Summary
A continuación se describe un ensayo de novela de Vigilancia de la aceptación de priones y el tráfico por las células inmunes inmediatamente después de la inoculación intraperitoneal de purificación y el etiquetado fluorescente barras de agregados de priones a partir de material cerebral infectado entonces el seguimiento de su consumo y el movimiento del punto de inyección y la caracterización de las células mediadoras de estos eventos.
Abstract
Presencia de una forma anormal de una proteína priónica codificada por el hospedador (PrP), que es resistente a la proteasa, patológicos e infecciosos caracteriza a las enfermedades por priones, tales como caquexia crónica (CWD) de los cérvidos y la tembladera en las ovejas. La hipótesis del prión afirma que esta conformación anormal constituye la mayor parte o la totalidad de los priones infecciosos. El papel del sistema inmunológico en los primeros eventos en la patogénesis del prión periférico ha sido demostrado de manera convincente de la caquexia crónica y 1-3 scrapie. Transgénicos y los estudios farmacológicos en ratones revelaron un papel importante del sistema del complemento en la retención y la reproducción de los priones poco después de la infección por 4-6. In vitro e in vivo también han observado la retención de priones por las células dendríticas 70-10, aunque su papel en el tráfico sigue siendo claro 11-16. Los macrófagos también han sido implicados en la patogénesis del prión temprano, pero estos estudios se han centrado en los acontecimientos que ocurren semanas después de la infección 3,11,17. Estos estudios previos también sufren el problema de diferenciar entre endógeno PrP C y los priones infecciosos. Aquí se describe un método semicuantitativo, imparcial para evaluar la absorción de priones y el tráfico del sitio de la inoculación de las células inmunes reclutados en ella. Barras de agregados de priones fueron purificados de homogenato de cerebro infectado por solubilización de detergente no agregados y proteínas ultracentrifugación a través de un colchón de sacarosa. Electroforesis en gel de poliacrilamida, teñidos de azul Coomassie y el oeste de la recuperación de las barras de Blot confirmó priones altamente enriquecido en la fracción de gránulos. Barras de priones por vía intraperitoneal fueron marcados con fluorocromos luego inyectadas en ratones. Dos horas más tarde, las células inmunes del líquido lavado peritoneal, el bazo y los ganglios linfáticos del mediastino y mesentéricos se analizaron para la retención de priones vara y subconjuntos de células identificadas mediante citometría de flujo multicolor con marcadores de monocitos, neutrófilos, células dendríticas, macrófagos y células B y T. Este ensayo permite el control directo por primera vez de las células inmunes y la adquisición de los priones en el tráfico vivo en cuestión de horas después de la infección. Este ensayo también se diferencia claramente los priones infecciosos, agregados de PrP normalmente se expresa en las células huésped, que puede ser difícil y llevar a problemas de interpretación de los datos en los sistemas de ensayo de otros. Este protocolo se puede adaptar a las rutas de inoculación otros (oral, intranervous intravenosa y subcutánea, por ejemplo) y los antígenos (cuentas conjugado, los patógenos bacterianos, virales y parasitarias y las proteínas, el huevo), así.
Protocol
1. Purificación y Etiquetado de Prion Rods
Este protocolo es una adaptación de otra publicada anteriormente 18
- Homogeneizar 100 gramos de priones infectados con el tejido cerebral en 900 ml de hielo frío buffer de homogeneización (HB, 1X PBS que contenía 320 mM de sacarosa, NaCl 150 mM EDTA y 4 mM) 1 min a máxima velocidad en un comercial de la licuadora, luego 2 minutos en hielo. Repita tres veces.
- Centrífuga homogeneizado durante 10 minutos a 3000 xg y 4 ° C. Retirar y guardar el sobrenadante en hielo. Volver a suspender el precipitado en 1 litro HB y repita los pasos 1.1 y 1.2.
- Sobrenadantes piscina y centrifugar durante 60 minutos a 100.000 xg, 0 ° C. Desechar el sobrenadante.
- Volver a suspender el precipitado en 100 ml de solución salina tamponada con Tris 1X (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM de NaCl y 1 mM EDTA) que contiene 2% de Triton X-100 (TBST). Estimar la concentración de proteínas por el Bradford o ensayo similar y ajuste a 5 mg / ml en TBST. Se enfría en hielo durante 30 minutos.
