Agar-Block microkosmos voor de gecontroleerde Plant Tissue Ontleding door Aerobic Fungi

Summary

Deze video toont een gecontroleerde omgeving benadering van de afbraak van lignocellulose plantenweefsels studie door aërobe schimmels. De mogelijkheid om bronnen van nutriënten en vocht controle is een belangrijk voordeel van agar-block microkosmos, maar de aanpak levert vaak gemengd succes. Wij richten kritische valkuilen aan reproduceerbare, lage variabiliteit resultaten opleveren.

Abstract

De twee belangrijkste methoden voor het bestuderen van schimmel afbraak van lignocellulose plantenweefsels werden ontwikkeld voor het testen van de verduurzaming van hout (bodem-block; agar-blok). Het is goed geaccepteerd dat de bodem-block microkosmos een hogere decay rates, minder vochtproblemen, minder variatie tussen studies, en te hoge drempels voor conserveermiddel toxiciteit opleveren. Bodem-block testen is dus de meer gebruikte techniek en is gestandaardiseerd door American Society for Testing and Materials (ASTM) (methode D 1413-07). De grond-block ontwerp heeft nadelen, echter, met behulp van lokaal variabele bodem bronnen en bij het beperken van de controle van voedingsstoffen externe (exogene) om de rottende weefsels. Deze bezwaren naar voren zijn gekomen als een probleem bij de toepassing van deze methode om andere, steeds populairder onderzoek wil. Deze moderne doelen zijn onder meer vernederend lignocellulose voor bio-energie onderzoek, testen bioremediatie van co-gemetaboliseerd giftige stoffen, het evalueren van oxidatieve mechanismen, en het bijhouden van getransloceerd elementen langs hyfen netwerken. Bodem-blokken te weinig controle niet te lenen in deze toepassingen. Een verfijnde agar-blok aanpak noodzakelijk.

Hier gebruiken we de bruine rot hout-afbrekende schimmel Serpula lacrymans om hout af te breken in de agar-block microkosmos, met behulp van diepe petrischalen met een laag-calcium agar. We testen de rol van exogene gips op verval in een time-serie, het nut en de verwachte variabiliteit te tonen. Blokken van een single board rip (lengte gesneden) zijn geconditioneerd, gewogen, geautoclaveerd, en introduceerde aseptisch bovenop kunststof mesh. Schimmel inentingen zijn op elk blok gezicht, met exogeen gips toegevoegd aan interfaces. Oogsten zijn aseptisch tot de laatste vernietigende oogst. Deze microkosmossen zijn ontworpen om te blokkeren contact te vermijden met agar of een petrischaal muren. Condensatie wordt geminimaliseerd tijdens de plaat uitstort en tijdens de incubatie. Tot slot wordt inoculum / gips / hout afstand tot een minimum beperkt, maar zonder dat contact. Deze minder technische aspecten van agar-block design zijn ook de meest voorkomende oorzaken van falen en de belangrijkste bron van variatie tussen studies. Video publicatie is dan ook nuttig in dit geval, en we zien een lage variabiliteit, resultaten van hoge kwaliteit.

Protocol

Dit protocol is van toepassing op houtige en niet-houtachtige ondergronden, zoals geschetst, alsmede op de oven-of lucht gedroogd materiaal. Lees eerst door het protocol, maar voor de set-up. Er zijn verschillende punten die van toepassing kunnen zijn op je studie, en deze punten (onderstreept) vereisen planning. Merk ook op dat er twee gepubliceerd agar-block methoden die nu worden gebruikt, een van de British Standard 838 en een ander na een International Research Group on Wood Protection (IRG-WP) papier ingediend door Moed (1978). Onze methode lijkt op 838, met wijzigingen in de eerste plaats in de microkosmos ontwerp en de controle van de agar medium, maar nogmaals, beide benaderingen zijn vaak vermeden vanwege het historische vocht controle-aangelegenheden in hout blokken, waardoor zuurstofgebrek en variabiliteit. Een goede review van deze testmethoden dat de discussie van agar-block ontwerpen, inclusief de 838 standaard omvat, kan worden gevonden in Nicholas (1973).

