Summary
וידאו זה מדגים גישה בסביבה מבוקרת ללמוד השפלה של רקמות הצמח lignocellulosic ידי פטריות אירובית. היכולת לשלוט במקורות מזין לחות היא יתרון המפתח של אגר, לחסום מיקרוקוסמוס, אך הגישה לרוב מניב הצלחה מעורבת. אנו כתובת החסרונות קריטי תשואה לשחזור, השתנות נמוך התוצאות.
Abstract
שתי השיטות העיקריות לחקר ביודגרדציה פטרייתי של רקמות הצמח lignocellulosic פותחו עבור בדיקות משמר עץ (אדמה לחסום; אגר בלוק). זה טוב כי קיבל אדמה לחסום מיקרוקוסמוס להניב שיעורי עששת גבוה יותר, פחות בעיות רטיבות, השתנות נמוך יותר בקרב מחקרים, ועל סף גבוה יותר של רעילות חומר משמר. אדמה היא לחסום בדיקות ובכך הטכניקה מנוצל יותר כבר טופל על ידי האגודה האמריקאית לבדיקות וחומרים (ASTM) (שיטה D 1413-1407). העיצוב אדמה לחסום יש חסרונות, לעומת זאת, שימוש במקורות אדמה מקומית משתנה וגם להגביל את השליטה של חומרים מזינים חיצוני (אקסוגני) לרקמות מתפורר. חסרונות אלה התפתחו כמו בעיה ביישום שיטה זו, מטרות אחרות מחקר פופולרי יותר ויותר. אלה מטרות המודרני כוללים lignocellulosics משפיל למחקר Bioenergy, בדיקות bioremediation של שיתוף מטבוליזם רעלים, הערכת המנגנונים חמצוני, ועוד אלמנטים translocated מעקב לאורך רשתות hyphal. קרקע, בלוקים לא להשאיל לשלוט מספיק ביישומים אלה. גישה מעודן אגר לחסום הכרחי.
כאן, אנו משתמשים ריקבון חום עץ משפיל פטרייה Serpula lacrymans להשפיל עץ אגר לחסום מיקרוקוסמוס, באמצעות עמוק צלחות פטרי עם אגר סידן נמוכה. אנחנו בודקים את התפקיד של אקסוגניים גבס על ריקבון בסדרה פעמי, כדי להדגים את השירות ואת השתנות צפוי. רחובות אחד לוח לקרוע (חתך אורך) מותנים, שקל, autoclaved, והציג בסביבה נקייה מחיידקים, על גבי רשת פלסטיק. חיסונים פטרייתיים הם על הפנים כל בלוק, עם גבס אקסוגניים נוסף על ממשקים. היבולים הם aseptic עד הקציר הרסני הסופי. מיקרוקוסמוס אלה נועדו לחסום להימנע ממגע עם אגר או קירות פטרי צלחת. עיבוי ממוזער במהלך צלחת שופך במהלך הדגירה. לבסוף, inoculum / גבס / עץ המרווח ממוזער אך מבלי לאפשר קשר. אלה ההיבטים הטכניים של עיצוב פחות אגר לחסום גם הם הגורמים השכיחים ביותר של כישלון המקור המפתח של השתנות בין המחקרים. פרסום וידאו ולכן הוא שימושי במקרה הזה, ואנחנו מראים השתנות נמוך, תוצאות באיכות גבוהה.
Protocol
פרוטוקול זה חל על מצעים וודי ולא עציים, כפי שתואר, כמו גם חומר בתנור או אוויר יבש. קרא את הפרוטוקול הראשון, לעומת זאת, לפני הגדרת. ישנן מספר נקודות העלה כי עשויים לחול על המחקר שלך, אלה נקודות (קו תחתון) דורשים תכנון. כמו כן, מציינים כי קיימים שני שפורסם אגר לחסום שיטות המשמשות לעתים, אחד הבריטי תקן 838 ועוד הבאים קבוצת המחקר הבינלאומית להגנה ווד (IRG-WP) הנייר שהגיש הגבורה (1978). השיטה שלנו דומה 838, עם שינויים בעיקר בעיצוב מיקרוקוסמוס והשליטה של המדיום אגר, אבל שוב, שתי הגישות נמנעים לעתים קרובות בשל היסטורי לשלוט בעיות רטיבות בלוקים מעץ, גרימת אנוקסיה ושונות. סקירה טובה של אלה שיטות הבדיקה הכוללת דיון אגר לחסום עיצובים, כולל תקן 838, ניתן למצוא ניקולס (1973).
