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Immunology and Infection

एचआईवी / एड्स के व्यापक और लागत प्रभावी प्रयोगशाला मॉनिटरिंग: एक अफ्रीकी रोल मॉडल

Published: October 31, 2010 doi: 10.3791/2312
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1National Health Laboratory Services (NHLS-SA), 2Department of Molecular Medicine and Haematology, University of Witwatersrand, 3Lightcurve Films

Summary

विरोधी retroviral चिकित्सा एचआईवी / एड्स के इलाज के लिए दक्षिण अफ्रीका में एक बड़े पैमाने पर निगरानी रखी जाती है. प्रवाह cytometry (CD45) रुधिर विज्ञान, इम्यूनोलॉजी (सीडी 4) और वायरल लोड जुड़ा हुआ CD38 परख के लिए संयुक्त है. रिकार्ड NHLS-SA प्रयोगशालाओं, जोहानसबर्ग में, इन आधुनिक तरीकों लागत बढ़ स्थानीय आंतरिक गुणवत्ता नियंत्रण के साथ कुशल हैं, संसाधन सीमित निदान के लिए रोल मॉडल के रूप में सेवारत.

Protocol

परिचय

biomedicine के क्षेत्र में आधुनिक वैज्ञानिक प्रयासों संक्रामक रोगों के लिए कुशल निदान की शुरूआत सहित व्यावहारिक लाभ के लिए सीसा. उच्च गुणवत्ता और तेजी से निदान रोग के खतरे की वजह से वैश्विक यात्रा और 1 दुनिया के गरीबी से त्रस्त इलाकों में वायरल और बैक्टीरियल संक्रमण के वर्तमान विनाशकारी प्रभाव के कारण फैल जरूरत है.

विरोधी retroviral चिकित्सा के साथ एचआईवी पॉजिटिव रोगियों के संसाधन गरीब देशों उपचार (एआरटी) सफलतापूर्वक किया गया है 2,3 शुरू. एआरटी की प्रोटोकॉल वर्तमान में (i) एचआईवी + व्यक्तियों के लिए सीरम वैज्ञानिक परीक्षणों आधारित हैं, (ii) आनुवंशिक दवा regimens की एक बार दैनिक संयोजन 'पहली पंक्ति' एआरटी के रूप में प्रयोग किया जाता है और (iii) CD4 और / या वायरल लोड assays तय जब एआरटी शुरू करने के लिए. प्रोटोकॉल रहे हैं, तथापि, एआरटी के लिए गुंजाइश के रूप में बदल अब आगे और अधिक आराम के लिए एआरटी उच्च सीडी 4 में पहले आरंभ के दिशा निर्देशों के साथ चौड़ी हो सकते हैं 2 गिना जाता है . महत्वपूर्ण बात है, एचआईवी + रोगियों जो उच्च सीडी 4 + सेल / μl रक्त की भी नीचे एचआईवी टीका 4, 5 की मौजूदा कमी के बावजूद हो सकता है एचआईवी के प्रसार को धीमा में एआरटी प्राप्त की संख्या बढ़ रही है.

इस प्रकार एचआईवी संक्रमण के लिए बचे की बढ़ती संख्या में एक पुरानी बीमारी हो, संगठित दवा कभी की तुलना में अधिक की आवश्यकता की ओर अग्रसर है, लेकिन हो सकता है अफ्रीका में प्रयोगशाला और दवा के गरीब राज्य अभी भी प्रभावी स्वास्थ्य देखभाल 6 के एक बाधा रह. आवाज जोर है कि लघु अवधि के अनुदान के प्रावधान स्थायी समाधान 7-9 प्रदान नहीं करता है, और एचआईवी संबंधी वर्तमान पैमाने पर पश्चिमी देशों द्वारा आपूर्ति की अनुदान 8,9 हमेशा के लिए जारी नहीं रख सकते . 2008 में 15,6 अरब अमरीकी डालर कम और मध्यम आय वाले देशों में एड्स कार्यक्रमों पर खर्च किया गया था, और इन के बारे में 50% से बाहरी थे उत्तर अमेरिकी सूत्रों सहित,. गणना के रुझान का पता चलता है कि इस खर्च 2-3 बार उच्च स्तर तक बढ़ाने के लिए, और है कि महामारी अभी भी 2031 में हमारे साथ किया जाएगा जब तक कि वहाँ वर्तमान समग्र दृष्टिकोण 9 में एक परिवर्तन है.

इस प्रकार अफ्रीकी देशों बेहतर एचआईवी की रोकथाम और समझदार 9 लागत बचत से योगदान करना चाहिए. यहाँ हम सुझाव है कि सबसे हाल ही में आविष्कारशील नियमित काम के लिए 'रोल मॉडल' और संसाधन गरीब देशों (अफ्रीका या भारत में जैसे) में स्थापित किया जाएगा शुरू. ये दुनिया के क्षेत्रों में जहां वैज्ञानिकों के लिए पूरी तरह से मौजूदा अंतरराष्ट्रीय समर्थन से लाभ जानने के लिए और फिर अपने कौशल का उपयोग करने के लिए आगे एक वैश्विक विकास के लिए योगदान करके हर दिन प्रौद्योगिकी में सुधार कर रहे हैं.