1) voorbereiden microkosmossen

Microkosmossen voor deze onderzoeken zijn 1 cm groter (dieper) dan de typische petrischalen, het verhogen van het hoofd ruimte boven houtblokken. Ze zijn gevuld met een bescheiden en exacte bedrag van agar-agar in om absolute hoeveelheden voedingsstoffen controle, in aanvulling op hun concentratie, en om hout te blokken te houden uit de buurt (> 3 mm) uit het deksel. De agar wordt gebruikt in dit geval van gips testen is een laag-calcium-Type A agar, maar tonen we representatieve resultaten met behulp van Blakeslee's medium, het ATCC aanbevolen medium voor het behoud van de test te isoleren van de Serpula lacrymans (Wulfen: Fries) Schroeter stam EMPA 65 ( ATCC 32750).

Dit ontwerp houdt de plant weefsels uit de buurt van agar contact en weg van de schaal deksel en muren. Variabele bevochtiging van lignocellulose substraten is de belangrijkste bron van variabiliteit in de agar-block tests. Bevochtiging het vochtgehalte te verhogen leidt tot zuurstofgebrek en onderdrukt of zelfs stopt aërobe biologische afbreekbaarheid. Het creëert ook een probleem voor iedereen die het bestuderen van oxidatieve mechanismen van bruin en wit rot schimmels die verantwoordelijk zijn voor hout ontbinding. Condensatie op de plaat deksel is een probleem als gratis water druppels vormen en nat van de ondergrond. Zo zal hout en andere weefsels snel 'pit' water uit agar wanneer ze in contact, wat leidt tot vocht inhoud van meer dan 80% (droge gew. Basis) en de stopzetting van aërobe degradatie. Weefsels moet afstand van deze waterbronnen, waardoor de filamenteuze schimmel te vinden, verbinden, en de controle vocht in de ondergrond.

1. Maak genoeg agar media om het gewenste aantal petrischalen vullen met 20 ml agar, per stuk. We maken gebruik van vijf repliceert (n = 5) per behandeling, bepaald door de kracht analyse met behulp van eerdere resultaten.
2. Voor de calcium-en ijzer-vrij Type A-agar, voegen we 15 g agar aan een maatkolf van 500 ml bevat ongeveer 400 ml gedeïoniseerd water gewijzigd met 1,0 g NH ₄ NO _3, 1,0 g monobasisch KH ₂ PO _4, 0,25 g MgSO ₄ x 7H ₂ O, en 1,0 g glucose. Aan het mengsel, gebruiken we voorraad oplossingen om micronutriënten toe te voegen. We voegen 50 ul elk van H ₃ BO ₄ (0,057 g / 100 ml) en ZnSO ₄ (0,031 g / 100 ml). We voegen 50 ui elk van MnCl ₂ (0,036 g / 100 ml), CuSO ₄ (0,039 g / 100 ml), en (NH _{4) 6} Mo ₇ O ₂₄ (0,018 g / 100 ml). Zodra voedingsstoffen worden toegevoegd, vul de maatkolf om de 500 ml lijn.
3. Een typische calcium toevoeging in dit geval zou zijn 0,05 g CaCl ₂ x 2H ₂ O / 500 ml. In ons geval gebruiken we agar calcium als een behandeling, met een 5 mM uiteindelijke concentratie. We teller de toename van de ionische sterkte en chloride toevoeging door toevoeging van 5 mM NaCl naar de andere microkosmossen. Op dezelfde manier maken we gebruik van ijzer-vrije media voor deze demonstratie, maar in gevallen waar ijzer is opgenomen, mixen we 0,112 g FeSO ₄ met 2 ml gedeïoniseerd water en voeg 50 ul van deze verse oplossing (niet op voorraad) onmiddellijk na vortexen. In elk medium waar u controle toevoegingen van voedingsstoffen, is het verstandig om de pH te testen voordat autoclaaf. Zure of basische toevoegingen (bijv. FeCl ₃₎ is van invloed op stolling.
4. Mediabestanden naar een kolf en het medium autoclaaf bij 121 ° C en 16 psi gedurende 20 minuten. We doen niet meer dan 500 ml volumes (per 1000 ml fles), om te voorkomen dat agar stollen voordat we kunnen het allemaal toe te dienen aan de test platen.
   