1) הכנת מיקרוקוסמוס
מיקרוקוסמוס לניסויים אלה 1 ס"מ גבוה (יותר) מאשר טיפוסי בצלחות פטרי, הגדלת מרחב הראש מעל קוביות עץ. הם מלאים סכום צנוע המדויק של אגר כדי לשלוט בכמויות מזין מוחלט, בנוסף הריכוז שלהם, כדי לשמור על גושי עץ הרחק (> 3 מ"מ) מן המכסה. אגר משמש במקרה זה של בדיקות גבס הוא סוג נמוך סידן אגר, עם זאת, אנו מציגים תוצאות נציג באמצעות המדיום של Blakeslee, המדיום ATCC מומלץ לשמירה על הבדיקה לבודד של Serpula lacrymans (Wulfen: צ'יפס) שרוטר זן EMPA 65 ( ATCC 32,750).
עיצוב זה שומר על רקמות הצמח הרחק קשר אגר, הרחק מכסה את המנה וקירות. הרטבה משתנה של lignocellulosic מצעים הוא מקור מרכזי משונות אגר לחסום בדיקות. הרטבת להגדיל את תכולת הלחות יוצר אנוקסיה ומדכא או אפילו ביודגרדציה עוצר אירובית. זה גם יוצר בעיה עבור כל אחד לומד מנגנוני חמצוני של פטריות ריקבון חום ולבן אחראי על הפירוק עץ. עיבוי על מכסים בצלחת הוא נושא אם הטופס טיפות מים חופשית להרטיב את המצע. כמו כן, עץ ורקמות אחרות יהיה "הפתיל" מים במהירות אגר כאשר במגע, מה שמוביל לחות תוכן העולה על 80% (wt יבש. בסיס) לבין הפסקת השפלה אירובית. רקמות יש להרחיק את מקורות המים, דבר המאפשר את הפטרייה פילמנטיות למצוא, להתחבר, בקרת לחות בתוך המצע.
- הפוך את התקשורת אגר מספיק כדי למלא את המספר הרצוי של צלחות פטרי עם אגר 20 מ"ל כל אחד. אנו משתמשים five משכפל (n = 5) לכל טיפול, נקבע על ידי כוח באמצעות ניתוח תוצאות העבר.
- עבור סידן וסוג ברזל ללא אגר, אנו מוסיפים 15 גרם אגר כדי בקבוקון המכיל 500 מ"ל נפח כ 400 מ"ל מים deionized מתוקן עם 1.0 גרם NH 4 NO 3, 1.0 גרם monobasic KH 2 PO 4, 0.25 גרם MgSO 4 x 7H 2 O, ו - 1.0 גרם גלוקוז. לתערובת, אנו משתמשים בפתרונות המניות להוסיף micronutrients. אנו מוסיפים כל אחד 50 μl של H 3 BO 4 (0.057 גרם / 100 מ"ל) ו ZnSO 4 (0.031 גרם / 100 מ"ל). אנו מוסיפים 50 כל אחד μl MnCl 2 (0.036 גרם / 100 מ"ל), CuSO 4 (0.039 גרם / 100 מ"ל), ו - (NH 4) 6 מו 7 O 24 (0.018 גרם / 100 מ"ל). לאחר מזינים מתווספים, למלא את הבקבוק volumetric לקו 500 מ"ל.
- תוספת סידן האופיינית במקרה זה תהיה 0.05 גרם CaCl 2 x 2H 2 O / 500 מ"ל. במקרה שלנו, אנו משתמשים סידן אגר כטיפול, עם ריכוז סופי 5 מ"מ. אנו הדלפק להגדיל בנוסף כוח כלוריד יוניים ידי הוספת 5 mM NaCl על מיקרוקוסמוס אחרים. כמו כן, אנו משתמשים ברזל ללא מדיה להפגנה זו, אך במקרים בהם ברזל נכללת, אנו לערבב 0.112 גרם FeSO 4 עם 2 מ"ל מים deionized ולהוסיף 50 μl של פתרון זה טרי (לא מניות) מיד לאחר vortexing. בכל כלי התקשורת שבו אתה שולט תוספות של חומרים מזינים, זה חכם לבחון pH לפני מעוקר. התוספות חומציים או בסיסיים (למשל FeCl 3) ישפיע על מיצוק.
- העברת מדיה בבקבוק ו החיטוי הבינוני ב 121 ° C ו 16 psi במשך 20 דקות. אנחנו לא יעלה על 500 מ"ל כרכים (לכל בקבוק 1000 מ"ל), כדי להימנע מהצורך לחזק אגר לפני שנוכל לנהל את כל זה כדי לבדוק את הצלחות.