पश्चिमी चिकित्सा में बड़े शैक्षिक केन्द्रों और अस्पतालों में नैदानिक ​​गतिविधियों अक्सर "departmentalized", यानी अलग अलग haemato -, VIRO, retroviro, bacterio, सीरम में विखंडन के लिए अग्रणी विषयों के लिए ब्याज के क्षेत्रों "मौजूद हो सकता है इम्युनो, और एक एकीकृत दृष्टिकोण एक संक्रामक रोग प्रयोगशाला में इन दोनों क्षेत्रों नैदानिक ​​assays के एक न्यूनतम सेट का उपयोग करने के बजाय कोशिकाविज्ञान प्रयोगशालाओं. इसके अलावा, नैदानिक ​​परीक्षण भी अभी तक बहुत जटिल और महंगा हो सकता है. जाहिर है, ऐसी सेवाओं के बेहतर समन्वित लेकिन इन एकीकृत प्रयास पूरी तरह से पश्चिमी दिशाओं से आने की संभावना नहीं कर रहे हैं की आवश्यकता होगी. नतीजतन, प्रमुख प्रयोगशालाओं और संस्थानों, जोहानसबर्ग, दक्षिण अफ्रीका में Witwatersrand विश्वविद्यालय के साथ सहयोग में राष्ट्रीय स्वास्थ्य प्रयोगशाला सेवा (NHLS एसए) के रूप में, एक अतिरिक्त कार्य का सामना कर रहे हैं को और विकसित करने, संशोधित करने, फिर से ध्यान केंद्रित और उनके सुधार आधुनिक तकनीक के आधार पर लागत प्रभावी निदान.

मौजूदा वीडियो में हम प्रवाह cytometric विधियों का वर्णन करने के लिए एचआईवी संक्रमित रोगियों में चिकित्सा विरोधी retroviral (एआरटी) की निगरानी. इस तकनीक कदम वार का एक संयोजन के लिए छह मॉड्यूल में प्रस्तुत किया है प्रासंगिक haemato, इम्युनो -, और एक एकल ट्यूब में virological assays, आवश्यक आंतरिक गुणवत्ता नियंत्रण (QC) के साथ संयुक्त 10 परीक्षण के reproducibility सुनिश्चित है. मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करता है यहाँ कार्यरत सभी वैज्ञानिक पूरी तरह से स्थापित कर रहे हैं. CD45 अभिकर्मक सफेद रक्त कोशिका 11-13 मायने रखता है, CD4 के साथ संयुक्त करने के लिए "सहायक" टी - लिम्फोसाइटों जो 12-14 एचआईवी के लिए प्राथमिक लक्ष्य कर रहे हैं एन्यूमरेट के लिए है. यह एक "रचनात्मक चाल" है कि एक ही ट्यूब में CD38 सक्रियण मार्कर CD8 + टी कोशिकाओं को एचआईवी (वीएल) वायरल लोड से संबंधित 15-17 परख के रूप में पता चला है. आदेश में दक्षिण अफ्रीकी योगदान पर जोर करने के लिए, हम का कहना है कि इन अवधारणाओं और उनकी लागत प्रभावी व्यावहारिक संयोजन सब NHLS - बुद्धिमत्ता प्रमुख पश्चिमी 10,12,13,16,17 प्रौद्योगिकियों के आधार पर सहयोग में किया गया है बाहर काम किया.

इन assays, संयोजन में बाहर किए गए, जो लंबी अवधि के एआरटी के दौर से गुजर रहे हैं रोगियों के समुचित निगरानी के लिए आवश्यक होने जा रहे हैं. जब लागत - कुशलncy छानबीन है, इस समन्वित प्रवाह cytometry प्रौद्योगिकी 16,18,19 किफायती साबित हो रही है. इन एकल - ट्यूब assays उनके पश्चिमी वेरिएंट पर और इसी तरह अलग उपकरणों और / द्वारा किया या अलग सरोगेट अन्य तरीकों का उपयोग कर के रूप में परीक्षण किए गए परीक्षणों से अधिक लागत बचत का प्रतिनिधित्व करते हैं. ये बचत चर्चा में अलग अलग रखा जाता है.

यह मूल रूप से बस प्रौद्योगिकी है, जो एक एकल ट्यूब में चार रंग प्रवाह cytometry इस्तेमाल की स्वीकृति के लिए, यह एक वीडियो प्रारूप में तकनीकी कदम दिखाने के लिए आवश्यक है. विशेषज्ञ सलाहकार, प्रयोगशाला प्रबंधकों और नीति निर्माताओं, जो आधुनिक चिकित्सा प्रौद्योगिकी शुरू करने के बारे में निर्णय लेने का कर्तव्य ले अक्सर नवीनतम तकनीकी जानकारी के रूप में काम के बोझ के भारी बोझ के साथ बड़े क्षेत्रीय प्रयोगशालाओं में किए गए हैं एक की स्थिति में नहीं देख. इसलिए इस वीडियो में नए घटनाक्रम का विवरण है कि दक्षिण अफ्रीका में पेश किया है> 1000 नैदानिक ​​नमूनों प्रत्येक कार्य 10,13,16,17 दिन परीक्षण के लिए वर्कफ़्लो का अनुकूलन दिखाता है.

प्रोटोकॉल

प्रवाह cytometry

परीक्षण 4 रंग प्रवाह cytometry द्वारा किए गए, लेकिन assays के दो समानांतर ट्यूब (नीचे देखें) में भी 2 रंग का उपयोग किया जा सकता है है. Beckman कल्टर एक्स्ट्रा लार्ज - एमसीएल, स्थिर fluidics 21 के एक cytometer, प्रयोग किया जाता है लेकिन उसी तकनीक भी अन्य cytometers के लिए लागू किया जा सकता है. वर्णित प्रौद्योगिकी ~ 800-1100 नमूने / 10,13 दिन के बड़े दैनिक वर्कलोड संभालती है.

मॉड्यूल 1: उपकरणों की स्थापित

रोज़ रखरखाव प्रदर्शन घर में प्रत्येक दिन में दो बार सफाई: शुरू हुआ और पिछले मरीज के नमूने के पूरा होने पर. इस वैक्यूम लाइनों की निस्तब्धता और Clenz (ई.पू., मियामी, FL 5% सोडियम hypochlorite) प्राप्त शामिल है. इसके अलावा, प्रत्येक 30 ट्यूब हिंडोला Clenz और आसुत जल के अंत में इस प्रणाली के माध्यम से चलाया जाता है प्रोटीन कम से कम निर्माण.

