Agar-Block mikrokosmos för kontrollerad växtvävnad Nedbrytning av Aerobic Svampar

Summary

Denna video visar en kontrollerad miljö tillvägagångssätt för att studera nedbrytning av lignocellulosa plantvävnader genom aeroba svampar. Förmågan att kontrollera näringskällor och fukt är en viktig fördel med agar-block mikrokosmos, men metoden ger ofta blandad framgång. Vi vänder kritiska fallgropar att ge reproducerbara, låg variabilitet resultat.

Abstract

De två huvudsakliga metoder för att studera svamp biologisk nedbrytning av lignocellulosa växtvävnad utvecklades för träskyddsmedel testning (jord-block, agar-block). Det är väl accepterat att jord-block mikrokosmos ge högre dämpfaktorer färre frågor fukt, lägre variationsrikedomen bland studier, och tröskelvärdena för konserveringsmedel toxicitet. Jord-block testning är därmed mer utnyttjad teknik och har standardiserats av American Society for Testing and Materials (ASTM) (metod D 1413-1407). Jorden-block design har nackdelar, men med hjälp av lokalt varierande jord källor och begränsa kontrollen av näringsämnen yttre (exogena) till ruttnande vävnader. Dessa nackdelar har uppstått som ett problem i denna metod till andra, allt populärare forskning mål. Dessa moderna syftar bland annat förnedrande lignocellulosa för bioenergi forskning, testning bioremediering av samarbete metaboliseras gifter, utvärdera oxidativa mekanismer och spårning flyttad element längs hyfernas nätverk. Jord-block lånar inte tillräcklig kontroll i dessa applikationer. En förfinad agar-blocket strategi är nödvändig.

Här använder vi brunröta trä-nedbrytande svampar Serpula lacrymans att förnedra trä i agar-blocket mikrokosmos, med djupa petriskålar med låg kalcium agar. Vi testar roll exogena gips på förfall i en tid-serien, för att visa nyttan och förväntad variabilitet. Kvarter från en enda styrelse rip (längsgående snitt) är betingad, vägde, autoklaveras och introducerade aseptiskt ovanpå plasten mesh. Svamp vaccinationer är i varje block ansikte, med exogen gips läggas till gränssnitt. Skördarna aseptiska fram till sista destruktiva skörd. Dessa mikrokosmos är utformade för att undvika att blockera kontakt med agar eller Petri väggar maträtt. Kondens minimeras under plattan häller och under inkubationstiden. Slutligen är inokulat / gips / trä avstånd minimeras, men utan att kontakt. Dessa mindre tekniska aspekter av agar-block design är också de vanligaste orsakerna till misslyckandet och viktig källa till variationsrikedomen bland studier. Video Publiceringen är därför användbar i detta fall, och vi visar låg variabilitet, högkvalitativa resultat.

Protocol

Detta protokoll gäller för Woody och icke vedartade substrat, som beskrivs, liksom till ugnen-eller lufttorkad material. Läs igenom protokollet först, men innan uppsättning. Det finns flera punkter som kan gälla för dina studier, och dessa punkter (understruket) kräver planering. Observera också att det finns två publicerade agar-blocket metoder som ibland används, en British Standard 838 och en annan efter en internationell forskargrupp på Wood Protection (IRG-WP) papper som lämnats av Bravery (1978). Vår liknar metod 838, med ändringar främst i mikrokosmos design och kontroll av agarsubstrat, men återigen, är båda tillvägagångssätten ofta undvikas på grund av historiska frågor fuktkontroll i trä block, vilket orsakar syrebrist och variabilitet. En bra genomgång av dessa testmetoder som inkluderar diskussion om agar-block mönster, inklusive 838-standarden, finns i Nicholas (1973).

1) Förberedelse mikrokosmos

Mikrokosmos för dessa studier är 1 cm längre (djupare) än typiska petriskålar, ökande huvudet ovanför trä block. De är fyllda med en blygsam och exakta mängden agar för att kontrollera absolut näringsämnen beloppen, utöver deras koncentration, och att hålla trä block långt borta (> 3 mm) från locket. Den agar användas i detta fall av gips testning är en låg-kalcium Typ A-agar, men vi visar representativa resultat med hjälp av Blakeslee medellång, den ATCC rekommenderade medium för att upprätthålla testet isolat av Serpula lacrymans (Wulfen: Fries) Schroeter stam EMPA 65 ( ATCC 32.750).