- Centrifugar durante 30 minutos a 100.000 xg, 0 ° C. Desechar el sobrenadante y lavar la pastilla con TBST 50 ml de 100 ml de TBS. Volver a suspender el precipitado en 100 ml de 1X PBS con 1% sarcosilo y cóctel de inhibidores de la proteasa y agitar durante 120 minutos a 37 ° C.
- Capa de muestra en 900 ml de sacarosa 320 mM y se centrifuga durante 60 minutos a 100.000 xg, 10 ° C. Desechar el sobrenadante y volver a suspender el precipitado en 10 ml de NaCl 2,3 M, 5% sarcosilo.
- Sonicar muestra de 5 x 40 segundos a máxima potencia un 70% en intervalos de 1 min en hielo.
- Alícuota de 1 ml de muestra en tubos eppendorf y centrifugar durante quince minutos a 13.000 xg, 4 º C. Lávese las pastillas dos veces con TBS y almacenar @ -70 ° C o conjugado con fluorocromo en el paso 1.9.
- Conjugado un tubo de agua purificada barras priones usando un vial de 649 DyLight fluorocromo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Intercambio DyLight buffer de etiquetado para PBS por diálisis o centrifugación a través de columnas de filtro. Almacenar en alícuotas de 20 l a -70 ° C, protegido de la luz hasta que esté listo para su uso.
2. La inoculación de priones y la recuperación de las células
En esta sección se incluye la inoculación intraperitoneal de priones y la recuperación de las células del peritoneo, ganglios linfáticos del mediastino y mesentéricos y el bazo.
- Diluir las barras fluorescentes priones 1:50 en PBS inmediatamente antes del uso. Scruff ratón por la piel del cuello dorsal con el pulgar y el dedo índice, gire suavemente el ratón para que la cara y frenar la cola con el dedo meñique. Supinación del ratón, elevando el torso traseras por encima de la cabeza y sosteniéndolo un poco al revés.
- Con una jeringa de insulina 30G, se inyectan 100 l de las barras de priones fluorescente 1 cm por fuera de la línea media y de 1-2 cm por delante de la articulación sacroilíaca. Insertar la aguja 1 cm a través de la piel dirigido a 45 ° en sentido medial. Utilice dilución 1:50 de perlas fluorescentes o solo PBS como control. Incubar los ratones de tiempo asignado antes del análisis.
- La eutanasia a los ratones de acuerdo con el cuidado de animales aprobada con el protocolo del comité. Inyectar 10 ml de PBS en la cavidad peritoneal con una jeringa de 12 mL y una aguja 25G. Agite suavemente la canal longitudinal durante un minuto. Recuperar la suspensión de células de peritoneo con la misma jeringa y una aguja 16G en un tubo cónico de 15 ml y reservar en el hielo, mientras que la disección de cadáveres continúa.
- Humedezca la parte ventral del cuerpo a fondo con etanol al 70%. Levante la piel en la línea media justo por debajo de las costillas con las pinzas y cortar una pequeña incisión a través de la piel con unas tijeras. A partir de allí, hacer una incisión de 3-5 cm de largo a través de la piel de en ambas direcciones a la cabeza y la cola, y después dos incisiones de 2 cm de la línea media lateral de cada lado. Pele y el pin de la piel para revelar las cavidades peritoneal y torácica. Corte cuidadosamente a través de las delgadas membranas que rodean el peritoneo transparente y reflejar el tórax para revelar el mediastino.
- Encontrar y eliminar 2-4 ganglios linfáticos del mediastino, ligeramente dorsal y lateral adyacente a la timo, medial adyacente a la arteria innominada, cerca de la cara ventral de la tráquea. Encontrar y eliminar un máximo de seis ganglios linfáticos mesentéricos, integrado en el tejido mesentérico blanca y suave que las anclas de los intestinos a la pared posterior del abdomen. Encontrar y extirpar el bazo, un órgano largo, de color rojo oscuro situada justo lateral de la línea media dorsal y en los intestinos en el lado izquierdo del abdomen. Ganglios linfáticos de la Reserva en 1 ml de medio RPMI 1640 en hielo hasta que la disección se ha completado.