पर दैनिक शुरू वैक्यूम दबाव और रीडिंग की जाँच कर रहे हैं. यह पुष्टि की है कि पृष्ठभूमि मायने रखता है स्वीकार्य रहते हैं (<100 सेकंड में 100 घटनाओं). यह पहले रक्त के नमूने को चलाने के बाद की स्थापना की है कि म्यान तरल पदार्थ की एक विभाज्य में carryover <1% है. फिर लेजर संरेखण और प्रतिदीप्ति संवेदनशीलता दैनिक FlowCheck 21 का एक नमूना का उपयोग करने के लिए निगरानी कर रहे हैं. यह देखा गया है कि मीन चैनल संख्या लगातार कम भिन्नता (आधा शिखर CV <मान 2%) के साथ (500 ± 50). मुआवजा साप्ताहिक की जाँच की है, FlowSet मोती देखना है कि क्या मतलब चैनल मान पूर्व निर्धारित लक्ष्य 22 मूल्यों का 1% के भीतर हैं प्लॉट किए जाते हैं . नेत्रहीन Levey जेनिंग्स भूखंडों, मतलब चैनल संख्या और परिवर्तन चार प्रतिदीप्ति चैनलों (FL1 FL4) दैनिक प्रदर्शित कर रहे हैं के लिए (HPCV) मान के आधे चोटी गुणांक पर शुद्धता की पुष्टि. अगला CD4 गिनती की सटीकता दो सीडी 4 स्तर पर पुष्टि की है. PLG CD4 के दौरान परीक्षण स्थिर रक्त प्रक्रिया नियंत्रण (IMMUNOTROL) सामान्य कम उपयोग किया जाता है (450-700 CD4 कोशिकाओं / μl) और निम्न स्तर (100-200 CD4 कोशिकाओं / μl बैच के आधार पर, 23 रेफरी). ये Immunotrol मूल्यों <5%% CV के साथ एसडी की 0.5 मतलब के भीतर अंतरराष्ट्रीय BC-IQAP 24 कार्यक्रम, ब्रिटेन NEQAS 25 और AFREQAS 26 द्वारा अनुरोध के रूप में आवश्यक हैं. यह महत्वपूर्ण है कि इन सरल संगठित रूप में वीडियो में दिखाया गया है उपायों के साथ मजबूत प्रवाह cytometers दोनों निरपेक्ष सीडी 4 परीक्षण के रूप में और प्रतिदीप्ति तीव्रता सक्रियण मार्कर CD38 के लिए इस्तेमाल किया माप के लिए गिनती सेल के लिए आवश्यक स्थिरता बनाए रख सकते हैं. यह स्थिरता हाल ही में 17 में विस्तार से प्रलेखित किया गया है पिछले अन्य cytometers 15,27 का उपयोग अध्ययन की पुष्टि.

साप्ताहिक रखरखाव के दौरान सूची मोड डेटा फ़ाइलों (LMD) भविष्य में संदर्भ के लिए संग्रह कर रहे हैं और इस संग्रहीत सामग्री तो cytometer हार्ड ड्राइव से नष्ट कर दिया है.

मासिक रखरखाव अभिकर्मक कंटेनर, म्यान, clenz और अपशिष्ट टैंक की सफाई भी शामिल है. जबकि सभी फिल्टर को भी हटा रहे हैं और धोया नमूना हिंडोला मोड सिर साफ किया जाता है. यह सफाई भी तैयारी स्टेशनों TQPrep और PrepPlus2 (ई.पू., FL) बढ़ाया है. पुस्तिका तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया pipettes घर में कम से कम हर 3 महीने मान्य हैं, लेकिन विंदुक अगर pipetting अशुद्धि संदेह है तुरंत सेवा के बाहर सुधारात्मक कार्रवाई के लिए ले लिया. छह मासिक रखरखाव के Beckman कल्टर, एसए द्वारा निर्धारित है.