(הערה:.. זה חכם בעת השימוש בתקשורת חלופית, אגר מזין מינימלי במיוחד עם מלחים הבסיס הוסיף, קודם כל לוודא כי הפטרייה הבדיקה יגדל על זה החוזק היוני גבוהות עלולות לעכב את הצמיחה או אפילו להרוג הבדיקה לבודד) - השתמש נייד פיפטה, סיוע pipettes 10 מ"ל פוליסטירן סטרילי להעביר אגר בסביבה נקייה מחיידקים בארון biosafety, פעם צלוחיות מגניב. לתת מדיה קריר למגע חשוב כאן כדי למזער את התעבות. כמו כן, ערימה צלחות גבוהה כפי שהם שפכו, כדי למזער מים חופשי על העפעפיים. בעוד היא עיבוי למטרד culturing רגיל, כאן הוא מייצג בעיה גדולה אם droplets טופס ורטוב את העץ. תכולת לחות (MC) מעל 80% (על בסיס משקל יבש) תיצור אנוקסיה ברקמות, ריקבון להגביל ידי פטריות אירובית, ולהגדיל את השתנות. חישוב MC כדלקמן:
MC * = [(משקל טרי x משקל יבש) / משקל יבש] 100 x
* (MC יעלה על 100% - זה אולי נראה מוזר הדרך לחשב MC, אבל היא רגילה)- מיקרוקוסמוס אלטרנטיבית: אם רקמות הצמח נבדקים אשר חייבים להיות טרום הסתובבו ו הסתנן (למשל, תירס סטובר גבעולים ועלים, יחד), קיימות שתי אפשרויות תבשיל אנו משתמשים. מחולק צלחות פטרי זמינים עם 2 או 4 מקטעים אגר ניתן לשלול מן התאים עם אבקה. אגר הקרושה ניתן גם לחתוך חלק הוסרו על מנת לפנות מקום אבקה, אך יש להקפיד לשמור על כרכים אגר שווה הנותרים אם זמינות חומרי ההזנה להיות נשלט.
- הוסף בנדיבות לגזור רשתות רשת פלסטיק אל פני השטח את הצלחת, באמצעות שטף ביסודיות ורשתות autoclaved הוסיף בסביבה נקייה מחיידקים. אנו משתמשים במוצר, משמר Gutter (35 x 50 מ"מ, 2 מ"מ עובי), עבור רשת שלנו, השתמשו במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי להראות משטח נקי לאחר לשטוף במים וסבון ולהראות חוסר החדירה פטרייתי. היו לנו הצלחה מעורבת עם מסננים סיבי זכוכית עם אבני הנחת ישירות על mycelia פיתחה, הן בשל בעיות הפתילה. אתם תקבלו ריקבון, אבל מקדם שלך של השתנות (CV) יהיה גבוה, מה שהופך את ההשוואות טיפול חלש מבחינה סטטיסטית. השתמשנו מוטות זכוכית בעבר, אבל חוסם רגישים מחליק את מוטות כאשר נדחקו, עוזב בלוקים במגע עם אגר. חלופה אחת טובה היא לחתוך סיבובים שלמים כדי להתאים את הלוחות, חיתוך קצה אחד כדי להתאים את inoculum. באופן כללי, לגזור רשתות להתאים משלך הגדרת, אבל לוודא שהם שכב לגמרי בצלחות פטרי.
2) הכנת מצעים 'חסום'
פרוטוקולים אלה פותחו עבור עץ מלא, אבל הם סתגלניים עבור רקמות צמחיים אחרים. הפסד המוניים הוא המדד הסטנדרטי התקדמות ריקבון בעץ מושפל על ידי פטריות פילמנטיות. לפיכך, הגישה שלנו משתמשת בתנור יבש משקולות טרום ופוסט ריקבון לקבוע אובדן המונית. עם זאת, עבור כל מחקר Bioenergy, שבו הדגש הוא על כימיה רקמת הצמח, רבים מוצאים כי האוויר ייבוש רקמות עדיפה. אנחנו מראים כאן פרוטוקולים להכנת תרבויות אגר בלוק שלך להשתמש בתנור יבשים חומר המוצא, אלא לתת את המידע חלופה אוויר יבש וכן תהליך אבקת במקום מצעים מוצקים.
- להדגמה זו, אנו משתמשים פיין צהוב הדרום (SYP). SYP הוא עץ, זמין מסחרית המייצג את הרוב המכריע של עץ המשמשים למגורים בארצות הברית זה יכול להיות כל אחד מארבעת המינים Pinus. שאינם מטופלים עץ משמש הקשר ללא בלוקים נחתכים מן קריעה אחת (חתך אורך) לאורך הסיבים (19 x 19 מ"מ). זה ממזער השתנות כימי בעץ. אורך זה הוא חתך לתוך 19 קוביות 3 מ"מ. אנו משתמשים עבור אדמה בגודל בלוק הניסויים, וחותכים בלוקים רבים בפגישה אחת על השולחן ראיתי.