Denna konstruktion håller plantvävnader borta från agar kontakt och bort från locket och väggar. Variabel vätning av lignocellulosa substrat är nyckeln källa till variabilitet i agar-block tester. Vätning att öka fukthalt skapar syrebrist och undertrycker eller ens stannar aerob biologisk nedbrytning. Det skapar också ett problem för alla att studera oxidativ mekanismer av brunt och vitt rötsvampar ansvarig för trä nedbrytning. Kondens på platta lock är en fråga om fritt vatten droppar form och blöta underlaget. På samma sätt kommer trä och andra vävnader "veke" vatten snabbt från agar vid kontakt, vilket leder till vattenhalt över 80% (torr vikt. Basis) och stoppa aerob nedbrytning. Vävnader måste avstånd från dessa vattentäkter, vilket gör att fintrådiga svampen att hitta, ansluta, och kontrollera fukt i underlaget.

1. Gör nog agar media för att fylla önskat antal Petri plattor med 20 ml agar, vardera. Vi använder fem replikat (n = 5) per behandling, som bestäms av maktanalys utifrån tidigare resultat.
2. För kalcium-och järn-fri Typ A agar, lägger vi 15 g agar i en 500 ml mätkolv som innehåller ca 400 ml avjoniserat vatten ändras med 1,0 g NH ₄ NO _3, 1,0 g monobasiska KH ₂ PO _4, 0,25 g MgSO ₄ x 7H ₂ O, och 1,0 g glukos. Till blandningen använder vi stamlösningar att lägga mikronäringsämnen. Vi lägger till 50 l vardera H ₃ BO ₄ (0,057 g / 100 ml) och ZnSO ₄ (0,031 g / 100 ml). Vi lägger till 50 l vardera MnCl ₂ (0,036 g / 100 ml), CuSO ₄ (0,039 g / 100 ml) och (NH _{4) 6} Mo ₇ O ₂₄ (0,018 g / 100 ml). När näringsämnen läggs Fyll mätkolven till 500 ml-linjen.
3. En typisk kalcium tillskott i detta fall skulle vara 0,05 g CaCl ₂ x 2H ₂ O / 500 ml. I vårt fall använder vi agar kalcium som en behandling med 5 mM slutlig koncentration. Vi motverka det ökade jonstyrka och klorid dessutom genom att lägga till 5 mM NaCl till de andra mikrokosmos. Likaså använder vi järn-fri media för denna demonstration, men i de fall där järn ingår, blanda vi 0,112 g FeSO ₄ med 2 ml avjoniserat vatten och tillsätt 50 ìl av denna nya lösning (ej lager) omedelbart efter vortexa. I alla medier där du styr tillsatser av näringsämnen, är det klokt att testa pH-värdet före autoklavering. Sur eller basisk tillägg (t.ex. FeCl ₃₎ kommer att påverka stelning.
4. Överför media till en kolv och autoklavera mediet vid 121 ° C och 16 psi i 20 minuter. Vi inte överstiger 500 ml volymer (per 1000 ml kolv), för att slippa agar stelna innan vi kan administrera allt detta på prov plattorna.
   
   (Obs:.. Det är klokt när man använder alternativa media, särskilt minimal näringsagar med tillsats av basala salter, att först kontrollera att ditt test svampen att växa på den kan hämma tillväxten eller till och med döda ditt test isolera höga joniska styrkor)
5. Använd en bärbar pipett-stöd och 10 ml sterila pipetter polystyren att överföra agar aseptiskt i en biosäkerhet skåp, en gång kolvar cool. Låta media sval är här viktigt att minimera kondens. Dessutom stack plattorna höga som de är hälls, för att minimera fritt vatten på locken. Även kondens är en olägenhet i normal odling, här är ett stort problem om droplets form och blöta veden. Vattenhalt (MC) över 80% (torrvikt) kommer att skapa syrebrist i vävnader, begränsa sönderfallet av aeroba svampar och ökar variationen. Beräkna MC enligt följande:
   