   (Let op:.. Het is verstandig bij het gebruik van alternatieve media, in het bijzonder minimale voedingsagar met toegevoegde basale zouten, om eerst te controleren of de test schimmel groeit op het High ionische sterke groei kunnen remmen of zelfs doden uw test te isoleren)
5. Gebruik een draagbare pipet-aid en 10 ml steriele polystyreen pipetten om aseptisch overbrengen agar-agar in een bioveiligheid kast, een keer kolven cool. Letting media koel om aan te raken is het belangrijk hier om condensatie te minimaliseren. Ook stapel borden hoog als ze zijn gegoten, om gratis water te minimaliseren op de deksels. Terwijl condensatie is een hinderlijk in de normale kweken, hier vertegenwoordigt een groot probleem als droPlets vorm en nat het hout. Vochtgehalte (MC) meer dan 80% (droge stof), zal leiden tot zuurstoftekort in weefsels, te beperken verval door aërobe schimmels, en meer variabiliteit. Bereken MC als volgt:
   
   MC * = [(vers gewicht x droog gewicht) / drooggewicht] x 100
   
   * (MC kan meer dan 100% - dit kan een vreemde manier om MC te berekenen lijken, maar is standaard)
   1. Alternatief microkosmossen: Als plantaardige weefsels worden getest die moeten vooraf worden gemalen en gezeefd (bijvoorbeeld maïsstro stengels en bladeren, samen), zijn er twee opties schotel die we gebruiken. Verdeeld petri platen zijn verkrijgbaar met 2 of 4 secties, en agar kunnen worden uitgesloten van de compartimenten met poeder. Verhard agar kan ook worden gesneden en een deel verwijderd om ruimte voor poeder verlaten, maar zorg moet worden genomen om gelijke agar volumes blijven als de beschikbaarheid van voedingsstoffen moet worden geregeld onderhouden.
6. Voeg royaal plastic gaas roosters gesneden om de plaat oppervlak, met behulp van grondig gewassen en geautoclaveerd roosters toegevoegd aseptisch. We gebruiken een product, Gutter Guard (35 x 50 mm, 2 mm dik), voor onze mazen, en gebruik hebben gemaakt van scanning electron microscopie aan een schoon oppervlak after zeep en water wassen laten zien en een gebrek aan schimmel penetratie te tonen. We hebben gemengd succes met glasvezel filters en met het leggen van blokken direct op ontwikkeld mycelia, zowel als gevolg van wicking problemen. U krijgt verval, maar uw coëfficiënt van variatie (CV) zal hoog zijn, waardoor de behandeling vergelijkingen statistisch zwak. We gebruikten glazen staven eerder, maar blokken zijn gevoelig voor afglijden stangen bij het weggeduwd, waardoor er blokken in contact met agar. Een goed alternatief is in te vullen cirkels gesneden om de platen te passen, cutting edge een weg naar inoculum tegemoet te komen. In het algemeen, snijd grids om uw eigen te passen set-up, maar zorg ervoor dat ze liggen volledig vlak in de petrischaaltjes.

2) Voorbereiden van 'Block' Substrates

Deze protocollen zijn ontwikkeld voor massief hout, maar zijn aanpasbaar voor andere plantaardige weefsels. Massaverlies is de standaard maat voor verval vooruitgang in hout afgebroken door filamenteuze schimmels. Zo, onze aanpak maakt gebruik van oven-droge gewichten pre-en post-verval naar massaverlies te bepalen. Echter, voor alle bio-energie onderzoek, waarbij de focus ligt op het plantenweefsel scheikunde, velen vinden dat de lucht drogen weefsels voorkeur verdient. We tonen hier protocollen voor de voorbereiding van uw agar-block culturen in de oven gedroogd uitgangsmateriaal te gebruiken, maar geven de alternatieve informatie aan de lucht drogen en ook om poeder in plaats van vaste substraten proces.