- 19 3 מ"מ בלוקים לשמש אגר לחסום מיקרוקוסמוס מפוצלות בהמשך תבואה במחצית, בעזרת אזמל ופטיש, לא ראיתי. זה עושה את קצה אחד בלוק מחוספס עם הפנים כלפי מטה על רשת פלסטיק, הקצה העליון חלקה התווית. לייבל בלוקים בעיפרון. אם אתה לא יכול תווית מצעים, הקפד לתכנן מערכת לשמור על קשר עם דגימות. גזור אבני מספיק כדי לספק את הטיפולים שלך (שוב, אנו משתמשים n = 5 לכל טיפול), כמו גם אי - מחוסן פקדים ישרת הן מפקחת זיהום כנתונים דגימות המחקר, מותנה במקביל.
- לקבלת חומר מיובש בתנור, דגימות במקום בתנור הסעה ב 100 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. אם האוויר יבש חומר נדרש, בתנאי דגימות בתא או בחדר עם לחות טמפרטורה קבועה. אנו משתמשים לחות יחסית 65% ו - 20 ° C, ואנחנו בדרך כלל לסמוך על מיזוג 10-14 ימים, תלוי בחומר.
- טרום לשקול דגימות כדי לקבוע משקל יבש בתנור או טריים הראשונית. עם דגימות מהתנור, פשוט להעביר דגימות ייבוש להתקרר ולשקול אותם.
- אלטרנטיבי האוויר ייבוש: עם החומר אוויר יבש, לקחת חמש דגימות (n = 5; הקורבנות הללו לא ישמשו מיקרוקוסמוס), לשקול אותם טריים, תנור יבש אותם לעיל, לשקול מחדש לאחר ייבוש. חישוב תיקון לחות גורם לכל אחד שני רחובות כדלקמן:
גורם תיקון MC = משקל יבש / משקל טרי
דוגמה: 2.46 גרם (יבש) / 2.68 גרם (טרי) = 0.918; כך, בלוק 3.0 גרם טרי הוא 2.75 גר 'מיובש בתנור
ממוצע חמש דגימות כדי להשיג את גורם התיקון הממוצע. לאחר מכן, לשקול את כל גושי אוויר יבש שלך. הכפל כל משקל על ידי גורם MC תיקון ממוצע כדי לקבוע הראשונית בתנור יבש משקולות.
- אלטרנטיבי האוויר ייבוש: עם החומר אוויר יבש, לקחת חמש דגימות (n = 5; הקורבנות הללו לא ישמשו מיקרוקוסמוס), לשקול אותם טריים, תנור יבש אותם לעיל, לשקול מחדש לאחר ייבוש. חישוב תיקון לחות גורם לכל אחד שני רחובות כדלקמן:
- החיטוי שכותרתו דגימות ב 121 ° C ו 16 psi עבור 1 שעה, או יותר עם דגימות גדולות יותר. היטב בנייר כסף כדי למזער הרטבה.
- Alternatiעיקור יש: קרינת גמא יכול לשמש כדי לעקר, אם זמין. בדקנו אשוח עץ אשור בעבר עבור השפעת הטמפרטורה על הפסד hemicellulose, ולא מצאו דבר, יחד עם אובדן כוח או שינוי צבע. עם זאת, זה עשוי להיות שונה בין מצעים ואת ההעדפות שלך / הצרכים, קרינת גמא היא אלטרנטיבה מוכחת.
- להדגמה זו, אנו בודקים את התפקיד של גבס מוצק (טהור לעומת 1% FeSO 4) על ירידה של אורן שלנו (SYP) דגימות. אלה מיוצרים כמו דיסקים בעלי שטח פנים ואמצעי אחסון המדויק, שוב לשלוט זמינותם בנוסף הריכוז שלהם. אלה autoclaved בנפרד והוסיף במהלך השלב חיסון. אנחנו זקוקים זה דיסק עבור כל בלוק, ואנו מוסיפים שני בלוקים לכל צלחת פטרי לאפשר לשני יבולים.
3) inoculating & תיוג
Inoculating אגר לחסום מיקרוקוסמוס יותר זמן רב יותר מאשר inoculating אדמה לחסום צנצנות. עבורנו, אנחנו סומכים על חיסון כל נטילת 3 דקות. כדי בצלחות פטרי המכילות אגר, זו הנקודה של תוספת עבור רשת, עץ, כל חומר מזין מקורות אקסוגניים (כאן, כדורי גבס), ואת הפטרייה. יש סיכוי מוגבר לזיהום בגלל כמות הזמן המכסה פתוח את מספר הביקורים בפנים. יש גם טעויות מרכזיים המתבצעים בדרך כלל בשלב הזה, ואת אלה מכוסים על ידי מיטב צימוד וידאו עם טקסט. צפה בווידאו.