मॉड्यूल 2: तैयारी नमूने

CD45/CD4 दो रंग PanLeucogated 5 प्रोटोकॉल के लिए Beckman कल्टर FlowCARE 28 किट एक प्रक्रिया lyse नहीं धो (IMMUNOPREP, Beckman कल्टर, FL) में प्रयोग किया जाता है . और CD4 phycoerythrin (पीई, नारंगी), इस किट (हरी FITC) CD45-fluorescein आइसोथियोसाइनेट शामिल है. प्रवाह गणना 29 मोती थोक में खरीदी कर रहे हैं और कर रहे हैं के लिए जाना जाता numbe के रूप में एक विशेष ऑपरेटर के अनुकूल भूमिका निभा जोडी हैंएक ज्ञात मात्रा में मोतियों की रु 30 नमूने में मौके पर pipetted हैं. यह उसी pipetting के रूप में रक्त की मात्रा देने के लिए इस्तेमाल किया है के साथ किया जाता है. इस प्रकार अपेक्षित श्रेणी में मनका गणना दर (BCR) से पता चलता है कि दिए गए नमूने में pipetting ठीक किया जाता है, के रूप में नीचे 3 मॉड्यूल में वर्णित है. महत्वपूर्ण बात है, यहाँ सरल pipetting विधि, 'आगे pipetting' के रूप में संदर्भित, सबसे अच्छा काम करता है, प्रदान करने कि मनका और रक्त मात्रा एक ही विंदुक और टिप के साथ और समान 30 को संभालने के साथ वितरित कर रहे हैं. हमने पाया है कि आगे pipetting ऑपरेटरों को सम्मान के साथ प्रयोगशालाओं, दोनों के बीच इष्टतम समग्र एकरूपता झुकेंगे स्वीकार्य सहिष्णुता दोहराया के रूप में सह - कुशल (% CV) भिन्नता 10,31,32 द्वारा मापा वितरण की सीमा और reproducibility के भीतर pipetting लक्ष्य को प्राप्त करने है. स्थानीय कांग्रेस 32 पर प्रस्तुत किया, इस विधि, दक्षिण अफ़्रीकी नेशनल एक्रेडिटेशन (SANAS, www.SANAS.co.za) स्कीम के दिशानिर्देशों के तहत उपयोग के लिए मंजूरी दे दी है. मोतियों की इस BCR उपयोग अन्य तरीकों जहां सबसे अक्सर बीडीएस Trucount तैयारी जैसे lyophilized मनका उत्पाद का उपयोग किया जाता है जो मोतियों की ज्ञात संख्याएँ हों गिनती बड़ा से अलग है. ये तैयारियाँ प्रवाह गणना (FCR) दर 20,31 विधि द्वारा प्रवाह यंत्र की fluidics की स्थिरता दस्तावेज़ उत्कृष्ट हैं. फिर भी, तैयार किया मनका युक्त ट्यूबों का उपयोग प्रौद्योगिकी और अधिक जटिल renders क्योंकि यहाँ यह अत्यंत निरपेक्ष परिशुद्धता के साथ इन ट्यूबों में रक्त की मात्रा देने के लिए आवश्यक है. यह आम तौर पर सहमत है कि उस उद्देश्य के लिए केवल "रिवर्स pipetting" प्रौद्योगिकी लागू प्रशिक्षण के बाद स्वीकार्य है. हमारे BCR विधि इसलिए है, कम खर्चीला, अधिक जानकारीपूर्ण, सरल और आसान वीडियो में दिखाया के रूप में जानने - जब वैकल्पिक इसी तरह 10,31,32 तरीकों की तुलना में हम यह भी पाते हैं कि आगे pipetting का उपयोग ऑपरेटरों को कम करने के लिए की संभावना है. विंदुक है जो रिवर्स pipetting के साथ दोनों आंतरिक तंत्र को नुकसान और फिर अंशांकन के लिए की जरूरत है जो दूरदराज के स्थानों में मुश्किल है करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं में नमूना aspirate. हमारे BCR विधि भी छोटे से मध्यम आकार के (एक सूची) प्रयोगशालाओं में स्वचालित pipetting प्रणालियों के लिए जरूरत obviates.

रक्त के नमूनों को हमेशा द्वितीय श्रेणी biohazard मंत्रिमंडल में संसाधित कर रहे हैं. आदेश में शूटिंग के दौरान व्यापक शोर से बचने के लिए, दिखाया वीडियो इन अलमारियाँ के बाहर सुरक्षित सामग्री के साथ एक पुनः अधिनियमन है. PLG - CD4 cytometers पर अधिग्रहण प्रोटोकॉल एक समय एक निश्चित समय सीमा पर रोकने के लिए या 5000 लिम्फोसाइट घटनाओं को प्राप्त करने के लिए कम CD4 गिनती के साथ नमूनों पर सटीकता में सुधार के लिए जारी की अनुमति देता है.

3 मॉड्यूल: मोतियों की गणना दर (BCR)

हमारी प्रणाली या प्रत्येक नियंत्रण के नमूने में निगरानी मनका गिनती दर (BCR) मनका घटनाओं / सेकंड 10,13,30,32,33 सूत्र का उपयोग कर की गणना की जाती है . मीन, एसडी और% CV मूल्यों स्प्रेडशीट पर इस्तेमाल कर रहे हैं पहचान BCR 30 outliers के लिए एक दृश्य साजिश उत्पन्न हैं. ये pipetting, प्रसंस्करण, और विश्लेषण के तीन प्रणालियों नमूना तैयार सत्यापन (एसपीवी) के रूप में निर्दिष्ट है, दोनों मैन्युअल रूप से या PrepPlus2 स्वचालित pipetting 10 साधन का उपयोग करके pipetted नमूने के लिए लागू की इष्टतम संचालन की पुष्टि.

अधिग्रहण के दौरान BCR परिणाम सीधे मॉनिटर पर वास्तविक समय में देखा जाता है. ई.पू. cytometers में मतलब BCR के मूल्य 80 ± 5 घटनाओं / सेकंड है. हम बताते हैं कि न्यायपालिका BCR-पहचान कर रहे हैं और फिर से चलाने से पहले रोगी के परिणाम जारी कर रहे हैं. निर्णय पेड़ एल्गोरिथ्म चित्रा 1 में सचित्र है (ref.10 भी देखें).

साधन malfunctions BCR में उतार चढ़ाव के द्वारा संकेत कर रहे हैं जब अनुदैर्ध्य सटीक सत्यापन (LPV) के दौरान निगरानी की प्रवृत्तियों, पैटर्न और अचानक 10 पाली pipetting का पता लगाने. Fluidics सटीक सत्यापन (FPV) एक वैकल्पिक प्रक्रिया घर में जहां मोतियों की एक एकल कमजोर पड़ने धारावाहिक अधिग्रहण के लिए 10 ट्यूबों में aliquoted एक संभावित दुर्व्यवहार 10 लिखत पर fluidic अस्थिरता के लक्षण की पुष्टि है .