1. Voor deze demonstratie maken we gebruik van Zuid-Yellow Pine (SYP). SYP is een commercieel verkrijgbare hout vertegenwoordigt de overgrote meerderheid van hout gebruikt in de woningbouw in de VS Het kan een van de vier Pinus soorten. Niet-behandelde hout wordt gebruikt en knoop-vrije blokken worden gesneden uit een enkele rip (lengte gesneden) langs de korrel (19 x 19 mm). Dit minimaliseert chemische variabiliteit in het hout. Deze lengte wordt gesneden in 19 mm ³ blokken. Wij gebruiken dit formaat voor de bodem-block proeven, en snijd veel blokken in een enkele sessie op de tafel zag.
2. De 19 mm ³ blokken worden gebruikt in agar-block microkosmos worden verder opgesplitst in tweeën langs de korrel, met behulp van een beitel en hamer, een zaag niet. Dit maakt een ruw blok rand naar beneden gezicht op het plastic gaas, en een gladde bovenkant te labelen. Label blokken met potlood. Als je niet kunt label uw ondergronden, moet u een systeem om gelijke tred te houden met samples uit te werken. Gesneden genoeg blokken om uw behandelingen te voldoen (weer maken we gebruik van n = 5 per behandeling), evenals niet-geïnoculeerde controles die zal dienen als verontreiniging monitoren en als baseline data monsters, geconditioneerd in parallel.
3. Voor de oven gedroogd materiaal, plaats monsters in een convectie oven bij 100 ° C gedurende 48 uur. Als er lucht gedroogd materiaal nodig is, de toestand van de monsters in een kamer of ruimte met een constante luchtvochtigheid en temperatuur. We maken gebruik van 65% RV en 20 ° C, en we meestal rekenen op 10-14 dagen conditioning, afhankelijk van het materiaal.
4. Pre-wegen uw monsters op de initiële oven-droge of verse gewicht te bepalen. Met monsters uit de oven, alleen de overdracht van monsters naar een exsiccator afkoelen en wegen.
   1. Alternatief droging aan de lucht: Met de air-gedroogd materiaal, neem vijf monsters (n = 5; offer zullen deze niet worden gebruikt in microkosmos), wegen ze vers, oven-droog ze zoals hierboven, en wegen opnieuw na het drogen. Bereken een vocht correctiefactor voor elk van de twee blokken als volgt:
      
      MC correctiefactor = drooggewicht / versgewicht
      
      Voorbeeld: 2,46 g (droog) / 2,68 g (vers) = 0.918, dus een 3,0 g verse blok is 2,75 g oven gedroogd
      
      Het gemiddelde van de vijf monsters aan de gemiddelde correctiefactor te verkrijgen. Dan weegt al uw lucht gedroogd blokken. Vermenigvuldig elk gewicht door het gemiddelde van MC correctiefactor op de initiële ovendroog gewichten te bepalen.
5. Autoclaaf gelabeld monsters bij 121 ° C en 16 psi gedurende 1 uur, of langer met grotere steekproeven. Stevig folie om nat te minimaliseren.
   1. Alternatief,ve sterilisatie: Gamma straling kan worden gebruikt voor het steriliseren, indien beschikbaar. We hebben getest vuren en beukenhout die eerder voor de effecten van temperatuur op de hemicellulose verlies, en vond ze niet, samen met geen kracht verlies of kleur te veranderen. Dit kan echter verschillen tussen substraten en uw voorkeuren / behoeften, en gammastraling is een bewezen alternatief.
6. Voor deze demonstratie, testen we de rol van vaste gips (zuivere versus 1% FeSO ₄₎ op de degradatie van onze grenen (SYP) monsters. Deze worden gemaakt als schijven met exacte oppervlakte en volumes, weer naar hun beschikbaarheid controle in aanvulling op hun concentratie. Deze worden apart geautoclaveerd en toegevoegd tijdens de inoculatie stap. We hebben een schijf voor elk blok, en we zijn het toevoegen van twee blokken per petrischaaltje twee oogsten mogelijk te maken.

3) inenten & Labeling

Inenten van agar-block microkosmos is meer tijd in beslag dan enten bodem-blok potten. Voor ons, we rekenen op elke inenting te nemen 3 minuten. Om petrischalen met agar, dit is het punt van toevoeging voor gaas, hout, eender welke exogene bronnen van voedingsstoffen (hier, gips pellets), en de schimmel. Er is meer kans op besmetting als gevolg van de hoeveelheid tijd die het deksel open is en het aantal bezoeken binnen. Er zijn ook een aantal belangrijke fouten die vaak gemaakt in dit stadium, en deze zijn het best gedekt door koppeling video met tekst. Bekijk de video.