   MC * = [(färskvikt x torrvikt) / torrvikt] x 100
   
   * (MC kan överstiga 100% - detta kan tyckas vara en udda sätt att beräkna MC, men är standard)
   1. Alternativa mikrokosmos: Om plantvävnader testas som måste vara före slipat och siktas (t.ex. majs Stover stjälkar och blad, tillsammans), finns det två rätt alternativ vi använder. Divided petri plattor finns med 2 eller 4 sektioner och agar kan uteslutas från fack med pulver. Stelnat agar kan också klippa och en del bort för att lämna utrymme för pulver, men försiktighet måste iakttas för att upprätthålla lika agar volymer kvar om tillgången på näringsämnen ska styras.
6. Lägg generöst skära plast mesh nät mot plåtytan, med hjälp av noggrant tvättas och autoklaveras galler tillsättas aseptiskt. Vi använder en produkt, Gutter Guard (35 x 50 mm, 2 mm tjock), för våra nät, och har använt svepelektronmikroskopi att visa en ren yta efter tvål och vatten tvätta och för att visa en brist på svamp penetration. Vi har haft blandad framgång med filter glasfiber och med om block direkt på utvecklat mycel, både på grund av fuktspridande frågor. Du kommer att få förfalla, men din koefficienten variabilitet (CV) kommer att vara hög, vilket gör behandlingen jämförelser statistiskt svag. Vi använde glasstavar tidigare, men blocken är känsliga för glider av stavar när knuffad och lämnade block i kontakt med agar. Ett bra alternativ är att klippa hela cirklar för att passa plattor, skär ett udden av att tillgodose inokulat. I allmänhet, skär galler för att passa din egen inställning, men se till att de låg helt platt i petriskålar.

2) Förberedelser för "block" Substrat

Dessa protokoll har utvecklats för massivt trä, men är anpassningsbar för andra plantvävnader. Mass förlust är standard mått för röta framsteg i trä bryts ned av fintrådiga svampar. Därför använder vår inställning ugn torrvikt före och efter-sönderfall för att bestämma massan förlust. Men för all bioenergi forskning, där fokus ligger på växtvävnad kemi, många tycker att luften torkar vävnader är att föredra. Vi visar här protokollen för att förbereda din agar-block kulturer att använda ugnstorkad utgångsmaterial, men ge annan information för att lufttorka och även för att bearbeta pulver istället för fasta substrat.

1. För denna demonstration, använder vi Southern Yellow Pine (SYP). SYP är en kommersiellt tillgänglig bråte som representerar den stora majoriteten av virke som används i bostäder i USA Det kan vara någon av fyra Pinus-art. Icke-behandlat virke används och kvistfri block skärs från en enda rip (längsgående snitt) längs spannmål (19 x 19 mm). Detta minimerar kemiska variationer i trä. Denna längd är skuren i 19 mm ³ kvarter. Vi använder denna storlek för jord-block försök och skär många block i en enda session på bordet såg.
2. Den 19 mm ³ block som ska användas i agar-blocket mikrokosmos är ytterligare kluvna längs med säd, med hjälp av en mejsel och hammare, inte en såg. Detta gör en grov blockgräns till nedåt på plast mesh, och en jämn ovankant till etiketten. Etikett block med penna. Om du inte kan märka dina substrat, se till att utforma ett system för att hänga med prover. Klipp tillräckligt block för att tillfredsställa dina behandlingar (igen, vi använder n = 5 per behandling), samt icke-inokulerade kontroller som ska fungera både som förorening monitorer och som basdata prover, betingad parallellt.
3. För ugnstorkad material, prover rum i en varmluftsugn vid 100 ° C i 48 tim. Om lufttorkade material krävs, skick proverna i en kammare eller rum med konstant luftfuktighet och temperatur. Vi använder 65% RH och 20 ° C, och vi brukar räkna med 10-14 dagar luftkonditionering, beroende på material.
4. Pre-väga dina prover för att bestämma initial ugn torr eller färsk vikt. Med prover från ugnen, helt enkelt överföra prover till en exsickator svalna och väg dem.
   1. Alternativa lufttorkning: Med lufttorkad material, ta fem prov (n = 5; uppoffrande dessa inte kommer att användas i mikrokosmos), väga dem färska, ugn-torka dem enligt ovan, och åter vikten efter torkning. Beräkna en faktor fukt korrigering för var och en av två block enligt följande:
      