4 मॉड्यूल: CD45

हमारे अध्ययन में नियमित निरपेक्ष मायने रखता है के लिए एक पूर्ण रक्त गणना विश्लेषक LH 750 (के Beckman कल्टर), मासिक कैलिब्रेटेड, दैनिक सफेद सेल गिनती के लिए एक संदर्भ (WCC) के खिलाफ जो प्रवाह cytometers तुलना कर रहे हैं के रूप में प्रयोग किया जाता है. CD45 उत्पन्न प्रवाह cytometers पर WCC भी स्थिर Beckman कल्टर 5C पूरे रक्त सेल नियंत्रण के तीन स्तरों के साथ तुलना के द्वारा दैनिक मान्य हैं. WCC समझौते के प्रवाह CD45 मायने रखता है और पूर्ण रक्त गणना analyzers के बीच स्वीकार्य सीमा <5 10% हैं . यह है कि संकेत करता है कि जब संसाधन प्रतिबंध हमारी सेवा में और अधिक तो एक जैसे एक प्रवाह cytometer एक साधन है, की तुलना में गंभीर हैं, चिकित्सकीय उपयुक्त WCC सहित CD4 गिनती प्रदान करने के लिए पर्याप्त हो लगता है.

व्हाइट CE केकरेंगे अंतर गिनती विभिन्न haematological analyzers जो अलग पर monocyte मायने रखता है का आकलन करने में विशेष रूप से प्रदर्शन कर रहे हैं. अंतर CD45 अभिव्यक्ति के पैटर्न अंतर WCC 11,12, 34 के लिए एक के प्रवाह प्रौद्योगिकी के शास्त्रीय उपयोग है . प्रवाह cytometer व्युत्पन्न CD45 WCC और अंतर मायने रखता है के रूप में सही, सटीक और मजबूत साबित हो रहे हैं, इन नियमित रूप से परीक्षण PLG CD4 विधि में शामिल किया जा सकता है और यह भी कोई अतिरिक्त कीमत पर चिकित्सकों के लिए उपलब्ध कराया.

असामान्य CD45 पैटर्न PLG - CD4 प्रोटोकॉल के CD45/side स्कैटर भूखंडों पर नोट कर रहे हैं और बाद ऊपर एक दाग रक्त आगे चिकित्सीय जांच शीघ्र फिल्म पर. इस विधि (बैक्टीरियल और वायरल संक्रमण), लेकिमिया और दोनों एचआईवी नेगेटिव और एचआईवी + 34 रोगियों, 35 पर लिंफोमा का पता लगाता है. एक नियमित प्रयोगशाला के दौरान अनुवर्ती एचआईवी + रोगियों में पूर्ण रक्त गणना है रुधिर विज्ञान प्रयोगशाला से बार - बार अनुरोध नहीं है. इसलिए असामान्य CD45 पैटर्न निदान कर रहे हैं जब खुलकर CD4 गिनती के लिए भेजे गए नमूनों में मनाया. एक अतिरिक्त लाभ यह है कि सटीक निरपेक्ष CD4 गिनती अभी भी 35 रक्त में लेकिमिया या लिंफोमा के निष्कर्ष के साथ रोगियों में भी बनाया जा सकता है,.

CD45 फ्लो अच्छी तरह से रुधिर मानकीकरण के लिए अनुकूल है. haematological उपकरणों एक दूसरे से काफी अलग हैं. हम WBC भिन्नता के लिए CD45 आधारित प्रवाह cytometric गुणवत्ता नियंत्रण शुरू सुझाव है कि तुलना और haematological 10,36 analyzers के मानकीकरण.

मॉड्यूल 5: सीडी 4

PLG - CD4 के Beckman कल्टर एक्स्ट्रा लार्ज सॉफ्टवेयर पर शुरू प्रोटोकॉल आठ डॉट भूखंडों के होते हैं. इनमें से 4 CD4 गिनती और 4 गुणवत्ता निगरानी 12,13 के लिए कर रहे हैं निर्धारित किया जाता है. इनमें दो Fig.2 में दिखाया गया है डॉट भूखंडों महत्वपूर्ण हैं. सभी सफेद कोशिकाओं CD45 और पक्ष तितर बितर (एक 2 डॉट साजिश क्षेत्र) का उपयोग करते हुए मलबे, लाल रक्त कोशिकाओं / भूत और प्लेटलेट्स की अनदेखी कर रहे हैं की पहचान कर रहे हैं. CD45 + घटनाओं तब डॉट 3 - साजिश करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं, जहां सीडी 4 + लिम्फोसाइटों उनके उज्ज्वल CD4 अभिव्यक्ति और कम पक्ष तितर बितर (क्षेत्र सी) द्वारा की पहचान कर रहे हैं. निरपेक्ष + लिम्फोसाइट गिनती सीडी 4 क्षेत्र सी और WCC में घटनाओं की संख्या (प्रवाह गणना अंशांकन क्षेत्र में एफ) से गणना कर रहे हैं. लिम्फोसाइटों के सीडी 4% के लिए मान क्षेत्र 2 बी डॉट साजिश से प्राप्त कर रहे हैं. दृढ़ता से सीडी 4 + टी lymphocytes और कमजोर CD4 + monocytes CD4 प्रतिदीप्ति तीव्रता और तितर बितर सुविधाओं द्वारा अभिकर्मक कॉकटेल (ref.13 में समीक्षा) में एक अतिरिक्त CD3 टी सेल विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए एक की जरूरत के बिना भेदभाव कर रहे हैं.