1. In een steriele bioveiligheid kast, monteren uw lege agar gerechten, een bron plaat voor uw schimmel inoculum (we gebruiken 2 wk culturen), mesh, plant substraat (hout), exogene materialen, een Sharpie, parafilm strips, en overdracht tools. We vlam steriliseren met behulp van 70% ethanol, en we gebruiken een transfer tool voor inoculum en tangen voor de blokken en mesh. Parafilm moet worden gesneden met een scheermes om een ​​inkepingen aan de randen te voorkomen. Nicks in parafilm leiden tot breekt wanneer afdichten, en dit zal verdringen samples en vereisen re-entry.
2. Vlam overdracht gereedschap of tang voor het toevoegen van het volgende (in deze volgorde):
   1. Plastic mesh.
   2. Hout substraat. Voor onze demonstratie, voegen we twee houten blokken langs de lengte van het gaas, beiden van dezelfde oorspronkelijke blok dat werd gesplitst, zodat we kunnen gegevens koppelen uit de vroege en late oogsten. Deze blokken worden toegevoegd naast elkaar, met de nerf einde (hout doorsnede) met uitzicht op de punt van de bron van de schimmel inoculum.
   3. Exogene materialen. Hier testen we de rol van gips op verval door een filamenteuze schimmel. Daarom willen we de schimmel om deze gips schijven ontmoeting vóór het bereiken van het hout, en dus een gips schijf toe te voegen tussen elk punt inoculum en blokkeren op de top van de maas. Dit betekent dat het toevoegen van 2 schijven per microkosmos. Sta niet toe dat het contact tussen schijven en het hout, maar hou ze dicht.
   4. Fungal inoculum. We maken gebruik van een # 4 kurkboor met 7 mm diameter op stekkers te maken van twee-wk culturen gekweekt in 20 ml agar. Dit helpt bij de controle inoculum volume. Voor niet-geïnoculeerde controles, is het het beste om een ​​plug toevoegen uit een steriel bord. We meestal toe te voegen deze stekkers op de agar, en niet op de mesh. Sta niet toe dat het contact tussen inoculum en ofwel de exogene substraten of het hout, maar nogmaals, plaats ze dicht bij elkaar. Er is een inoculum plug per blok.
      
      Opmerking: Het is verstandig om deze inhoud monteren in een agar schotel voordat om te zorgen voor ten minste 3 mm van het hoofd van de ruimte zijn, dat er minstens 3 mm afstand tussen de houten blokken en de deksel muren zijn, en dat uw kunststof mesh dimensies zal gemakkelijk aan al uw substraten.
3. Parafilm gerechten om ze te verzegelen, het houden van een alcohol vlam branden en met een pincet klaar. Houd platen horizontaal en wikkel parafilm in een vloeiende continue beweging. Als parafilm breekt of indien de inhoud verdringen, verwijder parafilm, opnieuw in te voeren en monteren de inhoud, en probeer het opnieuw.
4. Label de schotel deksels met behulp van een alcohol-bestendig marker, etikettering bloknummers direct over bovenkant van de respectieve substraten. We hebben ook cirkels over het gips schijven. Als hout vergaat, zal je waarschijnlijk verliest de mogelijkheid om etikettering lezen op de substraten. Het is belangrijk om gelijke tred te houden met de schotel positie. Ook moet je niet onderschatten de mogelijkheid voor een schimmel te degraderen of koloniseren groot aantal andere materiaalsoorten, waaronder metalen.
5. Als u delicate assemblage op uw mesh, voorzichtig overbrengen platen naar de incubator. We hebben maar een keer, botste de bak van de platen tegen een deur jam en moest opnieuw monteren van de platen. Neem de tijd, en het plot uw route. Het is een eenmalige zorg, dus zorg dat een keer.

4) broedt & Oogsten

Platen kunnen worden geïncubeerd op uw schimmel pak, maar moet worden bewaard in een biologisch incubator, indien mogelijk, om condensatie te wijten aan temperatuur schommelingen te vermijden. Tijdreeksen oogsten zijn aseptisch gedaan, behalve de laatste oogst. Als deze tussenliggende oogsten worden gedaan na groei opde substraten is belangrijk, het hanteren van de platen is makkelijker omdat hyfen Cross Link substraten.

