Summary
Este vídeo demonstra uma abordagem ambiente controlado para estudo de degradação dos tecidos vegetais lignocelulósicas por fungos aeróbicos. A capacidade de controlar fontes de nutrientes e umidade é uma das principais vantagens da ágar-bloco microcosmos, mas a abordagem geralmente produz sucesso misturado. Nós endereço armadilhas fundamental para o rendimento reprodutível, a variabilidade de baixa resultados.
Abstract
Os dois principais métodos para o estudo de biodegradação por fungos dos tecidos vegetais lignocelulósicas foram desenvolvidos para testes de madeira conservante (solo-bloco; agar-bloco). É bem aceito que o solo-bloco microcosmos rendimento maiores taxas de decomposição, menos problemas de umidade, menor variabilidade entre os estudos, e os limites mais altos de toxicidade conservante. Solo-bloco de teste é, portanto, a técnica mais utilizada e foi padronizado pela American Society for Testing and Materials (ASTM) (método D 1413-07). O projeto solo-bloco tem desvantagens, no entanto, utilizando fontes do solo localmente variável e em limitar o controle de nutrientes externos (exógenos) para os tecidos em decomposição. Estas desvantagens têm emergido como um problema na aplicação deste método para outros, objectivos de investigação cada vez mais popular. Estes objectivos modernos incluem lignocelulose degradante para pesquisa de bioenergia, biorremediação de testes de co-metabolizado tóxicos, avaliando mecanismos oxidativos e acompanhamento de elementos translocada ao longo das redes de hifas. Solo-blocks não se prestam controle suficiente nestas aplicações. Uma abordagem agar-bloco refinado é necessário.
Aqui, usamos a podridão parda madeira degradante fungo Serpula lacrymans de degradar a madeira em ágar-bloco microcosmos, utilizando pratos de Petri profunda com o cálcio de baixa agar. Nós testamos o papel do exógeno gesso em decadência em uma série de tempo, para demonstrar a utilidade e variabilidade esperada. Blocos de uma única placa de rip (corte longitudinal) são condicionados, pesado, autoclavado, e introduziu assepticamente em cima de malha de plástico. Inoculações com fungos estão em cada face do bloco, com gesso exógenas adicionadas às interfaces. Colheitas são assépticas até a colheita final destrutivo. Estes microcosmos são projetados para evitar o contacto bloco com agar ou paredes placa de Petri. Condensação é minimizada durante a derrama e placa durante a incubação. Finalmente, inóculo / gesso / madeira espaçamento é minimizada, mas sem permitir contato. Estes aspectos menos técnica do agar-block design são também as causas mais comuns de fracasso e a principal fonte de variabilidade entre os estudos. Publicação de vídeo é, portanto, útil, neste caso, e demonstrar a variabilidade de baixa e de alta qualidade resultados.
Protocol
Este protocolo aplica-se a substratos lenhosos e não lenhosos, como descrito, bem como ao material forno ou seca ao ar. Leia o primeiro protocolo, no entanto, antes de set-up. Há vários pontos levantados que podem ser aplicadas para o seu estudo, e esses pontos (sublinhado) exigem planejamento. Além disso, observe que existem dois publicados agar-bloco métodos que são usados ocasionalmente, um a British Standard 838 e outro na sequência de um Grupo de Pesquisa Internacional sobre Proteção Wood (IRG WP) documento apresentado pela Bravery (1978). Nosso método se assemelha a 838, com modificações principalmente na concepção microcosmo eo controle do meio de agar, mas, novamente, ambas as abordagens são muitas vezes evitado devido a problemas de umidade histórico de controle em blocos de madeira, causando anoxia e variabilidade. Uma boa revisão desses métodos de teste que inclui a discussão de agar-block designs, incluindo o padrão 838, pode ser encontrado em Nicolau (1973).
