प्रजातियों, जैसे अन्य दीमक और तिलचट्टे है उस पर अस्तित्व के लिए प्रोटोजोआ भरोसा लक्ष्य सूक्ष्मजीवों परिचय सकता है. सामाजिक बातचीत कॉलोनी सदस्यों (Husseneder एट अल 2005. Husseneder, और 2005 के ग्रेस) के बीच फैल रोगाणुओं और कॉलोनी को समाप्त कर सकता है . गैर सामाजिक कीड़ों भी फँसाना चाहे और विशिष्ट विशिष्ट ऊतकों को नष्ट करने के लिए विकसित ligands के द्वारा एक व्यक्ति के आधार पर लक्षित किया जा सकता है.
प्रोटोजोआ पेट दीमक अलावा, ligand-lytic पेप्टाइड यह भी मुक्त रहने flagellate मारे लेख में प्रस्तुत किया और ciliate प्रोटोजोआ
(Tetrahymena, अमीबा, Euglena, Paramecium). यह लीशमैनिया, ट्रायपैनोसोमा, Trichomona, और प्लाज्मोडियम जैसे प्रोटोजोआ परजीवियों के खिलाफ दवाओं के विकास के लिए उपयोगी हो सकता है. वर्तमान में मनुष्य और घरेलू पशुओं के प्रोटोजोआ परजीवी के इलाज के लिए इस्तेमाल किया दवाओं के कई उच्च हड्डीवाला विषाक्तता और परजीवी, विशेष रूप से प्रोटोजोआ कि हड्डीवाला मेजबान के भीतर intracellular जीवन चरणों के लिए कम विशिष्टता है. Ligand-lytic पेप्टाइड परिसरों के लिए चुनिंदा लक्ष्य बनाया जा सकता है कोशिकी रीढ़ या invertebrate वैक्टर या प्रोटोजोआ के intracellular चरणों वाले कक्षों की सतहों के भीतर प्रोटोजोआ.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम फ्लोरोसेंट ligand संश्लेषण, Interdisciplinaray जैव प्रौद्योगिकी अनुसंधान के लिए केंद्र, ligand-lytic पेप्टाइड संश्लेषण के लिए UF, और प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग प्रदान करने के लिए Socolovsky माइक्रोस्कोप सुविधा के लिए LSU पेप्टाइड सुविधा के पूर्व निदेशक डा. एलीसन रिचर्ड, धन्यवाद. अनुदान SERDP खोजपूर्ण रक्षा विभाग के विकास कार्यक्रम (बीज), ऊर्जा और पर्यावरण संरक्षण एजेंसी विभाग, जैव प्रौद्योगिकी AgCenter अंतःविषय टीम कार्यक्रम और लुइसियाना के राज्य द्वारा प्रदान किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | |
| EDANS | Novabiochem, EMD Millipore | ||
| Anaerobic glove box | Coy Laboratories, Inc. | Custom made | |
| Intellus environmental controller | Percival Scientific, Inc. | I36NL | |
| PC-10 Glass micropipette puller | Narishige International | PC-10 | |
| Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm) | Narishige International | GD-1 | |
| Leitz micromanipulators | Vermont Optechs, Inc. | ACS01 | |
| Microinjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-1 | |
| Microcaps | Drummond Scientific | 1-000-0005 | |
| LEICA fluorescence imaging system | Leica Microsystems | DMRxA2 | |
| LEICA dissecting scope | Leica Microsystems | MZ16 | |
| LEICA microscope | Leica Microsystems | DMLB | |
| Olympus dissecting scope | Olympus Corporation | SZ61 |
References
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- Husseneder, C., Collier, R. E. Paratransgenesis for termite control. Insect Symbiosis. Bourtzis, K., Miller, T. A. 3, CRC Press LLC. Boca Raton, Florida. Volume 3 361-376 (2009).
- Husseneder, C., Grace, J. K., Oishi, D. E. Use of genetically engineered bacteria (Escherichia coli) to monitor ingestion, loss and transfer of bacteria in termites. Curr. Microbiol. 50, 119-123 (2005).
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