Summary
Wir präsentieren eine Methode zur organotypischen Schnitten der Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen für die Kultivierung und Zeitraffer-Bildgebung von peripheren Nerven Auswuchs vorzubereiten.
Abstract
Für viele Zwecke ist der Anbau von Maus-Embryonen ex vivo als organotypischen Schnitten wünschenswert. Zum Beispiel verwenden wir eine transgene Maus-Linie (tauGFP), in dem die verbesserte Version des grün fluoreszierenden Protein (EGFP) exklusiv in allen Neuronen des sich entwickelnden zentralen und peripheren Nervensystems 1 ist ausgedrückt, so dass die Möglichkeit, beide Filme die Innervation das Vorderbein und diesen Prozess mit pharmakologischen und genetischen Techniken 2 zu manipulieren. Die wichtigsten Parameter für die erfolgreiche Kultivierung solcher Scheiben Kulturen ist die Methode, mit der die Scheiben sind vorbereitet. Nach umfangreichen Tests von einer Vielzahl von Methoden, die wir gefunden haben, dass ein Vibratom die bestmögliche Gerät, um die Embryonen, so dass sie routinemäßig in einer Kultur, die Lebensfähigkeit über einen Zeitraum von mehreren Tagen und vor allem zeigt, Ergebnis Scheibe ist, entwickelt sich in einem Alter, -spezifischen Art und Weise. Für Mitte der Schwangerschaft Embryonen, schließt dies die normale Folge der Spinalnerven aus dem Rückenmark und Spinalganglien, um ihre Ziele in der Peripherie und die richtige Bestimmung des Skelett-und Muskelgewebe.
In dieser Arbeit präsentieren wir eine Methode für die Verarbeitung von ganzen Embryonen embryonale Tag (E) E10 bis E12 in 300 bis 400 Mikrometer Scheiben für den Anbau in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator, der für Studium kann bis zu zwei Tage nach slice Vorbereitung. Entscheidend für den Erfolg dieses Ansatzes ist die Verwendung eines Vibratom jedem Agarose eingebettete Embryo in Scheiben schneiden. Dies ist durch den Anbau der Scheiben auf Millicell Kultur Membran-Einsätze auf ein kleines Volumen Medium platziert, wodurch eine Schnittstelle Kultur Technik gefolgt. Ein Wurf mit einem Durchschnitt von 7 Embryonen routinemäßig produziert mindestens 14 Scheiben (2-3 Scheiben von dem Vorderbein Region pro Embryo), das leicht variiert je nach Alter der Embryonen sowie die Dicke der Scheiben. Über 80% der kultivierten Scheiben zeigen Nerven Auswuchs, der througout der Anzucht 2 gemessen werden kann. Repräsentative Ergebnisse mit dem tauGFP Mauslinie demonstriert.
Protocol
Teil 1: Vorbereitung für das Schneiden und Kultivieren.
- Bereiten 10-cm-Zellkulturplatten mit Slicing (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% fötalem Rinderserum, 0,5% Glucose, 1 mM Glutamin, 2,5 mM HEPES, pH 7,3) und 3-cm Millicell-CM 0,4-um Kultur Membran-Einsätze und halten in Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Hitze bis 4% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt in PBS in der Mikrowelle und lassen Sie ihn auf Heizplatte, so dass es bei etwa 37 ° C bleibt
- Füllen Sie 10-cm bakteriologischen Petrischalen mit PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4) und auf Eis stellen.
- Set up Mikrotom Kühleinrichtung oder sicherzustellen, dass Pufferwanne und Kühlelemente in den Gefrierschrank zur Vorkühlung es gespeichert.
Teil 2: Embryo-Einbettung.
- Dissect Embryonen aus der Gebärmutter und untersuchen sie mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop für GFP-Expression zu überprüfen.
- Legen Embryonen auf eine invertierte 10-cm-Petrischale und orientieren sie mit Whatman Papierstreifen übermäßigen PBS zu entfernen.
- Bewerben Agarose auf den Embryo, um es in dieser Position zu fixieren. Lassen Agarose erstarren.
- Begrenzen Sie die Umgebung des Embryos durch Schneiden mit einer Rasierklinge.
- Drehen Sie die eingebettete Embryo auf der anderen Seite.
- Wenden Sie zusätzliche Agarose an embryonalen Gewebe, um sicherzustellen, dass der Embryo vollständig eingebettet ist.
- Bereiten Agarose-Block mit sauberen Kanten und montieren auf Vibratom Spannfutter mit Loctite 406, einem speziellen Klebstoff ähnlich wie bei "Krazy Glue".
Teil 3: Slicing Verfahren.
- Richten Sie die vorgekühlte Pufferwanne und dem Kühlelement.
- Legen Sie das Futter mit der geklebten Gewebe und fügen 1x HBSS (Ca 2 +-Mg 2 +-freiem HBSS, 10 mM HEPES pH 7,3, 500 U / ml Penicillin / Streptomycin) bis bedeckt.
- Insert und beheben vorgereinigt (70% Ethanol) Mikrotomklinge.
- Bereiten Sie 350 bis 450 mu m Scheiben schneiden und übertragen Sie sie mit verkürzten Glas Pasteurpipetten in Zellkulturplatten auf Eis gehalten.
- Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen Agarose von jeder Scheibe und Transfer zum Kultur-Membranen Millicell. Über 4 Scheiben können auf einer Membran in einer 10-cm Gewebekultur Platte mit 6 ml Kulturmedium gefüllt kultiviert werden.
- Inkubieren Scheiben bei 37 ° C und 5% CO 2 (Kulturmedium: DMEM, 25% 1x HBSS, 25% fötalem Rinderserum, 0,5% Glucose, 1 mM Glutamin, 2,5 mM HEPES, pH 7,3). Wenn man Zeitraffer-Imaging-Serie führt man sollte immer das Volumen des Mediums konstant. Im Falle der zeitlich Imaging-Serie für eine kurze Zeitspanne genügt es, das Medium zu verlassen, wie es ist. Für längere Zeiträume Kultur Veränderungen nach 12-20 Stunden empfohlen.
Teil 4: Imaging Spinalnerven Auswuchs am Mikroskop.
- Image Spinalnerven Platzierung einer 10-cm Gewebekulturplatte, mit Millicell Kultur Membranen mit Scheiben, im Rahmen eines aufrechten Fluoreszenzmikroskop.
- Beschriften Sie die Ausrichtung der Millicell Kultur Membranen auf Mikroskop-Bühne, um richtig zu positionieren in den nächsten Bildgebung Zeitpunkt.
- Bild Spinalnerven Auswuchs mit 4x (numerische Apertur [NA] 0,1), 10x (NA 0,3) oder 20x (NA 0,5) Ziele.
Abbildung 1 zeigt ein Imaging-Serie Darstellung der Spinalnerven Auswuchs während 20 Stunden Kultur mit 4x und 10x Ziele.
Abbildung 1 Imaging Reihe von Spinalnerven Auswuchs in eine transversale Scheibe einer homozygoten tauGPF Embryo. * = Motoneuronen des ventralen Rückenmark, Pfeil = DRG. Die Rückenflosse (D)-ventralen (V) Achse der Scheibe angezeigt. Scalebars: 200 um.
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Discussion
In einem umfassenden Vergleich von Methoden zur embryonalen Scheibe Kulturen der Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen (E10 - E12) vorzubereiten, haben wir beobachtet, dass eine Vibratom ohne Frage stellt die zuverlässigsten Ergebnisse sowohl in Bezug auf die allgemeine Rentabilität der Kulturen und die Reproduzierbarkeit der den Nerv Auswuchs Muster. Im Gegensatz dazu bereit Scheiben mit einem McIlwain Gewebe Chopper 3 erwies sich als völlig lebensfähig. Wir hatten ursprünglich eine Guillotine-Methode 4, in dem ein ganzer Wurf von Embryonen gleichzeitig durch Schneiden mit Wolframdrähten seriell um einen Schnitt gewickelt Rost auf 400-um Abschnitte 1 produzieren konnten vorbereitet werden beschäftigt. Obwohl diese Technik hatte den Vorteil der Geschwindigkeit der Vorbereitung, ergab es höchstens eine tragfähige Abschnitt pro Embryo und zeigte eine große Menge an Variabilität in Folge Parameter. Aus diesen Gründen glauben wir, dass ein Vibratom-basierte Methode die bessere Wahl ist trotz der längere Zeit in Vorbereitung. Obwohl diese Lösung durch die Notwendigkeit erfordert eine Vibratom, sind die Ergebnisse weit überlegen, was durch andere "low-tech"-Ansätze erzielt worden, und so rechtfertigt die Investition.
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Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich die ursprüngliche Quelle für die Idee zu schneiden Kultur auf Maus-Embryonen 5 durchführen. Wir möchten Joachim Kirsch für die großzügige wissenschaftliche Unterstützung und Anna Degen anerkennen für die Tätigkeit als unser Mädchen für alles bei den Dreharbeiten. Und der Universität Heidelberg (Exzellenzcluster Cellular Networks): Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9 Deutsche Forschungsgemeinschaft) gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS 10x | GIBCO, by Life Technologies | 14180 | |
| Dissection tools | Fine Science Tools | various | |
| L.M.P. agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Whatmann paper | Whatman, GE Healthcare | 3030917 | |
| Shortened firepolished pipettes | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41966 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 10270-106 | |
| Pen Strep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-glutamine 100x | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Vibratome | Microm International | HM 650 V | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | BX61WI | |
| analySIS | Soft Imaging System | ||
| Millicell-CM inserts | EMD Millipore | PICMORG 50 | |
| 10 cm culture plates | Greiner Bio-One | 633171 | |
| LOCTITE 406 | Henkel Corp | 142580 | |
| Razor blades | Thermo Fisher Scientific, Inc. | none | |
| Dissecting microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| HEPES | Carl Roth Gmbh | 9105.2 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| x4 objective | Olympus Corporation | PL series | |
| x10 objective | Olympus Corporation | UPLFL –PH series | |
| Filter | Olympus Corporation | U-MNIBA2 | |
| CCD camera | Soft Imaging System | SIS F-View II | |
| Equipment for heated chamber | Leica Microsystems | CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171 |
References
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
- Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W.