1) Preparando Microcosmos
Microcosmos para estes ensaios são um centímetro mais alto (mais profundo) do que os pratos típicos de petri, aumentando o espaço da cabeça acima de blocos de madeira. Eles são preenchidos com uma quantidade modesta e exato de agar, a fim de controle absoluto quantidades de nutrientes, além de sua concentração, e para manter blocos de madeira bem longe (> 3 mm) a partir da tampa. O agar usado neste caso de ensaio de gesso é um tipo de cálcio-A agar, no entanto, mostramos resultados representativos usando médio Blakeslee, o meio ATCC recomendado para manter o teste isolado de Serpula lacrymans (Wulfen: Fries) Schroeter tensão EMPA 65 ( ATCC 32750).
Este projeto mantém tecidos vegetais longe do contato agar e longe da tampa do prato e paredes. Molhar variável de substratos lignocelulósicos é a principal fonte de variabilidade em bloco de ágar-testes. Molhando para aumentar o conteúdo de umidade cria anoxia e suprime ou mesmo pára biodegradação aeróbica. Ele também cria um problema para quem estuda mecanismos oxidativos de fungos podridão parda e branca responsáveis pela degradação da madeira. Condensação nas tampas de placas é um problema se de forma livre gotículas de água e molhar o substrato. Da mesma forma, madeira e outros tecidos vontade "pavio" água rapidamente de agar quando em contato, levando a teores de umidade superior a 80% (em peso seco. Base) e travar a degradação aeróbica. Tecidos devem ser afastados dessas fontes de água, permitindo que o fungo filamentoso para encontrar, conectar e controle da umidade dentro do substrato.
- Fazer o suficiente para encher ágar o número desejado de placas de Petri com 20 ml de ágar, cada. Usamos cinco repetições (n = 5) por tratamento, determinado pela análise de energia usando resultados anteriores.
- Para o cálcio e ferro livre Tipo A agar, nós adicionamos 15 g de ágar para um balão volumétrico de 500 ml, contendo aproximadamente 400 ml de água deionizada alterada com 1,0 g NH 4 NO 3, 1,0 g monobásico KH 2 PO 4, 0,25 g MgSO 4 x 7H 2 O, e 1,0 g de glicose. À mistura, usamos soluções de reserva a acrescentar micronutrientes. Nós adicionamos 50 ul cada um de H 3 BO 4 (0,057 g / 100 ml) e ZnSO 4 (0,031 ml g / 100). Nós adicionamos 50 ul de cada MnCl 2 (0,036 g / 100 ml), CuSO 4 (0,039 g / 100 ml), e (NH 4) 6 Mo 7 O 24 (0,018 ml g / 100). Uma vez que os nutrientes são adicionados, encher o balão volumétrico até a linha de 500 ml.
- A adição de cálcio típico neste caso seria 0,05 g CaCl 2 x 2H 2 O / 500 ml. No nosso caso, usamos cálcio ágar como um tratamento, com uma concentração de 5 mM final. Nós contra o aumento da adição de cloreto de força e iônica por adição de 5 mM NaCl para o microcosmos outros. Da mesma forma, usamos o ferro-free media para esta demonstração, mas nos casos em que o ferro é incluído, nós misturamos 0,112 g de FeSO 4 com 2 ml de água deionizada e adicionar 50 ul da solução fresca (não de ações) imediatamente após vórtex. Em qualquer meio de comunicação onde você controla adições de nutrientes, é sábio para testar pH antes da autoclavagem. Adições ácidas ou básicas (por exemplo, FeCl 3) afetará a solidificação.
- Transferência de mídia para um balão e autoclave o meio a 121 ° C e 16 psi durante 20 minutos. Nós não ultrapassem 500 volumes ml (por frasco 1000 ml), para evitar ter de ágar solidificar antes de podermos administrar tudo isso para as placas de teste.