- בארון biosafety סטרילי, להרכיב מנות ריק שלך אגר, צלחת המקור inoculum פטרייתי שלך (אנו משתמשים 2 תרבויות wk), רשת, המצע צמח (עץ), חומרים אקסוגניים, נוכל, רצועות parafilm, כלי ההעברה. אנו להבה לעקר באמצעות אתנול 70%, ואנו משתמשים בכלי העברת inoculum ו מלקחיים עבור בלוקים רשת. Parafilm יש לחתוך עם סכין כדי למנוע שריטות על הקצוות. ניקס ב parafilm להוביל הפסקות כאשר איטום, וזה יהיה להדחף דגימות לדרוש מחדש את הכניסה.
- העברת הלהבה כלים או מלקחיים לפני הוספת הבאים (בסדר זה):
- רשת פלסטיק.
- ווד המצע. להדגמה שלנו, נוסיף שני רחובות עץ לאורכו של הרשת, הן מהגוש הראשוני באותו פוצלה כדי שנוכל זוג נתוני יבולים מוקדם ומאוחר. בלוקים אלו מתווספים לצד זה, עם סיום תבואה (עץ חתך) מול נקודת המקור של inoculum פטרייתי.
- חומרים אקסוגניים. כאן, אנו בודקים את התפקיד של גבס על ריקבון על ידי פטרייה פילמנטיות. לכן, אנחנו רוצים את הפטרייה להיתקל אלה הדיסקים גבס לפני שהגיע עץ, ובכך להוסיף דיסק גבס בין כל נקודה inoculum ולחסום על גבי הרשת. משמעות הדבר היא הוספת 2 דיסקים לכל מיקרוקוסמוס. אין לאפשר מגע בין הדיסקים העץ, אך לשמור אותם קרובים.
- Inoculum פטרייתיים. אנו משתמשים דקור # 4 פקק בקוטר 7 מ"מ לעשות תקעים של 2-wk תרבויות גדל אגר 20 מ"ל. זה עוזר inoculum שליטה על עוצמת הקול. עבור הלא מחוסן שולט, מומלץ להוסיף תוסף מהצלחת סטרילית. אנחנו בדרך כלל להוסיף תקעים אלה כדי אגר, ולא על רשת. אין לאפשר מגע בין inoculum ואו מצעים אקסוגניים או עץ, אבל שוב, ולמקם אותם קרובים זה לזה. יש אחד תקע inoculum לכל בלוק.
הערה: רצוי להרכיב תכנים אלה בצלחת אגר לפני שתתחיל, כדי להבטיח שיהיו לפחות 3 מ"מ של שטח הראש, כי לא יהיה לפחות 3 מ"מ המרחק בין בלוקים מעץ המכסה את הקירות, וכי רשת פלסטיק שלך ממדים יהיה בקלות להתאים מצעים שלך.
- מנות Parafilm לאטום אותם, שמירה על הגחלת אלכוהול עם מלקחיים מוכן. החזק צלחות אופקי לעטוף parafilm בתנועה רציפה וחלקה. אם parafilm הפסקות או אם תוכן להדחף, להסיר parafilm, להזין מחדש ולהרכיב תוכן, ונסה שוב.
- תווית מכסים בצלחת באמצעות סמן אלכוהול עמיד, תיוג מספרים לחסום ישירות על גבי מצעים, בהתאמה. אנחנו גם לצייר עיגולים על דיסקים גבס. כפי דועך עץ, סביר להניח לאבד את היכולת לקרוא את התוויות על מצעים. חשוב לשמור על קשר עם עמדה צלחת. כמו כן, אין לזלזל ביכולת של פטרייה להשפיל או ליישב עצום של סוגי חומר אחר, כולל מתכות.
- אם יש לך מכלול עדין על רשת שלך, להעביר את הצלחות בקפידה בחממה. יש לנו, רק פעם אחת, הקפיצה את סל של צלחות נגד ריבה דלת היה צריך להרכיב מחדש את הצלחות. קחי את הזמן שלך, ואת העלילה המסלול שלך. זוהי דאגה חד פעמי, כך לטפל הפעם.
4) דוגרים & קציר
פלטות ניתן מודגרות כדי להתאים פטריות שלך, אבל יש לשמור חממה ביולוגי אם אפשר, כדי למנוע התעבות בשל תנודות הטמפרטורה. סדרת קציר הזמן נעשות בסביבה נקייה מחיידקים, למעט הקציר האחרון. אם יבולים אלה ביניים נעשות לאחר צמיחה עלמצעים הוא משמעותי, טיפול צלחות קל כי העובש מצעים לחצות הקישור.
- להדגמה שלנו, אנו דגירה צלחות על 20 מעלות צלזיוס, בחושך. באותה נקודה 5 שבוע הקציר, נסיר את במגרש הטיפול כולו, לרסס כל תחתון ועליון עם 70% אתנול ו להשתמש במלקחיים flamed להסיר חומר בתוך ארון biosafety.