- Macerar y pulse ganglios linfáticos a través de un colador de malla de 40 micras en 3 ml de RPMI en una placa Petri de plástico con el émbolo de una jeringa de 1 ml. Enjuague colador con un adicional de 2 ml de RPMI y la transferencia de la suspensión de 5 ml de células a un tubo cónico de 15 ml. Enjuague la placa de Petri con un adicional de 5 ml de RPMI y traslado al mismo tubo. Centrifugar 5 min a 250 xg, desechar el sobrenadante, resuspender el pellet de células en 1 ml de tampón FACS (PBS 1X, 1% albúmina de suero bovino y 10 mM EDTA) y transferir a un tubo Eppendorf de 1,5 ml.
El siguiente es un protocolo de tinción típica para la identificación de subgrupos de células inmunes con anticuerpos fluorescentes contra el bien caracterizado marcadores inmunológicos de superficie celular. Todos los anticuerpos se diluyeron en tampón FACS inmediatamente antes del uso.
- Recuento de células y alícuota de 10 6 células en tubos Eppendorf. Las células se centrifuga (véase 2.7) y lavar la pastilla 2 veces con 1 ml de tampón FACS.
- Se incuban las células 20 minutos sobre el hielo en 100 L de 2 ng / ml rata anti-ratón CD16/32 para bloquear los receptores Fc endógeno. Pellet y las células de lavado con tampón FACS.
- Añadir 100 ml de 1 ng / mL anticuerpos fluorescentes adecuadas (y) s para cada muestra e incubar en hielo durante una hora. Añadir 100 ml de solución tampón FACS sólo a las células control. Pellet y las células se lavan dos veces con tampón FACS.
- Vuelva a suspender las células en 1 ml de tampón ACK (150 mM NH 4 Cl, 1 mM KHCO3 y 0,1 mM EDTA) Incubar en hielo durante 1 min para lisar los glóbulos rojos. Pellet y las células de lavado con tampón FACS. Vuelva a suspender las células en 1 ml de tampón FACS.
- Recopilar datos a partir de células con un citómetro de flujo capaz de detectar multicolor y análisis, por lo general con láser 405, 488 y 633 nm de excitación y cinco a diez detectores de fluorescencia.
4. Los resultados representativos:
Nos purifica barras priones de crudo, los priones infectados homogenato de cerebro (Figura 1) solubilización detergente y ultracentrifugación de la E2 alces cerebro homogeneizado (calles 1 y 2) enriquecido para las barras de priones (comparar los carriles 1 y 3), que fue también la proteasa K resistentes (calle 4). Curiosamente, sin digerir purificada barras priones muestran un perfil muy similar a glicoformas homogeneizado digerido cerebro E2, lo que indica el enriquecimiento espectacular de los priones. Homogeneizado de idéntico tratamiento normal del cerebro, no produjo ningún PK-resistentes PrP C (carriles 5 y 6).
Análisis de citometría de flujo de las poblaciones de células específicas de demostrar que las células presentadoras de antígenos de origen hasta el peritoneo, por dos horas y mantener cuentas fluorescentes y las barras de priones, como se evidencia por fluorescencia aumentado dramáticamente en los controles de PBS inyectado (Figura 2). No hay células recolectadas del peritoneo de PBS controles tratados muestran fluorescencia por encima del fondo (Fig. 2A-G), mientras que las células de cordón (Fig. 2H-N) y priones (Figs. 2O-U)-inocularon ratones muestran fluorescencia significativo, especialmente en los monocitos (Fig. 2I y P), las células dendríticas (Fig. 2K y R) y los macrófagos (Fig. 2L y S), y algunos neutrófilos (Figura 2J y Q) y el menor número de células B (2T Figura). Bolas y teniendo priones monocitos, células dendríticas y los macrófagos también se encuentran en los ganglios linfáticos del mediastino dos horas después de la inoculación (Fig. 2AD y AK, AF y AG y AM y AN, respectivamente), mientras que pocos o ningún PrP CWD-teniendo neutrófilos , las células B o T se encontraron allí (Figs. 2AE y AL, AH y AG y AI y AP, respectivamente). No se detectaron granos o barras de priones en el bazo o los ganglios linfáticos mesentéricos (datos no mostrados). En su totalidad, estos datos demuestran que el tráfico de las células inmunes priones de manera muy similar a los antígenos de partículas.