(Nota:.. É sábio ao usar meios alternativos, especialmente o mínimo de ágar nutriente, com adição de sais basal, em primeiro lugar verificar se o fungo teste crescerá nela alta força iônica pode inibir o crescimento ou até mesmo matar seu teste isolar) - Use um portátil pipeta de ajuda e 10 ml Pipetas estéreis de poliestireno para transferir agar assepticamente em um armário de biossegurança, uma vez frascos cool. , Deixando a mídia fria ao toque é importante aqui para minimizar a condensação. Além disso, a pilha de pratos de alta como eles são despejados, para minimizar a água livre sobre as pálpebras. Enquanto a condensação é um incômodo na cultura normal, aqui ele representa um grande problema se droPLETs forma e molhar a madeira. Teores de umidade (MC) mais de 80% (base peso seco) vai criar anoxia nos tecidos, a decadência limite por fungos aeróbicos, e aumentar a variabilidade. MC calcular da seguinte forma:
MC * = [(peso fresco x peso seco) / peso seco] x 100
* (MC pode exceder 100% - isto pode parecer uma forma estranha para calcular MC, mas é padrão)- Microcosmos alternativa: Se tecidos vegetais são testados que deve ser pré-moído e peneirado (por exemplo, talos de palha de milho e folhas, em conjunto), há duas opções de prato que usamos. Placas de petri dividida estão disponíveis com 2 ou 4 seções, e ágar podem ser excluídos da compartimentos com pó. Agar solidificada também pode ser cortado e uma porção removida para deixar espaço para o pó, mas os cuidados devem ser tomados para manter os volumes de agar igual restante se disponibilidade de nutrientes deve ser controlada.
- Adicionar generosamente cortar grades de malha de plástico para a superfície da placa, usando muito bem lavados e grades autoclavado adicionado assepticamente. Nós usamos um produto, Guarda Gutter (35 x 50 mm, 2 mm de espessura), para a nossa malha, e usaram microscopia eletrônica de varredura para mostrar uma superfície limpa após lavagem água e sabão e para mostrar a falta de penetração de fungos. Temos tido sucesso misturado com filtros de fibra de vidro e com blocos que estabelece diretamente no micélio desenvolvido, tanto devido a problemas de absorção. Você vai ter cárie, mas o seu coeficiente de variação (CV) será elevado, fazendo comparações de tratamentos estatisticamente fraca. Usamos bastões de vidro anteriormente, mas os blocos são suscetíveis a deslizar para fora varas quando empurrado, deixando blocos em contato com agar. Uma boa alternativa é cortar círculos completos para encaixar as placas, o corte de uma borda fora para acomodar inóculo. Em geral, corte grades para atender às suas próprias set-up, mas certifique-se que estava completamente plana nas placas de Petri.
2) Preparando Substratos 'Block'
Estes protocolos foram desenvolvidos para madeira sólida, mas são adaptáveis para outros tecidos vegetais. Perda de massa é a medida padrão para o progresso decadência em madeira degradada por fungos filamentosos. Assim, nossa abordagem utiliza forno-seque os pesos pré e pós-decadência para determinar a perda de massa. No entanto, para qualquer pesquisa de bioenergia, onde o foco está na química de tecidos vegetais, muitos acham que o ar de secagem dos tecidos é preferível. Mostramos aqui os protocolos para preparar o seu bloco de ágar-culturas de usar e secos ao forno material de partida, mas dar a informação alternativa para ar seco e também para processar pó em vez de substratos sólidos.
- Para esta demonstração, nós usamos pinho amarelo do sul (SYP). SYP é uma madeira comercialmente disponíveis que representam a grande maioria da madeira utilizada em habitações em os EUA Pode ser qualquer uma das quatro espécies de Pinus. Não tratados madeira é usada e sem nós blocos são cortados a partir de um único rasgo (corte longitudinal) ao longo do grão (19 x 19 mm). Isso minimiza a variabilidade química na madeira. Este comprimento é cortado em 19 milímetros três blocos. Usamos este tamanho para o solo de bloco de ensaios, e cortou muitos blocos em uma única sessão em cima da mesa viu.