1. Voor onze demonstratie, we Incubeer de platen bij 20 ° C en in het donker. Op een week vijf oogst punt, verwijderen we de hele behandeling lot, spray elk onder-en bovenkant met 70% ethanol en het gebruik gevlamd tang om materiaal te verwijderen in de bioveiligheid kast.
2. Maak foto's voor het vernietigen van agar-platen, met de nadruk op een morfologie of melanisatie.
3. Verwijder de blokken te worden behandeld als uw behoeften vereisen. Gebruik uw vinger om weg te rollen overtollige hyfen (met nitril handschoenen), maar wees voorzichtig geen vergaan materiaal te verliezen. We meestal ovendroog blokken in aluminium pannen om te wegen massaverlies te bepalen, met behulp van verse en droge gewicht van controles om te controleren op overmatige wicking. We hebben ook het etiket en het bijhouden van donkerbruin blokken die duidelijk zijn water-logged, hoewel dit moet minimaal worden na deze aanpak. Massaverlies gegevens helpen meter verval vooruitgang, en het is belangrijk gegevens als elementaire concentraties worden berekend op een gram-basis van het gewicht, later. Bedenk ook dat percentage gegevens moeten worden genormaliseerd voor de statistiek. We berekenen als volgt:
   
   Massa% verlies = [(begingewicht uiteindelijke gewicht) / begingewicht] x 100
   1. Alternatief droging aan de lucht: Als u drogen aan de lucht, met uw doel om biologisch te behandelen van het materiaal verder, je moet de conditionering regime gebruik van paragraaf 2.3 tot reviseren. Als je moet massaverlies te bepalen, het zal een maat voor vochtgehalte, Een oplossing is om blokken (of poeder) te splitsen in een grote en kleine portie. Weeg beide, maar alleen de oven drogen van de kleine portie. Bereken het vochtgehalte conversie-factor, zoals hierboven, en vervolgens toepassen op het totale versgewicht van de kleine + grote porties (in totaal blok vers gewicht). Vooral als voorbehandeling van materiaal met een schimmel voorafgaand aan de versuikering of andere processen, massa verlies zal u helpen met de massabalans vastberaden later en is verantwoordelijk voor koolhydraten verbruikt door de schimmel.
4. Vernietig de culturen in autoclaveerbare zakken, maar bewaar plastic ondersteuning gaas en alle andere componenten die kunnen worden hergebruikt voor gebruik in toekomstige experimenten.

5) interpreteren van de resultaten

Lignocellulose weefsels zal meestal verval langzamer in agar-block ontwerpen, maar op dit punt moet je relatief lage variabiliteit hebben zelfs bij gematigde verval niveaus. Je moet ook matige (20-50%), niet hoog vochtgehalte in de hand weefsels.

1. Vochtgehalte (op een droge stof) in hout niet worden blootgesteld aan schimmels zijn meestal matig, ongeveer 40% in deze demonstratie. Dit ligt boven het vezel verzadigingspunt (FSP) van den (normaal rond 24%), wat betekent dat er een aantal gratis water boven de water gebonden binnen de lignocellulosische secundaire celwand. Dit betekent ook dat sommige wicking waarschijnlijk optreedt. Een RV van 100% moet nog steeds niet toestaan ​​dat hout MC aan de FSP overschrijden. Uw ontwerp kunnen bereiken verschillende resultaten afhankelijk van de ondergrond en mesh selectie. De sleutel is om vocht de inhoud te houden dan 85% of zo, op een droge stof.
2. Het% massaverlies in hout afgebroken in deze agar-block microkosmos is meestal rond de 30% na 16 weken voor de meeste schimmels. Voor bepaalde schimmels, in dit geval Serpula lacrymans, schimmels is volledige afbraak te realiseren in deze tijd,> 60% massa verlies. S. lacrymans is een bruinrot schimmel, het verwijderen van kleine lignine, zodat 62% massaverlies in dit onderzoek betekent dat verval in de buurt of in het verleden voltooiing. Witrot schimmels zal verwijderen lignine, en massa verlies afhankelijk van soorten als substraat.
3. Zorg ervoor dat hyfen morfologie op te nemen. In deze demonstratie heeft hyfen morfologie niet inherent tonen het succes of falen in een een behandeling, maar de melanisatie kleuren waren belangrijk. Het liet ons toe om de rol van ijzer betrekking als een onzuiverheid in gips om oudere studies als Low et al.. (2000), waar de inheemse materialen werden getest en waar deze 'roest' inkleuring werd waargenomen. De rol van calcium en ijzer werden besproken op Low et al.. (2000), en hier zien we uitgebreid verval met ijzer, calcium niet, en deze zelfde roestkleurige hyfen.
4. Als u wilt concentraties van alles te meten in deze gedegradeerd hout, is het best te normaliseren voor massa verlies. Als, bijvoorbeeld, calcium is niet geïmporteerd of geëxporteerd uit hout vervallen 50%, de concentratie op basis van gewicht zal verschijnen om van tijd nul te verdubbelen om de laatste oogst. Dat komt omdat een g poeder vertegenwoordigt nu twee keer het hout volume dan het deed op het tijdstip nul. De schimmel verbruikt 50% van de matrix, afnemende dichtheid. Normaliseren van een bepaalde concentratie (bv. mmol / g) om te compenseren voor massaverlies als volgt:
   
