פורסים תרבות Organotypic של ה-GFP-לבטא עוברי עכברים עבור הדמיה בזמן אמת תולדה של עצבים היקפיים

Summary

אנו מציגים שיטה להכין פרוסות organotypic של אמצע ההיריון עוברי עכברים הדמיה טיפוח זמן לשגות תולדה של עצבים היקפיים.

Abstract

למטרות רבות, טיפוח vivo עוברי עכבר לשעבר כמו פרוסות organotypic רצוי. לדוגמה, אנו מעסיקים קו עכבר מהונדס (tauGFP) שבו גרסה משופרת של חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) באה לידי ביטוי באופן בלעדי את כל הנוירונים של מערכת העצבים המרכזית לפיתוח היקפי ^1, המאפשר את האפשרות לצלם גם את העצבוב של forelimb ו לתפעל את התהליך הזה עם טכניקות תרופתי ו גנטית ^2. הפרמטר הקריטי ביותר לגידול מוצלח של תרבויות פרוסה כזו היא השיטה בה את פרוסות מוכנים. לאחר בדיקה מקיפה של מגוון שיטות, מצאנו כי vibratome הוא המכשיר הטוב ביותר הפרוסה עוברים כך שהם שגרתי תוצאה בתרבות מדגים יכולת הקיום על פני תקופה של מספר ימים, והכי חשוב, מפתחת בעידן באופן ספציפי. עבור אמצע ההריון עוברים, זה כולל את תוצאה נורמלית של העצבים בעמוד השדרה של חוט השדרה ואת הגרעינים השורש הגבי ליעדם בפריפריה וקביעת תקין של רקמת שריר השלד.

בעבודה זו, אנו מציגים שיטה לעיבוד עוברים כל יום עובריים (E) E10 ל E12 לתוך 300-400 מיקרומטר פרוסות לגידול בתרבית רקמה רגילה החממה, אשר ניתן ללמוד עד יומיים לאחר הכנה פרוסה. קריטי להצלחה של גישה זו הוא השימוש vibratome על כל פרוסה העובר agarose-מוטבע. זה ואחריו הטיפוח של פרוסות על קרום Millicell מוסיף תרבות דגש על נפח קטן של המדיום, והתוצאה היא טכניקה תרבות ממשק. המלטה אחת עם ממוצע של 7 עוברים באופן שגרתי מייצר לפחות 14 פרוסות (2-3 פרוסות של האזור forelimb לכל העובר), אשר משתנה מעט עקב גיל העוברים כמו גם עובי הפרוסות. כ -80% את פרוסות תרבותי להראות תוצאה עצב, אשר ניתן למדוד througout ² תקופת culturing. תוצאות נציג באמצעות שורת עכבר tauGFP הם הפגינו.

Protocol

חלק 1: הכנת לחתוך culturing.

1. הכן 10 ס"מ תרבות צלחות רקמה עם חיתוך בינוני (DMEM, 25% HBSS 1x, 25% בסרום שור עוברית, גלוקוז 0.5%, גלוטמין 1 מ"מ, 2.5 HEPES מ"מ, pH 7.3) ו - 3 ס"מ Millicell-CM-0.4 מיקרומטר תרבות מוסיף קרום ושומרים החממה ב 37 ° C ו 5% CO _2.
2. מחממים 4% נמוך נקודת התכה agarose ב PBS במיקרוגל ולשמור אותו על צלחת חימום כך שהוא נשאר על כ 37 ° C.
3. מלאו 10 ס"מ צלחות פטרי עם בקטריולוגית PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1.8mM KH ₂ PO ₄₎ ומניחים על קרח.
4. הגדרת התקן קירור microtome או להבטיח מגש חיץ וקירור אלמנטים מאוחסנים במקפיא מראש לקרר אותו.

חלק 2: הטבעה העובר.

1. לנתח עוברים מן הרחם ולבחון אותם עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה כדי לבדוק ביטוי של GFP.
2. עוברים מקום על הפוך 10 ס"מ צלחת פטרי ו להתמצא אותם באמצעות רצועות נייר Whatman להסיר PBS מוגזמת.
3. החל agarose על העובר כדי לתקן את זה במצב הזה. בואו agarose לחזק.
4. הגבל את האזור המקיף את העובר על ידי חיתוך בסכין גילוח.
5. סובב את העובר מוטבעים על הצד השני שלה.
6. החל agarose נוסף על הרקמה העוברית כדי להבטיח את העובר מוטבע לחלוטין.
7. הכן לחסום agarose עם קצוות נקי להתקינה על vibratome צ'אק באמצעות Loctite 406, דבק מיוחד דומה "דבק בדבק מגע".

חלק 3: בחותכו ההליך.