- Os 19 mm 3 blocos a serem usados em agar-bloco microcosmos são ainda divididas pela metade ao longo do grão, usando um cinzel e martelo, e não uma serra. Isso faz com que um bloco de borda áspera a face para baixo sobre a malha de plástico, e um bom ponta de cima para rótulo. Blocos de etiqueta com lápis. Se você não pode rotular o seu substratos, certifique-se de conceber um sistema para acompanhar as amostras. Cortar blocos o suficiente para satisfazer os seus tratamentos (mais uma vez, usamos n = 5 por tratamento), bem como não-inoculados controles que servirá tanto como monitores de contaminação e como amostras de base de dados, acondicionado em paralelo.
- Para forno-dried material, amostras lugar em um forno de convecção a 100 ° C por 48 hr. Se o ar-dried material é necessário condição, as amostras em uma câmara ou sala com umidade e temperatura constantes. Nós usamos 65% de umidade relativa e 20 ° C, e nós geralmente contam com 10-14 condicionado dias, dependendo do material.
- Pré-pesar as amostras para determinar o peso forno-seco ou fresco inicial. Com amostras do forno, basta transferir as amostras para um dessecador para esfriar e pesar.
- Alternativa secagem ao ar: Com ar seco material, levar cinco amostras (n = 5; sacrificial estes não serão utilizados em microcosmos), pesá-los frescos, forno-seque-os como acima, e re-avaliar após a secagem. Calcular um fator de correção de umidade para cada um dos dois blocos da seguinte forma:
MC fator de correção = peso seco / peso fresco
Exemplo: 2,46 g (seco) / 2,68 g (fresco) = 0,918; assim, um bloco de 3,0 g fresca é de 2,75 g seca em estufa
Média das cinco amostras para obter o fator de correção média. Então, pesar todas as suas secas ao ar blocos. Multiplicar cada peso pelo fator médio de correção para determinar MC inicial forno-seque pesos.
- Alternativa secagem ao ar: Com ar seco material, levar cinco amostras (n = 5; sacrificial estes não serão utilizados em microcosmos), pesá-los frescos, forno-seque-os como acima, e re-avaliar após a secagem. Calcular um fator de correção de umidade para cada um dos dois blocos da seguinte forma:
- Autoclave rotulados amostras a 121 ° C e 16 psi durante 1 hora, ou mais, com amostras maiores. Firmemente folha para minimizar molhar.
- Alternatiesterilização ve: radiação gama pode ser utilizada para esterilizar, se disponível. Nós testamos abeto e madeira de faia anteriormente para efeitos da temperatura sobre a perda de hemicelulose, e não o achou, junto com nenhuma perda de força ou mudar de cor. No entanto, esta pode diferir entre os substratos e as suas preferências / necessidades, e radiação gama é uma alternativa comprovada.
- Para esta demonstração, estamos testando o papel de gesso sólido (pura versus 1% FeSO 4) sobre a degradação do nosso pinheiro (SYP) amostras. Estes são feitos como discos com áreas de superfície exata e volumes, uma vez mais para controlar a sua disponibilidade para além da sua concentração. Estes são autoclavados separadamente e adicionadas durante a etapa de inoculação. Precisamos de um disco para cada bloco, e estamos adicionando dois blocos por placa de Petri para permitir que duas colheitas.
3) inoculação & Labeling
Inoculando-agar bloco microcosmos é mais demorada do que a inoculação do solo bloco frascos. Para nós, contamos com cada inoculação tomar 3 min. Para placas de petri contendo agar, este é o ponto de adição de malha, de madeira, de quaisquer fontes exógenas de nutrientes (aqui, pellets de gesso), e os fungos. Há maior chance de contaminação por causa da quantidade de tempo que a tampa é aberta eo número de visitas no interior. Existem também vários erros chave que são comumente feitas nesta fase, e estes são os melhores cobertos pelo acoplamento de vídeo com o texto. Assista ao vídeo.