   Genormaliseerde concentratie = mmol / gx [1 - (% Mass verlies / 100)]
   
   Voorbeeld: 10 mmol / g Ca in hout gedegradeerde 20%, versus 7 mmol / g op het tijdstip nul.
   
   Vraag: Hebben Ca-gehalte te verhogen tijdens het verval?
   
   10 mmol / g is een schijnbare 3 mmol / g te verhogen, een stijging van 43%, maar one gram poeder op verwilderde hout met een lagere dichtheid vertegenwoordigt nu een groter volume. Normalisatie is nodig om de initiële en de uiteindelijke Ca content te vergelijken in gelijke hout volumes.
   
   10 x [1 x (20% / 100)] = 8 mmol / g genormaliseerd
   
   Antwoord: Ja, Ca deed toenemen, maar met 14%, niet 43%.
   
   (De gegevens kunnen ook worden uitgedrukt per volume-hout, mmol / cm ^3, door vermenigvuldigen met de dichtheid.

Figuur 1. Agar-block microkosmos, zoals uiteengezet in deze demonstratie, voor incubatie.

Figuur 2. Serpula lacrymans koloniseren grenen houten blokken rusten op plastic gaas te blokken boven agar-contact verheffen. Dit mycelium is een belangrijke verbinding tussen hout en exogene voedingsstoffen / element bronnen, en het beheersen van deze exogene materiële bronnen in de agar of als vaste materialen is een belangrijk voordeel van agar-block design, versus bodem-block design.

Figuur 3. Gemiddeld% gewichtsverlies, als maat voor de omvang van hout verval door Serpula lacrymans na 5 en 15 weken incubatie met pijnbomen in agar-block microkosmossen. Behandeling waren geen (Ca-vrij), 5 mM CaCl ₂ toegevoegd aan agar (CaCl _2),> 99% zuiver gips (CaSO _4), of 1% ijzer-gewijzigd gips. Beschermde ANOVA betekent vergelijkingen werden Tukey's test gebruikt, met α = 0,05. Voor elke oogst, bars onder dezelfde letter zijn niet significant verschillend. Foutbalken = standaarddeviatie. Gepubliceerd in Schilling (2010).

Figuur 4. Overhead foto (A) van alle vijf herhalingen in week 15 van het verval door dezelfde bruinrot-test schimmel, Serpula lacrymans, evenals de blokken (B) verwijderd en de oven gedroogd. Let op het ontbreken van melanisatie in Ca-vrije behandeling, de vergeling in pure calcium behandelingen, en de roest verschijning in ijzer-gewijzigde behandeling. Behandelingen worden aangeduid als in figuur 3, met de controle in (B) niet-geïnoculeerde blokken voor vergelijking.

Figuur 5. Overhead foto uit een andere proef met een hogere concentratie ijzer medium, mout-agar Blakeslee's. Gewezen op het verlies van waargenomen melanisatie, in vergelijking met figuur 4. Blokken verwijderd en gewogen toonden geen effect van de behandeling op gewichtsverlies. Dit wordt gepresenteerd als een demonstratie van de invloed van exogene componenten van deze te blokkeren proeven. Deze effecten zouden niet toetsbaar zijn in de grond-block jar ontwerpen, waar deze exogene ingangen zijn te moeilijk te controleren.

