Summary
हम परिधीय तंत्रिका परिणाम की खेती और समय चूक इमेजिंग के लिए मध्य हमल माउस भ्रूण के organotypic स्लाइस तैयार करने की विधि प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
कई प्रयोजनों के लिए, organotypic स्लाइस के रूप में माउस भ्रूण पूर्व vivo की खेती के लिए वांछनीय है. उदाहरण के लिए, हम एक ट्रांसजेनिक माउस (tauGFP) लाइन में जो हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) के बढ़ाया संस्करण विशेष रूप से विकासशील मध्य और परिधीय तंत्रिका प्रणाली 1 के सभी न्यूरॉन्स में व्यक्त किया है काम, दोनों फिल्म की innervation संभावना अनुमति forelimb और औषधीय और आनुवंशिक 2 तकनीकों के साथ इस प्रक्रिया में हेरफेर करने के लिए. ऐसे टुकड़ा संस्कृतियों की सफल खेती में सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर विधि है जिसके द्वारा स्लाइस तैयार कर रहे हैं. तरीकों की एक किस्म का व्यापक परीक्षण के बाद हमने पाया है कि एक vibratome सर्वोत्तम संभव डिवाइस के लिए ऐसी है कि वे नियमित रूप से एक संस्कृति है कि कई दिनों की अवधि में व्यवहार्यता, और सबसे महत्वपूर्ण बात यह दर्शाता परिणाम भ्रूण टुकड़ा है, एक उम्र में विकसित विशिष्ट तरीके से. मध्य हमल भ्रूण के लिए, यह रीढ़ की हड्डी और पृष्ठीय रूट ganglia से परिधि और कंकाल और मांसपेशियों के ऊतकों के समुचित निर्धारण में अपने लक्ष्य के लिए रीढ़ की हड्डी में तंत्रिकाओं के सामान्य परिणाम शामिल हैं.
खेती के लिए एक मानक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर, जिसके लिए अध्ययन किया जा सकता है टुकड़ा तैयारी के बाद दो दिनों के लिए 400 सुक्ष्ममापी स्लाइस - इस काम में, हम (ई) E10 E12 के लिए 300 में भ्रूण दिन के पूरे भ्रूण प्रसंस्करण के लिए एक तरीका मौजूद है. इस दृष्टिकोण की सफलता के लिए क्रिटिकल एक vibratome का उपयोग करने के लिए प्रत्येक भ्रूण agarose - एम्बेडेड टुकड़ा है. यह Millicell संस्कृति झिल्ली माध्यम की एक छोटी मात्रा पर रखा आवेषण, एक अंतरफलक संस्कृति तकनीक में जिसके परिणामस्वरूप पर स्लाइस की खेती के द्वारा पीछा किया जाता है. 7 भ्रूण के एक औसत के साथ एक कूड़े नियमित रूप से कम से कम 14 (भ्रूण प्रति forelimb क्षेत्र के 2-3 स्लाइस) स्लाइस, जो भ्रूण की उम्र के कारण के रूप में अच्छी तरह के रूप में स्लाइस की मोटाई के लिए थोड़ा भिन्न होता है पैदा करता है. सुसंस्कृत स्लाइस के बारे में 80% तंत्रिका परिणाम है, जो संवर्धन अवधि 2 througout मापा जा सकता है है दिखाते हैं. प्रतिनिधि tauGFP माउस लाइन का उपयोग कर परिणाम प्रदर्शन कर रहे हैं.
Protocol
भाग 1: टुकड़ा करने की क्रिया और संवर्धन के लिए तैयारी.
- (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% भ्रूण गोजातीय सीरम, 0.5% ग्लूकोज, 1 मिमी glutamine, 2.5 मिमी HEPES, 7.3 पीएच) मध्यम और 3 सेमी Millicell - मुख्यमंत्री संस्कृति 0.4-सुक्ष्ममापी टुकड़ा करने की क्रिया के साथ 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेटों की तैयारी झिल्ली सम्मिलित करता है और 37 में इनक्यूबेटर में रख डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
- माइक्रोवेव में 4% कम पीबीएस में गलनांक agarose गर्मी और हीटिंग थाली पर रख है कि तो यह लगभग 37 पर रहता डिग्री सेल्सियस
- पीबीएस (140 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी ना 2 4 HPO, 1.8mm 2 के.एच. 4 पीओ) और बर्फ पर जगह के साथ 10 सेमी जीवाणु पेट्री डिश भरें .