| REACTIVO | Fluorocromo | Excitación láser (nm) | Pico de emisión (nm) |
| Barras de priones | DyLight 649 | 633 | 674 |
| 1 m cuentas | AlexaFluor 660 | 633 | 685 |
| Anticuerpos | |||
| CD11b | eFluor 450 | 405 | 450 |
| Ficoeritrina Cy7 | 488 | 760 | |
| CD11c | R-ficoeritrina | 488 | 575 |
| Ficoeritrina Cy7 | 488 | 760 | |
| Ly6C | Fluoroisothiocyante | 488 | 518 |
| Ly6G | R-ficoeritrina | 488 | 575 |
| CD21 | DyLight 488 | 488 | 518 |
| B220 | Aloficocianina-Cy7 | 633 | 785 |
| CD3 | R-ficoeritrina | 488 | 575 |
Figura 1. Purificación de las barras de priones de homogenato de cerebro infectado. Se utilizó un homogeneizado de cerebro crudo de 10% a partir de un ciervo CWD-infectados (E2, carriles 1 y 2) como material de partida desde el que purifica las barras agregados de priones (carriles 3 y 4). Crudo y los materiales purificados mostró resistencia característica de la proteasa K tratamiento (calles 1 - 4), mientras que homogenato de cerebro normal no (carriles 5 y 6). Marcadores de peso molecular se muestran en la Kd a la izquierda de la mancha. BH, homogeneizado de cerebro.
Figura 2. Análisis de citometría de flujo de tráfico de las células inmunes priones del peritoneo a los ganglios linfáticos del mediastino dos horas después de la inoculación. PBS (paneles AG y AB-V), perlas fluorescentes (HN y AC-AI) o las barras de priones (OU y AJ-AP) se se inyecta en el peritoneo de los ratones y las células recolectadas a partir del líquido peritoneal lavado (UA) o los ganglios linfáticos del mediastino (V-AP) dos horas después. Los gráficos en las células muestran primero la columna de los ratones tratados con PBS (paneles A y V), perlas fluorescentes (panel H y AC) y las barras de priones (paneles O y AJ). Células fluorescentes (puntos de color rojo o verde) y el total de células (puntos grises) se grafican para mostrar el tamaño relativo (de dispersión hacia adelante), granularidad (dispersión lateral) y la proporción del total de células vivas que presentan fluorescencia. Un número significativo de células características de los granulocitos retenido perlas fluorescentes y las barras. Las células se tiñeron también con anticuerpos contra inmune marcadores de superficie celular y cerrado para AVG-Ly6C + monocitos (paneles B, I, P, W, AD y AK), Ly6c-CD11c-CD11b + Ly6G + neutrófilos (C, J, Q, X, AE y AL), Ly6G-Ly6C-CD11b + CD11c + en las células dendríticas (D, K, R, Y, AF y AM), Ly6G-Ly6C-CD11c-CD11b + macrófagos, (E, L, S, Z AG, y AN), CD3 -B220 + CD21 + células B (F, M, T, AA, AH y AO) y CD21-B220-CD3 + células T (G, N, U, AB, AI y AP). Monocitos, células dendríticas y los macrófagos conservado perlas fluorescentes y las barras de priones en la cavidad peritoneal (Grupos I y P, K y R y L y S, respectivamente) y las transportó a los ganglios linfáticos del mediastino (paneles AD y AK, AF y AG y AM y AN, respectivamente), lo que demuestra la absorción similares y el tráfico de estas dos partículas. Neutrófilos retenido una cantidad significativa de granos (J) y menos barras (Q), pero no para entregarlos a los ganglios linfáticos (AE y AL). Las células B retenido y transportado unas varillas (T y AO), pero prácticamente no hay cuentas (M y H). Las células T de tráfico ni perlas, ni barras (N, U, AI y AP).
