Summary
우리는 주변 신경 가지의 재배와 시간 경과 영상을위한 중간 회임 마우스 배아의 organotypic 조각을 준비하는 방법을 제시한다.
Abstract
다양한 목적을 위해, organotypic 조각으로 마우스 배아의 전의 생체내의 재배가 바람직합니다. 예를 들어, 우리는 모두 영화의 innervation에 가능성을 허용, 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 향상된 버전이 독점적으로 개발 중심과 주변 신경계 하나의 뉴런에서 표현되는 유전자 변형 마우스 라인 (tauGFP)를 채택 forelimb가와 약리과 유전 기법이이 과정을 조작합니다. 이러한 슬라이스 문화의 성공적인 재배에서 가장 중요한 매개 변수는 조각을 준비하는 방법입니다. 다양한 방법의 광범위한 테스트 후, 우리가 vibratome들이 일상적으로 몇 일 동안 생존하고, 가장 중요한을 보여 문화에 따라서 그러한 배아를 슬라이스하는 최선의 장치는 것을 발견, 시대에 발전 특정 방식. 중반에 태동하고 배아의 경우, 이것은 척수와 지느러미 루트 신경의 주변과 골격 및 근육 조직의 적절한 판단에 자신의 목표에 척수 신경의 정상적인 파생물이 포함되어 있습니다.
슬라이스 준비 후 2 일을 위해 공부를 할 수있는 표준 조직 문화 인큐베이터에서 재배 400 마이크로 미터 조각 -이 작품에서 우리는 300로 (E) E10 E12에 배아 일 전체 배아를 처리하는 방법을 제시. 이 방법의 성공을 위해 중요 각각의 아가로 오스 - 임베디드의 배아를 슬라이스하는 vibratome의 사용입니다. 이 인터페이스 문화 기술에서 발생하는 중간의 작은 볼륨에 배치 Millicell 문화 막 삽입,시 조각의 재배옵니다. 7 배아의 평균 한 쓰레기는 정기적으로 인해 태아의 나이뿐만 아니라, 조각의 두께에 약간 차이가 최소 14 조각 (태아 당 forelimb 영역로부터 2-3 조각)을 생산하고 있습니다. 교양 조각의 80 % 정도는 culturing 기간 2 througout 측정할 수 신경 가지를 보여줍니다. tauGFP 마우스 라인을 사용하는 대표적인 결과가 증명하고 있습니다.
Protocol
1 부 : 깔끔히 및 culturing 준비.
- 매체 (DMEM, 25 % 1X HBSS, 25 % 태아 소 혈청, 0.5 % 포도당, 1 ㎜의 글루타민, 2.5 MM HEPES, 산도 7.3) 및 3 - cm Millicell - CM 0.4 - μm의 문화를 깔끔히 10 - cm 조직 문화 플레이트 준비 멤브레인 삽입하고 37 인큐베이터에 보관 ° C와 5% CO 2.
- 그것이 약 37 숙박 있도록 전자렌지에 PBS에 4% 낮은 용융 점 아가로 오스를 가열하고 가열 접시에 보관 ° C.
- PBS (140 MM NaCl, 2.7 KCl MM 10 MM 나 2 HPO 4, 1.8mM KH 2 PO 4) 얼음에 장소 10 cm 세균 배양 접시를 채우십시오.
- 마이크로톰 냉각 장치를 설정하거나 버퍼 트레이 및 냉각 요소가 사전에 냉각 그것에 냉장고에 저장됩니다 보장합니다.
2 부 : 엠브료 포함.
- 자궁에서 배아를 해부하다하여 GFP 발현을 확인하기 위해 거꾸로 형광 현미경으로 그들을 검사합니다.
- 거꾸로 10 cm 페트리 접시와 동양 그들 플레이스 배아 과도한 PBS를 제거하는 왓먼 종이 스트립을 사용합니다.
- 이 자리에서 문제를 해결하기 위해 배아에서 아가로 오스를 적용합니다. 아가로 오스는 고체화하자.
- 면도날로 절단하여 배아를 둘러싼 지역을 제한한다.
- 그 반대편에 포함된 배아를 회전합니다.
- 배아가 완전히 내장된 수 있도록 배아 조직에 대한 추가 아가로 오스를 적용합니다.
- Loctite 406, "Krazy의 접착제"와 유사한 특수 접착제를 사용하여 vibratome 척에 깨끗한 가장자리와 마운트와 아가로 오스 블록을 준비합니다.
파트 3 : 프로 시저를 칼자국.
- precooled 버퍼 트레이 및 냉각 요소를 설정합니다.
- 붙어 조직과 척을 넣고 1X HBSS를 (CA 2 + - MG 2 + 무료 HBSS, 10 MM의 HEPES 버퍼 산도 7.3, 500 U / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신)까지 커버 추가합니다.
- 삽입 및 precleaned (70 % 에탄올) 마이크로톰 블레이드를 수정.
- 350을 준비 - 450 μm의의 조각들을 조직 문화 접시에 단축 유리 파스퇴르 pipettes를 사용하여 전송 얼음이 있었죠.