      MC korrigeringsfaktor = torrvikt / färskvikt
      
      Exempel: 2,46 g (torr) / 2,68 g (färska) = 0,918, så är en 3,0 g färsk blockera 2,75 g ugnstorkad
      
      Genomsnitt fem prover att få den genomsnittliga korrektionsfaktorn. Sedan väger alla dina lufttorkade block. Multiplicera varje vikt med genomsnittligt MC korrektionsfaktor för att bestämma initial ugn torrvikt.
5. Autoklav märkta prover vid 121 ° C och 16 psi för 1 timme, eller längre med större prover. Tätt folie för att minimera vätning.
   1. Alternative sterilisering: Gammastrålning kan användas för att sterilisera, om tillgängligt. Vi har testat gran-och bokskog tidigare för effekter av temperatur på hemicellulosa förluster, och fann ingen, tillsammans med ingen styrka förlust eller färgförändring. Detta kan dock variera mellan substrat och dina önskemål / behov, och gammastrålning är ett bevisat alternativ.
6. För denna demonstration testar vi rollen av fast gips (ren mot 1% FeSO ₄₎ på nedbrytning av vår tall (SYP) prover. Dessa görs som skivor med exakta ytor och volymer, igen för att kontrollera deras tillgänglighet förutom deras koncentration. Dessa är autoklaveras separat och läggas under inokulationen steg. Vi behöver en skiva för varje kvarter, och vi lägger till två block per petriskål att låta två skördar.

3) ympa & Märkning

Ympa agar-blocket mikrokosmos är mer tidskrävande än inokulering jord-block burkar. För oss räknar vi på varje ympning tar 3 min. För att petriskålar som innehåller agar, detta är den punkt tillägg för nät, trä, alla exogena näringskällor (här, gips pellets), och svampen. Det finns ökad risk för kontaminering på grund av den tid locket är öppet och antalet besök inuti. Det finns också flera viktiga misstag som ofta görs i detta skede, och dessa är bäst omfattas av koppling video med text. Titta på videon.

1. I en steril biosäkerhet skåp, montera din tomma agar rätter, en källa plåt för din svamp inokulat (vi använder 2 vecka kulturer), nät, växt substrat (trä), exogena material, en Sharpie, parafilm band och verktyg överföring. Vi Flamsterilisera med 70% etanol, och vi använder en överföring verktyg för inokulat och pincett för block och mesh. Parafilm bör skäras med ett rakblad för att undvika hack på kanterna. Nicks i parafilm leda till raster när tätning, och detta kommer trängs prover och kräver återinträde.
2. Flame överföra verktyg eller tång innan du lägger till följande (i denna ordning):
   1. Plast mesh.
   2. Trä substrat. För vår demonstration kommer vi att lägga till två trä block längs mesh, båda av samma ursprungliga block som delades så att vi kan koppla ihop data från tidiga och sena skördar. Dessa block läggs sida vid sida, med säden slutet (trä tvärsnitt) mot den punkt varifrån svamp inokulat.
   3. Exogena material. Här testar vi rollen av gips på förfall av en fintrådiga svamp. Därför vill vi svampen att möta dessa gips skivor innan träet, och därmed lägga en gips-skiva mellan varje inokulat punkt och blocket på toppen av maskan. Detta innebär att tillsätta 2 skivor per mikrokosmos. Låt inte kontakten mellan skivor och trä, men håll dem nära.
   4. Svamp inokulat. Vi använder en # 4 kork borr med 7 mm diameter för att göra pluggar från 2-wk kulturer odlas i 20 ml agar. Detta bidrar till att kontrollera inokulat volym. För icke inokuleras-kontroller är det bäst att lägga till en kontakt från en steril platta. Vi lägger vanligtvis dessa pluggar till agar, och inte på nätet. Låt inte kontakten mellan inokulatet och antingen exogena substrat eller trä, men återigen, placera dem nära varandra. Det finns ett inokulat kontakt per block.
      