- צלם תמונות לפני להרוס צלחות אגר, תוך התמקדות במורפולוגיה או melanization.
- הסר חוסמת להתייחס אליהם כאל הצרכים שלך דורשים. השתמש באצבע כדי לגלגל ממנו העובש עודף (עם כפפות nitrile), אבל להיזהר שלא לאבד את כל חומר רקובים. אנחנו בדרך כלל בתנור יבש בלוקים מחבתות אלומיניום לשקול לקבוע הפסד המוני, באמצעות משקולות טרי ויבש של בקרות כדי לפקח על הפתילה מוגזמת. אנחנו גם התווית מסלול כלשהו חוסם חום כהה כי הם בבירור מים למערכת, אך זה צריך להיות מינימלי בעקבות גישה זו. אובדן נתונים המוניים עוזר ריקבון מד התקדמות, וזה חשוב אם נתונים ריכוזי היסודות יחושבו על בסיס גרם משקל, מאוחר יותר. זכור גם כי אחוז נתונים חייב להיות מנורמל עבור הסטטיסטיקה. אנו לחשב כדלקמן:
Mass% אובדן = [(משקל הראשונית במשקל הסופי) / משקל ראשוני] 100 x- אלטרנטיבי האוויר ייבוש: אם אתה זקוק לאוויר ייבוש, כאשר המטרה שלך ביולוגית לטיפול חומר נוסף, עליך להשתמש המשטר מיזוג בין סעיף 2.3 כדי לשפץ. אם אתה חייב לקבוע אובדן מסת, זה ידרוש מידה של תכולת לחות, פתרון אחד הוא לפצל בלוקים (או אבקות) לתוך חלק גדולים וקטנים. לשקול את שניהם, אבל רק בתנור לייבש את חלק קטן. חישוב תכולת הלחות גורם ההמרה, כמתואר לעיל, ולאחר מכן להחיל אותו על המשקל הכולל של טרי קטן + חלקים גדולים (משקל לחסום הכל טרי). במיוחד אם pretreating חומר עם פטריות לפני saccharification או תהליכים אחרים, אובדן מסת יעזור לך בנחישות מאזן מסה מאוחר יותר ומהווה הפחמימות הנצרכת על ידי הפטרייה.
- להשמיד את התרבויות בשקיות autoclavable, אלא להציל את רשת תמיכה פלסטיק כל רכיב אחר יכולים להיות ממוחזרים לשימוש בניסויים עתידיים.
5) פרשנות תוצאות
רקמות Lignocellulosic בדרך כלל דעיכה איטית אגר לחסום עיצובים, אבל בשלב הזה אתה צריך השתנות נמוכה יחסית אפילו ברמות דעיכה מתונה. אתה צריך גם מתונה (20-50%), לחות לא גבוהה ברקמות שליטה.
- תכולת לחות (על בסיס משקל יבש) בעץ לא נחשף הפטרייה הם בדרך כלל מתונים, סביב 40% בהפגנה זו. זה מעל נקודת הרוויה סיבים (הפדרציה) אורן (בדרך כלל סביב 24%), כלומר יש מעט מים חינם העולה על המים כבול בתוך דופן התא lignocellulosic המשני. זה גם אומר הפתילה כמה סביר מתרחשת. לחות יחסית של 100% עדיין לא צריך לאפשר עץ MC יחרוג הפדרציה. העיצוב שלך עשוי להשיג תוצאות שונות בהתאם למצע ובחירת רשת. המפתח הוא לשמור על תוכן לחות מתחת 85% או יותר, על בסיס משקל יבש.
- המסה% הפסד עץ מושפל אלה אגר לחסום מיקרוקוסמוס הוא בדרך כלל סביב 30% לאחר 16 שבועות במשך רוב ופטריות. עבור פטריות לבחור, במקרה זה lacrymans Serpula, פטריות ישיגו השפלה מלא הפעם, אובדן מסת> 60%. ס lacrymans היא פטרייה ריקבון חום, הסרת ליגנין מעט, ולכן אובדן מסת 62% במשפט זה פירושו דעיכה היא השלמת הקרוב או בעבר. פטריות רקב הלבן יסיר ליגנין, ואובדן מסה תלוי מין, כמו גם המצע.
- תשמרי על עצמך כדי להקליט מורפולוגיה hyphal. בהפגנה זו, מורפולוגיה hyphal לא מיסודו להראות הצלחה או כישלון של טיפול אחד, אבל את הצבעים melanization היו חשובים. זו אפשרה לנו להתייחס תפקידו של ברזל כמו טומאה בתוך גבס מחקרים ישנים כמו נמוכה et al. (2000), שבו נבדקו חומרים יליד ואיפה זה colorization "חלודה" נצפתה. התפקיד של סידן וברזל נדונו נמוך et al. (2000), וכאן אנו רואים דעיכה משופר עם ברזל, לא סידן, אלה העובש אותו בצבע חלודה.