1. הגדרת מגש חיץ precooled ואת אלמנט הקירור.
2. הכנס את צ'אק עם הרקמה דבוק ולהוסיף 1x HBSS (Ca ^{2 +-Mg 2 +} ללא HBSS, 10 mM HEPES חיץ pH 7.3, 500 U / ml פניצילין / סטרפטומיצין) מכוסה עד.
3. הכנס ולתקן להב precleaned (70% אתנול) microtome.
4. הכן 350-450 מיקרומטר פרוסות ולהעביר אותם באמצעות קיצור זכוכית pipettes פסטר לתוך צלחות תרבית הרקמה כל הזמן על הקרח.
5. בעזרת זוג מלקחיים, להסיר בזהירות agarose מתוך כל פרוסה ולהעביר Millicell ממברנות תרבות. כ 4 פרוסות יכול להיות מתורבת על קרום אחד צלחת 10 ס"מ רקמה תרבות מלא מ"ל 6 של המדיום לתרבות.
6. דגירה פרוסות בשעה 37 ° C ו 5% CO ₂ (בינוני תרבות: DMEM, 25% HBSS 1x, 25% בסרום שור עוברית, גלוקוז 0.5%, 1mm גלוטמין, HEPES 2.5 מ"מ, pH 7.3). אם אחד מבצע זמן לשגות סדרה הדמיה אחד צריך לשמור על נפח קבוע בינוני. במקרה של סדרה הדמיה מתוזמנים עבור פרק זמן קצר זה מספיק כדי להשאיר את המדיום כפי שהוא. במשך תקופות ארוכות יותר שינויים בתרבות לאחר 12-20 שעות מומלץ.

חלק 4: תוצאה הדמיה עצב עמוד השדרה על המיקרוסקופ.

1. תמונה העצבים של עמוד השדרה הצבת 10 ס"מ תרבות צלחת רקמות, המכיל ממברנות Millicell תרבות עם פרוסות, תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף.
2. תווית הכיוון של ממברנות Millicell התרבות על הבמה מיקרוסקופ לעמדה נכונה במהלך הנקודה הדמיה בפעם הבאה.
3. עצב השדרה תמונה תולדה באמצעות 4x (מספרי הצמצם [NA] 0.1), 10x (NA 0.3), או 20x (NA 0.5) מטרות.

איור 1 מציג סדרת הדמיה המתארת ​​את תולדה עצב עמוד השדרה במהלך 20 שעות של תרבות עם מטרות 10x ו 4x.

איור 1 Imaging סדרת תולדה עצב השדרה פרוסת רוחבי של העובר tauGPF הומוזיגוטים. * = הנוירונים המנוע של חוט השדרה הגחון, חץ = DRG. הגבי (D)-הגחוני (V) ציר של הפרוסה מצוין. Scalebars: 200 מיקרומטר.

Discussion

לשם השוואה מקיפה של שיטות להכין תרבויות פרוסה עובריים של אמצע ההיריון עוברי עכברים (E10 - E12), ראינו כי vibratome מייצר ללא ספק את התוצאות הכי אמין לגבי הכדאיות הן הכוללת של תרבויות ושל שחזור של תוצאה העצב דפוסי. לעומת זאת, פרוסות מוכן באמצעות מסוק רקמות McIlwain ³ התבררה inviable לחלוטין. העסקנו במקור שיטה הגיליוטינה ^4, שבו כל המלטה של עוברים יכולה להיות מוכנים בו זמנית על ידי חיתוך עם חוטי טונגסטן עטוף סדרתי סביב חיתוך באח לייצר 400 מיקרומטר בסעיפים ^1. למרות הטכניקה הזו היה יתרון של מהירות הכנה, זה הניב לכל היותר קטע אחד קיימא לכל העובר והראה כמות גדולה של השתנות בפרמטרים תוצאה. מסיבות אלה, אנו חשים כי שיטת vibratome מבוססי היא בחירה מעולה למרות הזמן כבר בהכנה. אמנם זה פתרון בהכרח דורש vibratome, התוצאות עדיפים בהרבה על מה שהושג באמצעות אחרים "low-tech" גישות, ובכך מצדיק את ההשקעה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS 10x	GIBCO, by Life Technologies	14180
Dissection tools	Fine Science Tools	various
L.M.P. agarose	Invitrogen	15517-022
Whatmann paper	Whatman, GE Healthcare	3030917
Shortened firepolished pipettes
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	41966
FBS	GIBCO, by Life Technologies	10270-106
Pen Strep	GIBCO, by Life Technologies	15140
L-glutamine 100x	GIBCO, by Life Technologies	25030
Vibratome	Microm International	HM 650 V
Fluorescent microscope	Olympus Corporation	BX61WI
analySIS	Soft Imaging System
Millicell-CM inserts	EMD Millipore	PICMORG 50
10 cm culture plates	Greiner Bio-One	633171
LOCTITE 406	Henkel Corp	142580
Razor blades	Thermo Fisher Scientific, Inc.	none
Dissecting microscope	Nikon Instruments	SMZ800
HEPES	Carl Roth Gmbh	9105.2
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
x4 objective	Olympus Corporation	PL series
x10 objective	Olympus Corporation	UPLFL –PH series
Filter	Olympus Corporation	U-MNIBA2
CCD camera	Soft Imaging System	SIS F-View II
Equipment for heated chamber	Leica Microsystems	CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171