- Em um armário de biossegurança estéril, montar seus pratos agar vazio, uma placa de fonte para as suas inóculo fúngico (nós usamos duas culturas semana), malha, substrato vegetal (madeira), materiais exógenos, uma sharpie, tiras parafilme, e ferramentas de transferência. Nós chama esterilizar utilizando etanol 70%, e nós usamos uma ferramenta de transferência de inóculo e pinça para blocos e malha. Parafilm deve ser cortado com uma navalha para evitar qualquer nicks nas bordas. Nicks em parafilme levar a quebra quando de vedação, e isso vai se acotovelam amostras e requerem re-entrada.
- Chama ferramentas de transferência ou fórceps antes de acrescentar o seguinte (nesta ordem):
- Malha de plástico.
- Substrato de madeira. Para a nossa demonstração, vamos adicionar dois blocos de madeira ao longo do comprimento da malha, tanto a partir do mesmo bloco inicial, que foi dividido para que possamos par de dados a partir da colheita precoce e tardia. Estes blocos são adicionados lado a lado, com o fim de grãos (madeira transversal) de frente para o ponto da fonte de inóculo de fungos.
- Materiais exógenos. Aqui, estamos testando o papel de gesso em decadência por um fungo filamentoso. Portanto, queremos que o fungo para encontrar esses discos de gesso antes de atingir a madeira, e, assim, adicionar um disco de gesso entre cada ponto de inóculo e bloco em cima da malha. Isso significa que a adição de 2 discos por microcosmo. Não permitir o contato entre os discos ea lenha, mas mantê-los perto.
- Inóculo de fungos. Nós usamos uma broca # 4 de cortiça com 7 mm de diâmetro para fazer velas a partir de 2 semanas, culturas cultivadas em 20 ml de ágar. Isso ajuda a controlar o volume de inóculo. Para os não-inoculados controles, é melhor adicionar um plug de uma placa estéril. Normalmente, adicionar essas fichas para o ágar, e não na malha. Não permitir o contato entre inóculo e tanto a substratos exógenos ou a madeira, mas, novamente, colocá-los juntos. Existe uma ficha de inóculo por bloco.
Nota: É aconselhável para montar esses conteúdos em um prato de agar antes de começar a garantir que haverá pelo menos 3 mm de espaço de cabeça, de que haverá pelo menos 3 mm de distância entre os blocos de madeira e as paredes tampa, e que a sua malha de plástico dimensões facilmente acomodar seus substratos.
- Pratos Parafilm para selá-los, mantendo uma chama acesa álcool e com uma pinça pronto. Segure placas horizontais e envolva parafilme em um movimento suave e contínuo. Em caso de quebra parafilme ou se o conteúdo se acotovelam, remova parafilme, re-entrar e montar conteúdo, e tente novamente.
- Rótulo as tampas prato usando um marcador resistente ao álcool, rotulagem números de blocos diretamente por cima de substratos. Nós também desenhar círculos sobre os discos de gesso. Decai como madeira, você provavelmente vai perder a capacidade de ler a rotulagem nos substratos. É importante manter-se com posição do prato. Além disso, não subestime a capacidade de um fungo para degradar ou colonizar infinidade de tipos de materiais, incluindo metais.
- Se você tiver assemblage delicado em sua malha, a transferência de placas com cuidado para a incubadora. Temos, apenas uma vez, bateu o bin de placas de encontro a um atolamento da porta e teve que voltar a montar as placas. Tome seu tempo, e traçar a sua rota. É uma preocupação de uma só vez, por isso tome cuidado neste momento.
4) A incubação e colheita
As placas podem ser incubadas para atender às suas fungos, mas devem ser mantidos em uma incubadora biológica, se possível, para evitar a condensação devido a flutuações de temperatura. Colheitas de séries temporais são feitas de forma asséptica, com exceção da última colheita. Se estas colheitas intermediárias são feitas após o crescimento emos substratos é significativo, a manipulação das placas é mais fácil porque hifas substratos ligação cruzada.