      OBS: Det är klokt att montera dessa innehållet i en agar skålen innan du börjar se till att det kommer att vara minst 3 mm på huvudet utrymme, att det kommer att vara minst 3 mm avstånd mellan trä block och väggar locket, och att din plast nät dimensioner kommer lätt tillgodose dina substrat.
3. Parafilm rätter att täta dem, hålla ett brinnande alkohol låga och med pincett redo. Håll plattor horisontella och linda parafilm i en jämn kontinuerlig rörelse. Om parafilm sönder eller om innehållet trängs, ta bort parafilm, återinträda och montera innehåll, och försök igen.
4. Etikett skålen locken med en alkohol-resistent markör, märkning blocknummer direkt över toppen av respektive substrat. Vi drar också cirklar över gips skivor. Som trä sönderfall, förlorar du sannolikt förmågan att läsa märkning på substrat. Det är viktigt att hänga med rätt position. Dessutom, underskatta inte möjligheten för en svamp för att försämra eller kolonisera myriad av andra typer av material, inklusive metaller.
5. Om du har fina samling på nät, överföring tallrikar noga på inkubatorn. Vi har bara en gång, stötte bin av plattorna mot en dörr sylt och var tvungen att åter montera plattorna. Ta din tid, och plotta din färdväg. Det är en en-gång oro, så ta hand den här gången.

4) Inkubation & Skörd

Plattorna kan inkuberas för att passa dina svamp, men bör hållas i ett biologiskt inkubator om möjligt, för att undvika kondens på grund av temperaturförändringar. Tidsserier skördar sker aseptiskt, med undantag för den senaste skörden. Om dessa mellanliggande skördarna gjort efter tillväxtsubstraten är betydande, hantering plattorna är lättare att hyfer kors länk substrat.

1. För vår demonstration, inkubera vi plattorna vid 20 ° C och i mörker. På en vecka 5 skörd punkt, tar vi bort hela behandlingen mycket, spraya varje botten och topp med 70% etanol och använda flammade tång för att ta bort material inuti biosäkerhet skåpet.
2. Ta bilder innan du förstör agarplattor, med fokus på någon morfologi eller melaninnivå.
3. Ta bort block att behandlas som dina behov kräver. Använd ditt finger för att rulla bort överflödigt hyfer (med nitril handskar), men var försiktig att inte förlora några skämda material. Vi brukar ugn torrt block i aluminium väger kastruller för att bestämma massan förlust, med färska och torra vikter av kontroller för att övervaka för alltför fuktspridande. Vi etiketten också och spåra alla mörkbruna block som är klart vatten loggas, även om detta bör vara minimal efter denna strategi. Massförlusten uppgifter hjälper framsteg mätare förfall, och det är viktigt data om elementär koncentrationer skall beräknas på ett gram vikt basis senare. Kom också ihåg att andelen data måste normaliseras för statistik. Vi beräknar enligt följande:
   
   % Massförlusten = [(ursprungliga vikten slutliga vikt) / ursprungliga vikten] x 100
   1. Alternativa lufttorkning: Om du behöver lufttorkande, med ditt mål att biologiskt behandla materialet vidare, bör du använda luftkonditionering regimen från avsnitt 2,3 att rekonditionera. Om du måste bestämma massan förlust, kommer det att krävas ett visst mått av fukthalt, är en lösning att dela block (eller pulver) i en stor och liten del. Väg båda, men bara ugn-torka liten del. Beräkna fukt faktor innehåll konvertering, enligt ovan, och sedan använda den för att den totala färskvikt av små + stora portioner (totalt blockera färskvikt). Speciellt om förbehandling av material med en svamp innan försockrats eller andra processer, massförlusten hjälper dig med massbalans beslutsamhet senare och står för kolhydrater konsumeras av svampen.
4. Förstör kulturer i autoklaverbara väskor, men spara plast mesh och alla andra komponenter som kan återvinnas för användning i framtida experiment.

5) tolka resultat

Lignocellulosa vävnader vanligtvis förfall långsammare i agar-block mönster, men vid det här laget bör du ha relativt låg variabilitet även vid måttliga förfall nivåer. Du bör också ha måttlig (20-50%), inte hög fuktighet i kontroll vävnader.