- सूक्ष्म तक्षणी ठंडा डिवाइस सेट या सुनिश्चित बफर ट्रे और ठंडा तत्वों पूर्व शांत फ्रीजर में संग्रहीत हैं.
भाग 2: भ्रूण एम्बेडिंग.
- गर्भाशय से भ्रूण को काटना और उन्हें एक औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन GFP अभिव्यक्ति के लिए की जांच के साथ जांच.
- एक औंधा 10 सेमी पेट्री डिश और उन्हें पूरबी पर प्लेस भ्रूण वाटमान कागज स्ट्रिप्स का उपयोग करने के लिए अत्यधिक पीबीएस हटायें.
- भ्रूण पर agarose लागू करने के लिए इस स्थिति में ठीक है. चलो agarose जमना.
- एक रेजर ब्लेड के साथ काटने से भ्रूण के आसपास के क्षेत्र को सीमित.
- इसके दूसरे पक्ष पर एम्बेडेड भ्रूण घुमाएँ.
- भ्रूण ऊतक पर अतिरिक्त agarose लागू करने के लिए सुनिश्चित करें कि भ्रूण पूरी तरह से एम्बेडेड है.
- साफ किनारों और vibratome चक पर माउंट लॉकटाइट 406, एक विशेष "Krazy गोंद" करने के लिए इसी तरह की गोंद का उपयोग कर के साथ agarose ब्लॉक तैयार करें.
भाग 3: टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया.
- Precooled बफर ट्रे और ठंडा तत्व सेट.
- चिपके ऊतक के साथ चक डालें और 1x HBSS (2 Ca 2 + मिलीग्राम + मुक्त HBSS, 10 मिमी HEPES बफर पीएच 7.3, 500 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) तक कवर जोड़ें .
- डालें और precleaned (70% इथेनॉल) सूक्ष्म तक्षणी ब्लेड ठीक.
- 350 तैयार - 450 सुक्ष्ममापी स्लाइस और उन्हें टिशू कल्चर प्लेटों में छोटा गिलास पाश्चर pipettes का उपयोग कर हस्तांतरण बर्फ पर रखा है.
- संदंश की एक जोड़ी का उपयोग, ध्यान से प्रत्येक टुकड़ा और संस्कृति झिल्ली Millicell हस्तांतरण से agarose हटायें. के बारे में 4 स्लाइस 10 सेमी एक ऊतक संस्कृति संस्कृति के माध्यम से 6 एमएल के साथ भरा थाली में एक झिल्ली पर सुसंस्कृत हो सकता है.
- 37 में स्लाइस सेते डिग्री सेल्सियस और 5% 2 सीओ (संस्कृति मध्यम DMEM: 25% 1x HBSS, 25% भ्रूण गोजातीय सीरम, 0.5% ग्लूकोज, 1mm glutamine, 2.5 मिमी HEPES, 7.3 पीएच). यदि एक समय चूक इमेजिंग श्रृंखला करता है एक मध्यम लगातार मात्रा रखना चाहिए. एक छोटी समय सीमा के लिए समय पर इमेजिंग श्रृंखला के मामले में यह के माध्यम के रूप में इसे छोड़ करने के लिए पर्याप्त है. अब संस्कृति अवधि के परिवर्तन के लिए 12-20 घंटे के बाद की सिफारिश कर रहे हैं.
भाग 4: इमेजिंग खुर्दबीन पर रीढ़ की हड्डी में तंत्रिका परिणाम.
- छवि रीढ़ की हड्डी में 10 सेमी की एक ऊतक संस्कृति की थाली रखने के स्लाइस के साथ एक ईमानदार फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे Millicell संस्कृति झिल्ली युक्त नसों.
- Millicell खुर्दबीन मंच पर संस्कृति झिल्ली के उन्मुखीकरण का लेबल अगले इमेजिंग समय बिंदु के दौरान सही ढंग से स्थिति.
- छवि रीढ़ की हड्डी में तंत्रिका का उपयोग कर परिणाम 4x (एपर्चर संख्यात्मक [एनए] 0.1), 10x (0.3 एनए), या 20x (0.5 एनए) के उद्देश्यों.