CD8/CD38: 6 मॉड्यूल

CD8-CD38 धुंधला 4 रंग धुंधला हो जाना CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD38-PC5 का उपयोग का एक हिस्सा है. CD4/CD45 ऊपर के रूप में एक ही (फ्लो केयर PLG सीडी 4 -) है, और दो ​​अतिरिक्त अभिकर्मकों 17 CD8-ECD/CD38-PC5 हैं. यदि एक cytometer केवल दो रंग चलाता है, एक अतिरिक्त ट्यूब CD8-FITC/CD38-PE धुंधला दो रंग प्रदर्शन जोड़ा जाता है, फिर से प्रक्रिया lyse नहीं धो (IMMUNOPREP, Beckman कल्टर, FL) का उपयोग. एक gating CD4 के लिए इसी तरह की रणनीति CD8-ECD बनाम ओर तितर बितर (चित्रा 3) के साथ CD8 + टी कोशिकाओं की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है. CD8 + लिम्फोसाइटों पर CD38 अभिव्यक्ति CD38-PC5 के एकल पैरामीटर हिस्टोग्राम के रूप में प्लॉट है प्रतिदीप्ति (एमएफआई) तीव्रता सेल बनाम 16,17 गिनती मतलब है. CD38 एमएफआई मूल्यों sequentially एक ही रोगी के प्रत्येक यात्रा के लिए प्लॉट किए जाते हैं. पहली यात्रा (पहले इलाज के लिए) 'आधारभूत' एमएफआई मूल्य के लिए जो एक ही व्यक्ति CD38 एमएफआई के हर दूसरे यात्रा 16 की तुलना में है .

नियंत्रण और साधन स्थिरता मॉड्यूल 1 में वर्णित के रूप में प्रवाह के दैनिक अधिग्रहण पर आधारित है लेजर संरेखण और वोल्टेज स्थिरता की निगरानी की जाँच करें. फ्लो सेट में सभी चार फ्लोरोसेंट चैनल (ऊपर देखें) के लिए रंग मुआवजा सेट. Immunotrol 'नकारात्मक' प्रक्रिया नियंत्रण नमूना है. 'सकारात्मक' नियंत्रण सामान्य रक्त में monocytes सेल प्रति 9 x 10 3 CD38 अणुओं को व्यक्त कर रहे हैं, और एक ज्ञात एचआईवी + नमूना अनुपचारित 17 .

दक्षिण अफ़्रीकी राष्ट्रीय स्वास्थ्य प्रयोगशाला सेवा (एसए NHLS) के नेटवर्क प्रयोगशालाओं को अपनाया है

गुणवत्ता नियंत्रण मानक संचालन प्रक्रिया और प्रशिक्षण सामग्री से युक्त एक केंद्रीकृत डेटाबेस के साथ 70 13 प्रयोगशालाओं, 33 के पार मानकीकृत तरीके. नेटवर्क में प्रयोगशालाओं चर्चा, आगे 32,33 प्रौद्योगिकी pipetting की जांच सहित प्रशिक्षण और नियमित रूप से ऑडिशन के द्वारा मदद कर रहे हैं. गुणवत्ता मूल्यांकन कार्यक्रम मासिक नजर रखी है. इस तरह, गुणवत्ता प्रबंधन क्षेत्रीय न्यागत है, लेकिन उच्च मानकों एसए NHLS क्यूए 13 विभाग, 26 के योगदान के साथ रखा जाता है .

सूची 1 एचआईवी रोग में समन्वित cytometry के साथ संभावित लागत बचत :

  1. परिचित और सेवा अनुबंध के साथ एक एकल लिखत के एपी के बजाय, उपयोगएकाधिक haematological प्रतिरक्षाविज्ञानी, और virological उपकरण चलाने
  2. एक एकल ट्यूब में अतिरिक्त लागत के बिना और करने के लिए और दोनों WCC, WBC अंतर मायने रखता सीडी 4 परीक्षण और CD38MFI निगरानी सहित विभिन्न स्थानों से नमूने भेजने के बिना assays के प्रदर्शन को एआरटी की प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी
  3. CD38 एमएफआई रिपोर्टिंग के साथ कला के जवाब के तत्काल रिपोर्टिंग, काफी प्रतिवर्तन पारंपरिक एचआईवी VL रिपोर्टिंग के सापेक्ष समय (वास्तविक समय) में सुधार
  4. स्पष्टता और संयुक्त मूल्यांकन के परिणामों के एक ही रिपोर्टिंग रूपों पर नैदानिक ​​इस्तेमाल
  5. स्वचालित pipetting उपकरणों के लिए की जरूरत है "आगे" pipetting इस्तेमाल किया और BCR द्वारा नमूने निगरानी कर रहे हैं सरल विधि के रूप में नकार दिया गया हो सकता है,
  6. आपरेशन के दौरान नमूने के गलत हैंडलिंग की पहचान की है और समस्या परीक्षण के परिणाम के पहले परिणाम अधिकृत कर रहे हैं सुधारा
  7. साधन की खराबी के लिए प्रोएक्टिव निवारक प्रबंधन जल्दी सेवा की बुकिंग के लिए अग्रणी एक गंभीर दुर्घटना से पहले
  8. लेकिमिया / lymphomas की नियमित सेवा गतिविधि के दौरान पहले से न सोचा मामलों का निदान
  9. इसी तरह प्रवाह प्रौद्योगिकी के लेकिमिया phenotyping और निगरानी के लिए एक्सटेंशन
  10. CD38 परीक्षण के सभी रोगियों में एचआईवी VL परीक्षण और मूल्यांकन के लिए डीबीएस भेजकर लागत बचत के लिए सूखे खून के धब्बे (डीबीएस) के भंडारण के साथ समन्वय अगर केवल वहाँ नैदानिक ​​कर रहे हैं या ऐसा करने के लिए CD38 संकेत
  11. इसी तरह के प्रवाह को बदलने के प्रौद्योगिकी इंटरफेरॉन-γ तपेदिक assays में ELISpot विधि
  12. परिधीय प्रयोगशालाओं जो "बिंदु की देखभाल" सीडी 4 परीक्षण करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण
  13. CD3 ऐसे एंटीबॉडी के रूप में में "अवांछित" अभिकर्मकों की लागत बचत और सबसेट मार्करों (लेकिन CD38 बजाय क्रय)
  14. BCR परीक्षण के लिए सस्ती मोतियों की थोक खरीद (महंगा पूर्व pipetted गिनती ट्यूब खरीदने के बजाय)
  15. एक नेटवर्क फायदेमंद थोक कीमतों के लिए व्यावसायिक कंपनियों के साथ संयुक्त वार्ता में