- Para a nossa demonstração, incubar as placas a 20 ° C e no escuro. Em um ponto de colheita semana 5, removemos o lote inteiro de tratamento, spray de cada fundo e cubra com álcool 70% e utilize uma pinça para remover o material inflamado no interior do armário de biossegurança.
- Tirar fotos antes de destruir placas de ágar, com foco em qualquer morfologia ou melanização.
- Remover os blocos devem ser tratados como suas necessidades exigem. Use o dedo para rolar hifas excesso (com luvas de borracha nitrílica), mas tenha cuidado para não perder nenhum material deteriorado. Nós geralmente forno-seque blocos em alumínio pesam panelas para determinar a perda de massa, usando pesos fresco e seco de controles para monitorar a absorção excessiva. Nós também rotular e controlar todos os blocos do marrom escuro que são claramente de água-logged, embora este deva ser mínima a seguir esta abordagem. Perda de dados em massa ajuda a medir o progresso decadência, e é dado importante se as concentrações elementares devem ser calculados em uma base gramas de peso, mais tarde. Lembre-se também que os dados percentual deve ser normalizada para as estatísticas. Nós calculamos da seguinte forma:
A perda de massa% = [(peso inicial de peso final) / peso inicial] x 100- Alternativa secagem ao ar: Se você precisar de secagem ao ar, com seu objetivo de tratar biologicamente o material adicional, você deve usar o regime de condicionamento da Seção 2.3 para recondicionar. Se você deve determinar a perda de massa, que vai exigir uma medida do teor de umidade, Uma solução é dividir os blocos (ou pós) em uma parte grande e pequeno porte. Pesar tanto, mas só forno-seque a pequena porção. Calcular a umidade fator de conversão de conteúdo, como acima, e depois aplicá-lo ao peso fresco total de pequenas porções grandes + (peso do bloco fresco total). Especialmente se pré-tratamento de material com um fungo antes de sacarificação ou outros processos, perda de massa irá ajudá-lo com determinação de balanço de massa mais tarde e é responsável por carboidratos consumidos pelo fungo.
- Destruir as culturas em sacos autoclaváveis, mas salvar malha suporte de plástico e outros componentes que podem ser reciclados para uso em experimentos futuros.
5) Interpretação dos Resultados
Tecidos lignocelulósicos geralmente mais lenta decadência em ágar-block designs, mas neste momento você deve ter variabilidade relativamente baixa, mesmo em níveis moderados decadência. Você também deve ter moderada (20-50%) de umidade, não é alto em tecidos de controle.
- Teores de umidade (com base no peso seco) em madeira não expostos ao fungo são geralmente moderada, cerca de 40% nesta demonstração. Este é acima do ponto de saturação da fibra (FSP) de pinho (normalmente em torno de 24%), o que significa que há um pouco de água livre em excesso da água ligado dentro da parede celular lignocelulósica secundário. Isto também significa que alguns wicking provavelmente ocorre. UR de 100% ainda não deve permitir que a madeira MC exceder a FSP. Seu projeto pode alcançar resultados diferentes, dependendo do substrato e seleção de malha. A chave é manter o conteúdo de umidade abaixo de 85% ou mais, com base no peso seco.
- A perda de massa% em madeira degradada nestes microcosmos agar-bloco é normalmente em torno de 30% após 16 semanas para a maioria dos fungos. Para selecionar fungos, neste caso lacrymans Serpula, fungos vai conseguir a degradação completa neste tempo, perda de massa> 60%. S. lacrymans é um fungo podridão parda, a remoção de lignina pouco, para 62% perda de massa neste ensaio significa decadência é a conclusão perto ou passado. Fungos de podridão branca irá remover lignina, e perda de massa depende da espécie, bem como substrato.
- Tome cuidado para gravar a morfologia das hifas. Nesta demonstração, a morfologia das hifas não inerentemente mostram o sucesso ou o fracasso em qualquer um tratamento, mas as cores melanização eram importantes. Permitiu-nos relacionar o papel do ferro como impureza em gesso para estudos mais antigos, como Low et al. (2000), onde os materiais nativos foram testados e onde isso colorização 'ferrugem' foi observada. O papel do cálcio e ferro foram debatidos em Low et al. (2000), e aqui vemos decadência reforçada com ferro não, cálcio, e estas hifas cor de ferrugem mesmo.