- אם אתה רוצה למדוד ריכוזים של דבר בעץ הזה מושפל, עדיף לנרמל על אובדן המונית. אם, למשל, סידן מיובא או מיוצא גם מעץ רקובים 50%, ריכוז שלה על בסיס משקל יופיעו להכפיל מאפס זמן הבציר האחרון. הסיבה לכך היא 1 גרם של אבקת עכשיו מייצג פעמיים את נפח העץ מאשר בזמן אפס. הפטרייה צרכו 50% מטריקס, הפחתת צפיפות. נרמל ריכוז כל נתון (למשל mmol / g) כדי לפצות על אובדן מסת כדלקמן:
ריכוז מנורמל = mmol / GX [1 - (Mass% אובדן / 100)]
דוגמה: 10 mmol / g Ca ב 20% עץ מושפל, לעומת 7 mmol / g בזמן אפס.
שאלה: האם להגדיל Ca תוכן במהלך הדעיכה?
10 mmol / g הוא לכאורה 3 mmol / g עלייה, עלייה של 43%, אך oנה גרם של אבקת עץ מושפל עם צפיפות נמוכה עכשיו מייצג נפח גדול יותר. נורמליזציה נדרש להשוות התחלתי וסופי תוכן Ca בכמויות עץ שווים.
10 x [1 x (20% / 100)] = 8 mmol / g מנורמל
תשובה: כן, לא Ca להגדיל, אבל ב -14%, לא 43%.
(נתונים יכול גם לבוא לידי ביטוי לפי נפח העץ, mmol / 3 ס"מ, על ידי הכפלה בצפיפות.
באיור 1. אגר לחסום מיקרוקוסמוס, כמפורט למעלה בהפגנה זו, לפני הדגירה.
איור 2. Lacrymans Serpula colonizing בלוקים מעץ אורן מונח על רשת פלסטיק לרומם בלוקים מעל הקשר, אגר. תפטיר זה מהווה קשר חשוב בין עץ אקסוגניים מזין / אלמנט מקורות, שליטה במקורות חומר אקסוגני של אגר או כחומר מוצק הוא יתרון המפתח של עיצוב אגר, לחסום, לעומת קרקע לחסום העיצוב.
איור 3. Mean הרזיה%, כמדד למידת של ריקבון עץ על ידי Serpula lacrymans לאחר דגירה שבועות 5 ו -15 עם אורן אגר לחסום מיקרוקוסמוס. הטיפול היו כאלה (Ca-free), 5 מ"מ CaCl 2 הוסיף אגר (CaCl 2),> 99% טהור גבס (קאסו 4), או 1% ברזל גבס המתוקן. מוגן ANOVA אמצעי השוואות היו באמצעות בדיקות של טיוקי, עם α = 0.05. במשך כל הקציר, ברים תחת באותו מכתב אינם שונים באופן משמעותי. ברים שגיאה = סטיית תקן. פורסם ב שילינג (2010).
איור 4. תמונה תקורה (A) של כל חמשת משכפל בשבוע 15 של ריקבון על ידי פטרייה להירקב אותו חום הבדיקה, Serpula lacrymans, כמו גם את אבני (ב) הוסר בתנור יבשים. הערה חוסר melanization בטיפול Ca חינם, מצהיבים בטיפולים סידן טהור, מראה חלודה בטיפול ברזל מתוקנים. טיפולים מתויגות באיור 3, עם שליטה בבלוקים (ב) להיות בלתי מחוסן להשוואה.
איור 5. תמונה תקורה ממשפט אחר באמצעות ריכוז גבוה יותר ברזל בינוני, אגר מאלט של Blakeslee. הערה אובדן melanization ציין, לעומת איור 4. חסימות הוסרו שקל לא הראו כל השפעה על הטיפול ירידה במשקל. זה מוצג כהפגנה של השפעת רכיבים אקסוגניים אלה ניסויים לחסום. תופעות אלה לא יהיה testable באדמה לחסום עיצובים צנצנת, שם אלה תשומות אקסוגניים קשה מדי לשליטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באמצעות אגר לחסום שלנו הגדרת (איור 1) Serpula lacrymans גדל במגע ישיר עם משטחי גבס לתוך גושי עץ (איור 2), מובילה לאובדן יותר מ 60% במשקל של חום נרקב לשלוט בלוקים אורן (איור 3 ). זה בקלות עונה על המטרה תקן ASTM של ריקבון> 50%, ואת הממוצע של מקדם השונות (C V) ב ריקבון בבית היה 0.055 בשבוע 16. נתונים אלה פורסמו שילינג 7. שוב, פטריות אחרות ידרשו הדגירה כבר הבלוק אגר מאשר גוש אדמה. לקבלת התייחסות, יש לנו להפעיל בהצלחה עיצובים דומים בעבר מספר ניסויים עם מגוון של מינים פטרייתיים אחרים, לעתים קרובות באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים עם ספקטרוסקופיה dispersive אלקטרונים סורק (SEM-EDS) ו מצמידים אינדוקטיבי פלזמה ספקטרוסקופית (ICP-OES) כדי לאמת את הקישוריות עם אקסוגניים מצעים ו טרנסלוקציה של סידן ורכיבים אחרים לתוך עץ 8,9.