1. Vattenhalt (på en torrvikt) i trä som inte är utsatta för svampangrepp är oftast måttlig, ca 40% i denna demonstration. Detta är över fiber mättnadspunkten (FSP) av tall (normalt cirka 24%), vilket innebär att det finns några gratis vatten över vattnet bundet i lignocellulosa sekundära cellväggen. Detta innebär också att vissa fuktspridande sannolikt inträffar. En RH på 100% ändå inte låta trä MC överstiga FSP. Din design kan få olika resultat beroende på substrat och mesh urval. Det viktiga är att hålla vattenhalt under 85% eller så, på en torr substans.
2. Den% massförlusten i trä ner i dessa agar-blocket mikrokosmos är normalt ca 30% efter 16 veckor för de flesta svampar. För att välja svampar, i detta fall Serpula lacrymans kommer svampar uppnå full nedbrytning i denna tid,> 60% massa förlust. S. lacrymans är en mörk ringröta svamp, ta bort lite lignin, betyder så 62% massa förlust i denna studie förfall är nära eller tidigare färdigställande. Vit rötsvampar kommer att ta bort lignin, och massa förluster beror på arter samt substrat.
3. Var noga med att spela in hyfernas morfologi. I denna demonstration hade hyfernas morfologi inte i sig visar framgång eller misslyckande i någon behandling, men melaninnivå färgerna var viktiga. Det gjorde att vi kunde relatera rollen av järn som en förorening i gips till äldre studier som låg et al. (2000), där inhemska material testades och där detta "rost" färgläggning observerades. Den roll som kalcium och järn diskuterades i Low et al. (2000), och här ser vi förbättrade förfall med järn, inte kalcium och samma roströd hyfer.
4. Om du vill mäta koncentrationer av något i denna försämrade trä, är det bäst att normalisera för massa förlust. Om till exempel kalcium varken importeras eller exporteras av trä skämda 50%, dess koncentration i förhållande till vikten visas att fördubblas från tiden noll till den sista skörden. Det beror på 1 g pulver nu motsvarar två gånger virkesförråd än den gjorde vid tiden noll. Svampen konsumerade 50% av den matris, minskande densitet. Normalisera en viss koncentration (t.ex. mmol / g) för att kompensera för massförlusten enligt följande:
   
   Normaliserade koncentration = mmol / gx [1 - (% massförlusten / 100)]
   
   Exempel: 10 mmol / g Ca i trä försämrad 20%, jämfört med 7 mmol / g vid tiden noll.
   
   Fråga: Har Ca innehåll ökar under sönderfallet?
   
   10 mmol / g är en uppenbar 3 mmol / g öka, en 43% ökning, men one gram pulver från förstörd trä med lägre densitet representerar nu en större volym. Normalisering krävs för att jämföra inledande och avslutande Ca halten i samma trä volymer.
   
   10 x [1 x (20% / 100)] = 8 mmol / g normaliserad
   
   Svar: Ja, det gjorde Ca öka, men med 14%, inte 43%.
   
   (Data kan också uttryckas per trä volym, mmol / cm ^3, genom att multiplicera med densitet.

Figur 1. Agar-block mikrokosmos, som inrättats i denna demonstration, innan inkubation.

Figur 2. Serpula lacrymans kolonisera tallskog block vilande på plast nät för att lyfta blocken ovan agar-kontakt. Detta mycel representerar en viktig förbindelse mellan trä och exogena näringsämnen / element källor, och kontrollera dessa exogena materiella källor i agar eller fasta material är en viktig fördel med agar-block design kontra jord-blocket design.

Figur 3. Innebära förlust% vikt, som ett mått på omfattningen av trä förfall av Serpula lacrymans efter 5 och 15 veckor inkubation med tall i agar-block mikrokosmos. Behandling var ingen (Ca-free), 5 mm CaCl ₂ läggs till agar (CaCl _2),> 99% ren gips (CaSO _4), eller 1% järn-ändrade gips. Skyddad ANOVA innebär jämförelser med Tukey: s tester, med α = 0,05. För varje skörd, barer under samma bokstav är inte signifikant. Felstaplar = standardavvikelse. Publicerad i Schilling (2010).

Figur 4. Overhead bild (A) i alla fem replikat vid vecka 15 av förfall av samma brunröta testa svamp, Serpula lacrymans, samt block (B) tas bort och ugnstorkad. Notera avsaknaden av melaninnivå i Ca-fri behandling, gulfärgning i ren kalcium behandlingar, och rost utseende i järn ändras behandling. Behandlingar är märkta som i figur 3, med kontroll i (b) vara icke-inokulerade block för jämförelse.