- Se você quiser medir as concentrações de nada neste madeira degradada, é melhor para normalizar para perda de massa. Se, por exemplo, o cálcio não é importado ou exportado de madeira apodrecida de 50%, sua concentração em uma base de peso irá aparecer para o dobro do tempo zero até a colheita final. Isso é porque a 1 g de pó agora representa o dobro do volume de madeira que ele fez no tempo zero. O fungo consumiu 50% da matriz, diminuindo a densidade. Normalizar uma determinada concentração (por exemplo mmol / g) para compensar a perda de massa da seguinte forma:
Concentração normalizada = mmol / gx [1 - (% de perda de massa / 100)]
Exemplo: 10 mmol / g Ca em madeira 20% degradadas, versus 7 mmol / g no tempo zero.
Pergunta: Será que o aumento do teor de Ca durante o decaimento?
10 mmol / g é um aparente aumento de 3 mmol / g, um aumento de 43%, mas one grama de pó de madeira degradada com menor densidade representa hoje um volume maior. A normalização é necessária para comparar o conteúdo inicial e final Ca em volumes de madeira iguais.
10 x [1 x (20% / 100)] = 8 mmol / g normalizado
Resposta: Sim, Ca fez aumentar, mas 14% não, 43%.
(Os dados também podem ser expressos por volume de madeira, mmol / cm 3, multiplicando pela densidade.
Figura 1. Agar bloco microcosmo, instituída nesta demonstração, antes da incubação.
Figura 2. Lacrymans Serpula colonização blocos de madeira de pinho descansando em malha plástica para elevar blocos acima agar-contato. Este micélio representa uma importante ligação entre a madeira e exógenas de nutrientes / elemento fontes, e controlar estas fontes de material exógeno no agar ou como materiais sólidos é uma das principais vantagens da ágar-block design, contra projeto solo-bloco.
Figura 3. A média de perda de peso%, como uma medida da extensão da deterioração da madeira por Serpula lacrymans após 5 e 15 semanas de incubação com pinheiros em ágar-bloco microcosmos. Tratamento foram nenhum (Ca-free), 5 mM CaCl 2 adicionado ao ágar (CaCl 2),> 99% puro gesso (CaSO 4), ou 1% de ferro-gesso alterada. Protegidos ANOVA significa comparações foram por meio de testes de Tukey, com α = 0,05. Para cada colheita, bares sob a mesma letra não são significativamente diferentes. Barras de erro = desvio padrão. Publicado em Schilling (2010).
Figura 4. Overhead imagem (A) de todos os cinco repetições até à semana 15 de decomposição pelo fungo teste podridão parda mesmo, Serpula lacrymans, bem como os blocos (B) removidos e secos ao forno. Nota a falta de melanização em Ca-free tratamento, o amarelecimento em tratamentos de cálcio puro, eo aparecimento de ferrugem no ferro-alterada tratamento. Tratamentos são rotulados como na Figura 3, com o controle em blocos (B), sendo não-inoculado para comparação.
Figura 5. Overhead foto de um ensaio diferentes, utilizando um meio de maior concentração de ferro, ágar malte de Blakeslee. Observe a perda de melanização observada, em comparação com a Figura 4. Blocos removidos e pesados não mostrou nenhum efeito do tratamento sobre a perda de peso. Isto é apresentado como uma demonstração da influência dos componentes exógenos destes ensaios bloco. Estes efeitos não seriam testáveis em projetos solo de bloco-jar, onde estas entradas exógenas são muito difíceis de controlar.