चित्रा 1 में एक इमेजिंग 4x और 10x उद्देश्यों के साथ संस्कृति के 20 घंटे के दौरान रीढ़ की हड्डी में तंत्रिका परिणाम चित्रण श्रृंखला दिखाता है.
चित्रा 1 homozygous tauGPF भ्रूण के अनुप्रस्थ टुकड़ा में रीढ़ की हड्डी में तंत्रिका परिणाम की इमेजिंग श्रृंखला. * = वेंट्रल रीढ़ की हड्डी में, तीर = DRG की मोटर न्यूरॉन्स. पृष्ठीय (डी) उदर टुकड़ा (वी) अक्ष संकेत दिया है. Scalebars: 200 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
तरीकों की एक व्यापक तुलना मध्य हमल माउस भ्रूण भ्रूण टुकड़ा संस्कृतियों (E10 - E12) तैयार करने में, हम देखा है कि एक vibratome प्रश्न के बिना दोनों संस्कृतियों की समग्र व्यवहार्यता और के reproducibility के लिए सम्मान के साथ सबसे विश्वसनीय परिणाम का उत्पादन तंत्रिका परिणाम पैटर्न. इसके विपरीत में, स्लाइस McIlwain ऊतक हेलिकॉप्टर 3 पूरी तरह से inviable साबित उपयोग कर तैयार है. हम मूल रूप से एक guillotine 4 विधि, जिसमें भ्रूण की एक पूरी कूड़े के साथ टंगस्टन serially एक काटने के आसपास लिपटे 400 सुक्ष्ममापी 1 वर्गों का उत्पादन करने के लिए भट्ठी तारों के साथ टुकड़ा करने की क्रिया द्वारा तैयार किया जा सकता है कार्यरत हैं. हालांकि इस तकनीक तैयारी की गति का लाभ था, यह सबसे कम प्रति भ्रूण व्यवहार्य अनुभाग झुकेंगे और परिणाम मानकों में परिवर्तनशीलता की एक बड़ी राशि से पता चला है. इन कारणों के लिए, हमें लगता है कि vibratome आधारित एक विधि तैयारी में लंबे समय के बावजूद बेहतर विकल्प है. हालांकि आवश्यकता द्वारा इस समाधान में एक vibratome की आवश्यकता है, तो परिणाम बेहद क्या अन्य "कम तकनीक" दृष्टिकोण के माध्यम से हासिल किया गया है बेहतर कर रहे हैं, और इस तरह निवेश को सही ठहराते हैं.
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Acknowledgments
लेखकों माउस 5 भ्रूण पर टुकड़ा संस्कृति का प्रदर्शन करने के लिए विचार के लिए मूल स्रोत को स्वीकार करते हैं. हम उदार वैज्ञानिक समर्थन और अन्ना Degen के लिए शूटिंग के दौरान हमारे gofer के रूप में अभिनय के लिए Joachim Kirsch स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं. और हीडलबर्ग (उत्कृष्टता क्लस्टर सेलुलर नेटवर्क) विश्वविद्यालय: यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (488 Sonderforschungsbereich, B7/B9 Teilprojekt ड्यूश Forschungsgemeinschaft) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS 10x | GIBCO, by Life Technologies | 14180 | |
| Dissection tools | Fine Science Tools | various | |
| L.M.P. agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Whatmann paper | Whatman, GE Healthcare | 3030917 | |
| Shortened firepolished pipettes | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41966 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 10270-106 | |
| Pen Strep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-glutamine 100x | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Vibratome | Microm International | HM 650 V | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | BX61WI | |
| analySIS | Soft Imaging System | ||
| Millicell-CM inserts | EMD Millipore | PICMORG 50 | |
| 10 cm culture plates | Greiner Bio-One | 633171 | |
| LOCTITE 406 | Henkel Corp | 142580 | |
| Razor blades | Thermo Fisher Scientific, Inc. | none | |
| Dissecting microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| HEPES | Carl Roth Gmbh | 9105.2 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| x4 objective | Olympus Corporation | PL series | |
| x10 objective | Olympus Corporation | UPLFL –PH series | |
| Filter | Olympus Corporation | U-MNIBA2 | |
| CCD camera | Soft Imaging System | SIS F-View II | |
| Equipment for heated chamber | Leica Microsystems | CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171 |
References
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
- Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W.