בנוסף השתנות נמוך, ישנן שתי תוצאות אחרות עיצוב אגר לחסום שלנו מגלה. ראשית, אפקט הטיפול (איור 3), שבו תוספת סידן שלנו, אם אגר כמו CaCl 2 או טהור גבס, עכבות ריקבון על ידי פטרייה זו. זו היא תוצאה שימושית כי לאחרים יש המשערים סידן משפר דעיכה המבוססים על מחקרים עם העולם האמיתי חומרים כמו מלט וגבס. במקום זאת, אנו רואים שיעורי ריקבון ריבאונד עם תוספת של ברזל גבס, דבר המצביע על ברזל, סידן לא, היא המפתח. התוצאה שימושי השני, לעומת זאת, אינו לכמת אך במקום הצבע של mycelia (איור 4). ישנם הבדלים משמעותיים melanization ברורים העובש החיצוני בין הטיפולים, החוקרים ציינו בעבר melanization "חלודה" כאשר נתקלים זה פטרייה על חומרי בנייה (למשל נמוכה et al. 2000). במחקרים מאוחרים יותר שלנו, מצאנו כי השפעות אלו אובדים באמצעות מדיום גבוהה ברזל (איור 5). ביחד, זה מצביע על כך פטרייה זו מנצל ברזל, סידן לא, אלה החומרים כי מחקרים קודמים, עם "חלוד" mycelia דיווחו, היו התבוננות השפעה ברזל, סידן אין השפעה.
בסך הכל, התוצאות הללו וחוסר השפעות הטיפול באמצעות גבוהה ברזל אגר הם הפגנה חזק מאוד של שליטה כי העיצוב אגר בלוקים יכולים לספק את החוקר, במיוחד לאור הגישה לחסום אדמה חלופית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dishes | Nalge Nunc international | 4014 | 25 x 150 mm |
| Agar, Type A | Sigma-Aldrich | A4550 | |
| Ammonium nitrate, NH4NO3 | Millinckrodt | 3436-12 | |
| Potassium phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 3246-01 | |
| Magnesium sulfate 7-hydrate, MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Dextrose |
| Boric acid, H3BO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 2549-04 | |
| Zinc sulfate 7-hydrate, ZnSO4•7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 8880-12 | |
| Manganous chloride 4-hydrate, MnCl2•4H2O | JT Baker | 2540-04 | |
| Copper(II) sulfate 5-hydrate, CuSO4•5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Ammonium heptamolybdate 4-hydrate, (NH4)6Mo7O24•4H2O | Sigma-Aldrich | 431346 | |
| Calcium chloride dihydrate, CaCl2•2H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 4160-12 | |
| Sodium chloride, NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581-12 | |
| Ferrous sulfate 7-hydrate, FeSO4•7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 5056-12 | |
| Pipet-aid | Drummond Scientific | 4-000-110 | Cordless EtOH the surface |
| 10 ml sterile polystyrene pipette | BD Biosciences | 357551 | |
| Gutter Guard | Thermwell Products Co. | VX620 | Pre-scrubbed with soap Hardware store |
| Calcium sulfate hemihydrate, CaSO4•0.5H2O | Acros Organics | 385355000 | |
| #4 cork borer | Boekel Scientific | 1601 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 |
References
- ASTM D1413-07. Standard test method for testing wood preservatives by laboratory soil-block cultures. . Annual Book of ASTM Standards. , 185-192 (2007).
- Bravery, A. F. A miniaturized wood block for the rapid evaluation of wood preservative fungicides. , International Research Group on Wood Protection (IRG/WP 2113). (1978).
- Low, G. A., Young, M. E., Martin, P., Palfreyman, J. W. Assessing the relationship between the dry rot fungus Serpula lacrymans and selected forms of masonry. Int. Biodeterior. Biodegrad. 46, 141-150 (2000).
- Nicolas, D. Volume I (One/1) - Degradation and Protection of Wood (Syracuse Wood Science Series #5). Wood Deterioration and Its Prevention by Preservative Treatments. , Syracuse University Press. (1973).
- Schilling, J. S. Effects of calcium-based materials and iron impurities on wood degradation by the brown rot fungus Serpula lacrymans. Holzforschung. 64, 93-99 (2010).