Discussion

Met behulp van onze agar-blok set-up (figuur 1) Serpula lacrymans groeide in direct contact met het gips oppervlakken en in hout blokken (figuur 2), wat leidt tot meer dan 60% gewichtsverlies in de controlegroep bruin-verteerde grenen blokken (zie figuur 3 ). Dit voldoet aan gemakkelijk de ASTM-norm doel van> 50% verval, en de gemiddelde variatiecoëfficiënt (C _V) in verval was op 0,055 in week 16. Deze gegevens zijn gepubliceerd in Schilling ^7. Nogmaals, andere schimmels een langere incubatie in agar-block dan in de bodem-block. Ter referentie hebben we met succes lopen soortgelijke modellen in verschillende vorige experimenten met een verscheidenheid aan andere schimmelsoorten, vaak met behulp van scanning elektronenmicroscopie met elektronen dispersieve spectroscopie (SEM-EDS) en inductief gekoppelde plasma (ICP-OES) om de connectiviteit te controleren met exogeen substraten en translocatie van calcium en andere elementen in hout ^8,9.

Naast de lage variabiliteit, zijn er twee andere resultaten die onze agar-blok ontwerp onthult. Eerst was er een behandeling effect (figuur 3), waar onze calcium toevoegingen, of de agar als CaCl ₂ of als pure gips, verval geremd door deze schimmel. Dit is een bruikbaar resultaat, want anderen hebben getheoretiseerd calcium verhoogt verval gebaseerd op studies met real-world materialen zoals mortel en gips. In plaats daarvan zien we vervalsnelheden rebound met de toevoeging van ijzer aan het gips, wat erop wijst ijzer, calcium niet, is de sleutel. De tweede bruikbaar resultaat is echter niet gekwantificeerd, maar is in plaats van de kleur van de mycelia (figuur 4). Er zijn belangrijke en duidelijk melanisatie verschillen in externe hyfen de verschillende behandelingen, en onderzoekers hebben eerder opgemerkt 'roest' melanisatie bij het ​​ondervinden van deze schimmel op bouwmaterialen (bijv. Low et al.. 2000). In onze meer recente studies, vonden we dat deze effecten verloren gaan met behulp van een high-ijzer medium (figuur 5). Collectief, het suggereert dat deze schimmel ijzer, calcium niet gebruikt, in deze materialen en dat eerdere studies, met de 'roestige' mycelia gerapporteerd, waren het observeren van ijzer effect, geen calcium effect.

Het algemeen worden deze resultaten en een gebrek aan behandeling effecten met behulp van high-ijzer agar zijn een zeer sterke demonstratie van de controle die de agar-blok ontwerp kan de onderzoeker voorzien, vooral in het licht van de alternatieve bodem-blok aanpak.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri dishes	Nalge Nunc international	4014	25 x 150 mm
Agar, Type A	Sigma-Aldrich	A4550
Ammonium nitrate, NH4NO3	Millinckrodt	3436-12
Potassium phosphate, KH2PO4	JT Baker	3246-01
Magnesium sulfate 7-hydrate, MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	230391
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Dextrose
Boric acid, H3BO4	Mallinckrodt Baker Inc.	2549-04
Zinc sulfate 7-hydrate, ZnSO4•7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	8880-12
Manganous chloride 4-hydrate, MnCl2•4H2O	JT Baker	2540-04
Copper(II) sulfate 5-hydrate, CuSO4•5H2O	Sigma-Aldrich	209198
Ammonium heptamolybdate 4-hydrate, (NH4)6Mo7O24•4H2O	Sigma-Aldrich	431346
Calcium chloride dihydrate, CaCl2•2H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	4160-12
Sodium chloride, NaCl	Mallinckrodt Baker Inc.	7581-12
Ferrous sulfate 7-hydrate, FeSO4•7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	5056-12
Pipet-aid	Drummond Scientific	4-000-110	Cordless EtOH the surface
10 ml sterile polystyrene pipette	BD Biosciences	357551
Gutter Guard	Thermwell Products Co.	VX620	Pre-scrubbed with soap Hardware store
Calcium sulfate hemihydrate, CaSO4•0.5H2O	Acros Organics	385355000
#4 cork borer	Boekel Scientific	1601
Parafilm "M"	Pechiney Plastic Packaging	PM-996