Figur 5. Overhead bild från en annan studie med högre medel järnkoncentrationen, Blakeslee är malt agar. Notera förlusten av observerade melaninnivå, jämfört med Figur 4. Blockerar bort och vägde visade ingen behandlingseffekt på viktminskning. Detta presenteras som en demonstration av påverkan av exogena komponenterna i dessa kvarter prövningar. Dessa effekter skulle inte vara testbara i jord-block burk mönster, där dessa exogena ingångar är för svårt att kontrollera.

Discussion

Med vår agar-block set-up (Figur 1) Serpula lacrymans växte i direkt kontakt med gips ytor och i trä block (figur 2), vilket leder till mer än 60% viktminskning i kontrollgruppen bruna ruttnade-tall block (Figur 3 ). Detta uppfyller enkelt ASTM standard målet> 50% förfall, och den genomsnittliga variationskoefficienten (C _V) i förfall på var 0,055 vid vecka 16. Dessa data publiceras i Schilling ^7. Återigen kommer andra svampar kräver längre inkubering i agar-block än i jord-block. För referens, har kört vi framgångsrikt liknande mönster i flera tidigare experiment med en rad andra svamparter, ofta med hjälp svepelektronmikroskopi med elektron spridd spektroskopi (SEM-EDS) och induktivt kopplad plasma spektroskopi (ICP-OES) för att verifiera anslutning med exogena substrat och förflyttning av kalcium och andra element i trä ^8,9.

Förutom låg variabilitet finns det två andra resultat som våra agar-block design avslöjar. Först var det en behandlingseffekt (figur 3), där vår kalcium tillägg om att de agar som CaCl ₂ eller som ren gips, hämmad nedbrytning av denna svamp. Detta är ett användbart resultat för att andra har teoretiserat kalcium ökar förfall baseras på studier med verkliga material som murbruk och puts. Istället ser vi dämpfaktorer rebound med tillägg av järn till gips, vilket tyder på järn, inte kalcium, är nyckeln. Den andra användbart resultat, dock inte kvantifieras, men är istället färgen på mycel (Figur 4). Det finns betydande och uppenbara melaninnivå skillnader i externa hyfer bland behandlingar, och forskare har tidigare konstaterat "rost" melaninnivå när de möter denna svamp på byggmaterial (t.ex. Low et al. 2000). I våra senare studier fann vi att dessa effekter försvinner med hjälp av en hög järn medium (Figur 5). Sammantaget antyder det att denna svampen använder järn, inte kalcium i dessa material och att tidigare studier, med "rostig" mycel rapporteras observerade järn effekt, inte kalcium effekt.

Totalt sett dessa resultat och en brist av behandlingseffekter med hjälp av hög järn-agar är en mycket stark demonstration av den kontroll som agar-block design kan ge forskaren, särskilt i ljuset av den alternativa mark-block strategi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri dishes	Nalge Nunc international	4014	25 x 150 mm
Agar, Type A	Sigma-Aldrich	A4550
Ammonium nitrate, NH4NO3	Millinckrodt	3436-12
Potassium phosphate, KH2PO4	JT Baker	3246-01
Magnesium sulfate 7-hydrate, MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	230391
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Dextrose
Boric acid, H3BO4	Mallinckrodt Baker Inc.	2549-04
Zinc sulfate 7-hydrate, ZnSO4•7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	8880-12
Manganous chloride 4-hydrate, MnCl2•4H2O	JT Baker	2540-04
Copper(II) sulfate 5-hydrate, CuSO4•5H2O	Sigma-Aldrich	209198
Ammonium heptamolybdate 4-hydrate, (NH4)6Mo7O24•4H2O	Sigma-Aldrich	431346
Calcium chloride dihydrate, CaCl2•2H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	4160-12
Sodium chloride, NaCl	Mallinckrodt Baker Inc.	7581-12
Ferrous sulfate 7-hydrate, FeSO4•7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	5056-12
Pipet-aid	Drummond Scientific	4-000-110	Cordless EtOH the surface
10 ml sterile polystyrene pipette	BD Biosciences	357551
Gutter Guard	Thermwell Products Co.	VX620	Pre-scrubbed with soap Hardware store
Calcium sulfate hemihydrate, CaSO4•0.5H2O	Acros Organics	385355000
#4 cork borer	Boekel Scientific	1601
Parafilm "M"	Pechiney Plastic Packaging	PM-996