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Discussion
Usando nosso agar-bloco set-up (Figura 1) Serpula lacrymans cresceu em contato direto com as superfícies de gesso e em blocos de madeira (Figura 2), levando a mais de 60% na perda de peso o marrom-apodreceu controle de blocos de pinho (Figura 3 ). Isso facilmente satisfaz o objetivo da norma ASTM> decaimento de 50%, eo coeficiente médio de variação (C V) em decadência na era 0,055 na semana 16. Estes dados estão publicados no Schilling 7. Mais uma vez, outros fungos exigirá mais tempo de incubação em ágar-bloco do que no solo-bloco. Para referência, conseguimos executar projetos similares em várias experiências passadas com uma variedade de outras espécies de fungos, muitas vezes utilizando microscopia eletrônica de varredura com espectroscopia dispersiva de elétrons (SEM-EDS) e acoplado indutivamente espectroscopia de plasma (ICP-OES) para verificar a conectividade com exógeno substratos e translocação de cálcio e outros elementos em madeira 8,9.
Além de baixa variabilidade, existem dois outros resultados que nosso projeto agar-bloco revela. Primeiro, houve um efeito de tratamento (Figura 3), onde o nosso adições de cálcio, se o ágar como CaCl 2 ou como puro gesso, inibida decadência por este fungo. Este é um resultado útil, porque os outros têm teorizado de cálcio aumenta a decadência com base em estudos do mundo real com materiais como argamassa e gesso. Em vez disso, vemos o índice de cáries rebote com a adição de ferro para o gesso, o que sugere o ferro não, cálcio, é fundamental. O segundo resultado útil, no entanto, não é quantificado, mas é em vez da cor do micélio (Figura 4). Existem diferenças significativas melanização e óbvia em hifas externas entre os tratamentos, e pesquisadores têm observado anteriormente melanização 'ferrugem' quando se deparam com este fungo em materiais de construção (por exemplo, Low et al. 2000). Em nossos estudos mais recentes, descobrimos que estes efeitos são perdidos usando um meio de alta ferro (Figura 5). Coletivamente, sugere que esse fungo utiliza o ferro não, cálcio, nestes materiais, e que estudos anteriores, com 'enferrujado' micélios relatados, estavam observando efeito de ferro não, efeito do cálcio.
Em geral, estes resultados ea falta de efeitos do tratamento com high-agar ferro são uma demonstração muito forte do controle que o projeto agar-bloco pode fornecer o pesquisador, especialmente à luz da abordagem do solo bloco alternativo.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dishes | Nalge Nunc international | 4014 | 25 x 150 mm |
| Agar, Type A | Sigma-Aldrich | A4550 | |
| Ammonium nitrate, NH4NO3 | Millinckrodt | 3436-12 | |
| Potassium phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 3246-01 | |
| Magnesium sulfate 7-hydrate, MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Dextrose |
| Boric acid, H3BO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 2549-04 | |
| Zinc sulfate 7-hydrate, ZnSO4•7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 8880-12 | |
| Manganous chloride 4-hydrate, MnCl2•4H2O | JT Baker | 2540-04 | |
| Copper(II) sulfate 5-hydrate, CuSO4•5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Ammonium heptamolybdate 4-hydrate, (NH4)6Mo7O24•4H2O | Sigma-Aldrich | 431346 | |
| Calcium chloride dihydrate, CaCl2•2H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 4160-12 | |
| Sodium chloride, NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581-12 | |
| Ferrous sulfate 7-hydrate, FeSO4•7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 5056-12 | |
| Pipet-aid | Drummond Scientific | 4-000-110 | Cordless EtOH the surface |
| 10 ml sterile polystyrene pipette | BD Biosciences | 357551 | |
| Gutter Guard | Thermwell Products Co. | VX620 | Pre-scrubbed with soap Hardware store |
| Calcium sulfate hemihydrate, CaSO4•0.5H2O | Acros Organics | 385355000 | |
| #4 cork borer | Boekel Scientific | 1601 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 |
References
- ASTM D1413-07. Standard test method for testing wood preservatives by laboratory soil-block cultures. . Annual Book of ASTM Standards. , 185-192 (2007).
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