चित्रा 1
चित्रा 1. निर्णय / पेड़ एल्गोरिथ्म इस्तेमाल किया जब एक नमूना परीक्षण मनका गिनती दर (BCR) के एक दूरस्थ परिणाम से पता चलता है. मुख्य कार्य के लिए आंतरायिक बड़ा विफलता बनाम pipetting त्रुटि बाहर है. आरेख त्रुटियों की संभावित कारणों से पता चलता है है. यह भी संकेत दिया है जो कि प्रोटोकॉल histograms और आँकड़ों के 10 प्रभावित कर रहे हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2 PLG CD4 प्रोटोकॉल है कि CD45 (हरा, x-अक्ष) FITC शामिल की एक उदाहरण है. बनाम पक्ष (जटिलता, y-अक्ष) स्कैटर और CD4 पीई, (नारंगी, X-अक्ष) बनाम ओर तितर बितर ( जटिलता, y-अक्ष). गेट 'ए' कुल लिम्फोसाइटों 'बी' के चयनित गेट के साथ सफेद सेल की आबादी है. गेट 'ए' सही पर दूसरी आरेख को हस्तांतरित है क्रम में करने के लिए + गेट 'सी' में सीडी 4 लिम्फोसाइटों की पहचान है.

चित्रा 3
चित्रा 3 CD45/CD4 panleucogating परख के संयोजन. CD8/CD38 परख (आरेख '4 'और '6 में) के साथ (आरेख '2' और '3 'में Fig.2 भी देखें) . जब कुल leucocytes आरेख (गेट 'ए') '4 को हस्तांतरित कर रहे हैं '(x'अक्ष) और पक्ष तितर बितर, यहाँ CD8 + लिम्फोसाइटों CD8-ECD के आधार पर gated हैं' ('y'-अक्ष, के रूप में दिखाया गया गेट 'डी' में). तब आरेख '6 'सीडी 8 + कोशिकाओं स्थानांतरित कर रहे हैं एक एकल पैरामीटर आरेख में CD38-PC5 धुंधला तीव्रता कल्पना. यह पैरामीटर '6 आरेख में 'जी' के रूप में दिखाया गया है. मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता CD38-PC5 (एमएफआई) दर्ज की गई है. एआरटी में इस मूल्य 16,17 धीरे - धीरे घट जाती है.

Discussion

हाल के वर्षों में दान - प्रेरित और अनुदान आवंटित कार्यक्रमों को उच्च एचआईवी बोझ के साथ दुनिया के संसाधन सीमित क्षेत्रों में कुछ उत्कृष्ट नैदानिक ​​प्रथाओं की स्थापना में मदद मिली है. एआरटी कार्यक्रमों मृत्यु दर को कम करने में सफल रहा है और अब उच्च सीडी 4 पर शुरू किया जा रहा है 2,3 मायने रखता है. वहाँ पहले से ही कर रहे हैं संकेत मिले हैं कि इन नए उपायों के एचआईवी 4,5 संक्रमण के प्रसार में कमी होगी, एचआईवी विशिष्ट एक टीके की कमी के बावजूद. हमारे वीडियो दस्तावेज़ हम में है कि जब एआरटी पर रोगियों की निगरानी, ​​इन तकनीकों को बेहतर हो सकता है और ध्यान केंद्रित कर सकते हैं कि दिनचर्या पश्चिमी प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन (एक सूची) अभ्यास में मनाया की तुलना में अधिक लागत प्रभावी बन.

इस तरह के एक दृष्टिकोण अफ्रीकी नेतृत्व को अच्छी तरह से जब एचआईवी संक्रमण, एआरटी के साथ इलाज किया, एक पुरानी बीमारी होता जा रहा है एक समय में प्रयोगशाला सेवाओं के उन्नयन का समर्थन आवश्यक हो सकता है. एआरटी के इस तरह के एक निगरानी सटीक गिनती CD4 और वायरल लोड से संबंधित प्रौद्योगिकी, एक अधिक की मांग की तुलना में कार्य बस एक मनमाना समूहों में रोगियों रखने के क्रम में 16 एआरटी शुरू करने के बारे में एक निर्णय की सहायता के लिए CD4 गिनती प्रदर्शन करने की आवश्यकता है. इन निदान की मदद के साथ, अर्थात् CD8/CD38 परीक्षण का उपयोग कर, यह संभव है VL से संबंधित> 16,19 एआरटी पर रोगियों के 60% में निगरानी की लागत को कम . यह भी महत्वपूर्ण है जोर है कि यह CD8/CD38 16,17 परीक्षण है, और नहीं CD4 गिनती 37 है, जो दवा लेने में वीएल rebounds और / या रोगी अनुपालन की कमी के प्रारंभिक लक्षण लेने की संभावना है.

एक समन्वित लागत प्रभावी केंद्रीय सेवा का एक अनिवार्य तत्व एक बड़े पैमाने पर राष्ट्रीय या क्षेत्रीय विशेषज्ञों और शैक्षिक सलाहकारों जो आपरेशन के तकनीकी और चिकित्सा पहलुओं के साथ परिचित हैं के द्वारा समर्थित नेटवर्क की उपलब्धता है. यह दक्षिण अफ्रीकी NHLS नेटवर्क की गतिविधियों और जो सीडी 4 - PLG.net प्रशिक्षण 33 योजनाओं, 36 छोटे केन्द्रों के लिए प्रोत्साहन, शिक्षा, और गुणवत्ता के मूल्यांकन प्रदान करते हैं और ये भी 'बिंदु की देखभाल सेवाओं में शामिल हो सकते हैं के द्वारा प्रदर्शन किया है.