- 포셉 한 켤레를 사용하여주의 깊게 각 슬라이스 문화 세포막을 Millicell로 전송에서 아가로 오스를 제거합니다. 약 4 조각은 문화 매체 6 ML 가득한 10 cm 조직 문화 판에서 한 막에서 교양 수 있습니다.
- 37 조각 품어 ° C와 5% CO 2 (문화 매체 : DMEM, 25 % 1X HBSS, 25 % 태아 소 혈청, 0.5 % 포도당, 1mM 글루타민, 2.5 MM HEPES, pH를 7.3). 한 시간 경과 영상 시리즈를 수행하는 경우 한 매체 상수의 볼륨을 유지합니다. 짧은 시간 프레임에 대한 시간 초과 이미징 시리즈의 경우에는 그것이 같은 매체를 떠나 충분하다. 더 이상 문화 기간 변경에 대한 이후 12~20시간 것이 좋습니다.
파트 4 : 현미경에서 이미징 척추 신경 가지.
- 직립 형광 현미경으로 슬라이스와 Millicell 문화 세포막을 포함, 10 cm 조직 문화 플레이트를 삽입 이미지 척수 신경.
- 다음 이미징 시점 동안 올바르게 위치에 현미경의 무대에서 Millicell 문화 점막의 방향을 라벨.
- 사용하는 이미지 척추 신경 가지 4X (숫자 조리개 [NA] 0.1), 10X (NA 0.3), 또는 20x (NA 0.5) 목표.
그림 1은 4X와 10X 목표와 문화를 20 시간 동안 척추 신경 가지를 묘사한 영상 시리즈를 보여줍니다.
homozygous tauGPF 배아의 가로 통에 척수 신경 가지의 그림 1 이미징 시리즈. * 복부 척수, 화살표 = DRG의 = 모터 뉴런. 슬라이스의 지느러미 (D) - 복부 (V) 축에 표시됩니다. Scalebars : 200 μm의.
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Discussion
중간 회임 마우스 배아의 배아 슬라이스 문화 (E10 - E12)를 준비하는 방법의 광범위한 비교에서, 우리는 vibratome가 문제없이 문화의 전반적인 생존과 재현성 모두와 관련하여 가장 신뢰할 수있는 결과를 생산하는 것을 관찰했습니다 신경 가지 패턴. 반대로, 조각이 맥일웨인 조직 헬기 3 완전히 inviable 것으로 판명을 사용하여 준비 하였다. 우리는 원래 배아의 전체 쓰레기가 동시에 400 μm의 섹션 1을 생산하는 화격자 절단 주변에 순차적으로 싼 텅스텐 와이어로 깔끔히 준비한 수있는 단두대 방법 4, 고용. 이 기술은 준비 속도의 장점을했다지만, 그것은 배아마다 대부분의 한 가능한 부분을 굴복하고 가지 매개 변수의 변화의 큰 금액을 보여주었다. 이러한 이유로, 우리는 vibratome 기반 방식은 준비에 긴 시간에도 불구하고 우수한 선택이라고 생각합니다. 필요에 의해이 솔루션은 vibratome 필요하지만, 결과는 다른 "낮은 기술"방식을 통해 달성되어 무엇을 훨씬 우수하며, 따라서 투자를 정당화.
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Acknowledgments
저자는 마우스 배아 5시 슬라이스 문화를 수행할 수있는 아이디어의 원본 소스를 인정합니다. 우리는 촬영하는 동안 우리의 심부름꾼 역할에 대한 관대한 과학 지원과 안나 Degen에 대한 요아킴 커쉬을 인정하고 싶습니다. 그리고 하이 델베르크 (우수 클러스터 셀룰러 네트워크)의 대학이 작품은 독일 연구 재단 (Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9 도이치 Forschungsgemeinschaft)에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS 10x | GIBCO, by Life Technologies | 14180 | |
| Dissection tools | Fine Science Tools | various | |
| L.M.P. agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Whatmann paper | Whatman, GE Healthcare | 3030917 | |
| Shortened firepolished pipettes | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41966 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 10270-106 | |
| Pen Strep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-glutamine 100x | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Vibratome | Microm International | HM 650 V | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | BX61WI | |
| analySIS | Soft Imaging System | ||
| Millicell-CM inserts | EMD Millipore | PICMORG 50 | |
| 10 cm culture plates | Greiner Bio-One | 633171 | |
| LOCTITE 406 | Henkel Corp | 142580 | |
| Razor blades | Thermo Fisher Scientific, Inc. | none | |
| Dissecting microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| HEPES | Carl Roth Gmbh | 9105.2 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| x4 objective | Olympus Corporation | PL series | |
| x10 objective | Olympus Corporation | UPLFL –PH series | |
| Filter | Olympus Corporation | U-MNIBA2 | |
| CCD camera | Soft Imaging System | SIS F-View II | |
| Equipment for heated chamber | Leica Microsystems | CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171 |
References
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
- Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W.