महत्वपूर्ण बात है, केंद्रीय और बिंदु का ध्यान प्रयोगशालाओं के संचालन के पूरक हैं. जबकि पूर्व एक लागत प्रभावी सेवा बड़े पैमाने पर आपरेशन के रूप में अच्छी तरह के रूप में परिधीय प्रयोगशालाओं 33,38 के लिए बुनियादी / उन्नत प्रशिक्षण प्रदान करने की दोहरी भूमिका है, बाद एचआईवी + जो रोगियों के लिए पात्र हैं की भर्ती द्वारा एआरटी के प्रसार की जांच के लिए योगदान देता है एक बड़ा ग्रामीण क्लीनिक का आधार है, सहित से एआरटी. यहाँ कुछ सावधानी आवश्यक है क्योंकि बिंदु की देखभाल के निदान और अधिक महंगा हो सकता है और 38 सटीकता स्वचालित रूप से इस बात की गारंटी नहीं दे सकते हैं. इसलिए यह समझदार के लिए दो स्तरीय प्रणाली को बनाए रखने के लिए और के दो स्तरों के बीच या तो हाथ सूखना करने के लिए अनुमति के बिना समन्वय की सुविधा है.

अंत में, संक्रामक रोगों के नैदानिक ​​प्रबंधन के निदान की निगरानी के क्षेत्र में एक आवश्यक लागत बचत उपयुक्त सेवाओं है कि एक काफी सुधार 13,39 गुणवत्ता के साथ कम खर्चीला और बेहतर समन्वित आधुनिक प्रौद्योगिकी का उपयोग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. अच्छी तरह से आयोजित राष्ट्रीय (क्षेत्रीय) नैदानिक ​​सेवा प्रावधानों बेहतर जब लगभग सभी अनुदान सहायता के रूप में जल्द ही महंगा है और / या नाया तरीकों पर बर्बाद किया है के रूप में इन अमीर देशों से आयात कर रहे हैं एक परिदृश्य से बचने के द्वारा किया जाना चाहिए पूर्व एक सावधान बिना 6-8 समर्थित emptive रचनात्मक जांच. इसी तरह, स्थानीय डॉक्टरों और स्वास्थ्य कर्मियों की पूर्ण भागीदारी के साथ नैदानिक ​​चिकित्सकीय परीक्षणों की एक और अधिक लचीला डिजाइन अनावश्यक अक्सर और / या प्रयोगशाला परीक्षण 3 - महत्वाकांक्षी से अधिक की कमी करने के लिए नेतृत्व चाहिए . इस नीति एआरटी पर मरीजों की एक समन्वित नैदानिक ​​/ प्रयोगशाला मूल्यांकन में उपलब्ध सटीक नैदानिक ​​परिणामों के एक फुलर उपयोग करने के लिए और अधिक मौका देना होगा. ये स्मार्ट निदान भी तपेदिक के क्षेत्रों और leukaemias में संसाधन गरीब 8 देशों के एक मौजूदा परिचित प्रवाह cytometric 40 मंच का उपयोग करने के लिए बीड़ा उठाया जा सकता है.

Disclosures

सीडी 4 विधि के लिए अंतरराष्ट्रीय पेटेंट अधिकार यहाँ वर्णित दक्षिण अफ्रीका NHLS द्वारा और वर्तमान में बीसीआई, मियामी, FL, संयुक्त राज्य अमेरिका के लिए लाइसेंस के अंतर्गत आयोजित कर रहे हैं.

Acknowledgments

\ \ Www.nhls.ac.za और http://www.plgcd4: विशेष धन्यवाद एचआईवी संबंधित प्रवाह नैदानिक ​​सेवाओं के राष्ट्रीय संगठन के लिए दक्षिण अफ्रीका के गणराज्य के राष्ट्रीय स्वास्थ्य प्रयोगशाला (NHLS) सेवा (http के कारण कर रहे हैं शुद्ध). Haematology और आण्विक चिकित्सा, Witwatersrand विश्वविद्यालय के विभाग में विशेष रुप से प्रदर्शित अध्ययन किया है (जोहानसबर्ग, दक्षिण अफ्रीका, विभाग के प्रमुख प्रोफेसर वेंडी स्टीवंस द्वारा समर्थित). लेखक वाणिज्यिक कंपनियों या एजेंसियों धन से इस प्रकाशन के लिए कोई अनुदान सहायता प्राप्त है. राय व्यक्त जरूरी Witwatersrand या दक्षिण अफ्रीका NHLS के विश्वविद्यालय के संस्थानों के विचारों को दर्शाती बिना उन लेखकों की हैं.

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इम्यूनोलॉजी 44 अंक मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) CD4 गिनती लिम्फोसाइट सफेद कोशिका गिनती CD45 panleucogating लिम्फोसाइट सक्रियण CD38 एचआईवी वायरल लोड एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (एआरटी) आंतरिक गुणवत्ता नियंत्रण
एचआईवी / एड्स के व्यापक और लागत प्रभावी प्रयोगशाला मॉनिटरिंग: एक अफ्रीकी रोल मॉडल
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Lawrie, D., Janossy, G., Roos, M.,… More

Lawrie, D., Janossy, G., Roos, M., Glencross, D. K. Comprehensive & Cost Effective Laboratory Monitoring of HIV/AIDS: an African Role Model. J. Vis. Exp. (44), e2312, doi:10.3791/2312 (2010).

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