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Discussion
Aquí se demuestra un protocolo para el etiquetado y el seguimiento de los priones en vivo que facilita enormemente el control los primeros eventos en la infección por priones periféricos. Este protocolo mejora en gran medida en anteriores intentos de control de la utilización de priones in vitro e in vivo 9 3,12 por pre-etiquetado inóculo priones altamente enriquecido de forma inequívoca la diferencian de PrP C endógena. Debido a que los priones infecciosos y C PrP comparten la misma secuencia de aminoácidos primaria, la generación de anticuerpos específicos contra el prión ha sido problemático. Hemos llevado a cabo experimentos similares con ratones inyectados con PrP nulo PK-digeridos y metanol precipitó homogenato de cerebro crudo que el seguimiento a través DyLight 649-labelelled anticuerpos anti-PrP (nuestros datos no publicados). Estos experimentos produjeron resultados casi idénticos, como se muestra aquí, pero PrP ratones nulos no están disponibles comercialmente, no son susceptibles a la enfermedad priónica 19 y carecen de los receptores de buena fe sólo por priones conocidos, PrP C. Este protocolo permite el uso común de cepas de laboratorio del ratón que expresan PrP C endógena, lo que evita posibles problemas con ratones PrP nulos.
Los datos mostrados aquí indican que la captura de las células inmunes y los priones y el tráfico de perlas fluorescentes de manera similar, aunque las células B se identificaron como el tráfico de la primera, pero no el segundo. Esto corrobora anteriores estudios que implican a las células B como 6 traficantes de priones. Sin embargo, nuestra preparación altamente enriquecido priones probablemente contiene pequeñas cantidades de proteínas adicionales etiquetados, por lo que no se puede descartar la posibilidad de que las células inmunes del tráfico estas proteínas también. Si muy pequeñas cantidades de proteínas contaminantes alteran el tráfico de priones o imita la situación biológica real que queda por determinar.
Supervisión efectiva de las células inmunes trata de dos partículas diferentes sugiere además que este protocolo se puede adaptar a una amplia variedad de antígenos que pueden ser marcados y seguimiento, como los parásitos, bacterias, virus y proteínas.
Al realizar los pasos ultracentrifugación en este protocolo, los grandes volúmenes de muestra se puede alícuotas a los más pequeños de la centrifugación conveniente, siempre y cuando proporciones se mantienen constantes. Por ejemplo, en lugar de las capas de 100 ml de muestra en 900 ml de sacarosa, se podría capa de 10 ml en 90 ml en tubos separados, después centrifugar.
Elevar el ratón posteriormente durante las inoculaciones se mueve órganos peritoneal anterior, que minimizan el daño accidental con una aguja para ellos. Despacio y con cuidado inserta agujas en la inoculación de ratones y de inyección y aspiración de PBS del peritoneo para evitar la ruptura de la membrana delicada.
Cuando la disección de los ratones, tener cuidado de cortar solamente a través de la piel en la incisión inicial, dejando la membrana delgada que cubre el peritoneo y el mediastino intacta, para evitar el corte de los vasos sanguíneos y los órganos que pueden interferir con la identificación de los ganglios linfáticos y la recuperación.
Los ganglios linfáticos pueden ser difíciles de identificar inicialmente, a menudo el aspecto de tejido adiposo. Los ganglios linfáticos aparecen casi redondo, de color blanquecino a crema y más firme que el tejido adiposo. Estos son mucho más fáciles de identificar con la práctica. Ganglios linfáticos grupo de al menos dos ratones para recuperar las células suficiente para el análisis de citometría de flujo.
Para identificar simultáneamente varios marcadores de superficie celular, se recomienda el uso de anticuerpos fluorescentes en anticuerpos no marcados que requieren una secundaria fluorescentes anti-isotipo de anticuerpos para la detección, ya que el diseño experimental último requiere una cuidadosa selección de los anticuerpos generados a partir de múltiples especies y muchas más muestras de control adicionales.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a Steve Hansen McBryant y Jeff para ayudar con la ultracentrifugación y Kiser Patti para ayudar con el manejo del ratón. El Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas e Ictus de los Institutos Nacionales de Salud, otorgar 5R01NS056379-02 financiado este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CWD-infected elk brain | Private elk farm in Colorado | Use any non-human prion-infected brain | |
| Blender | Oster Professional Products | 6694-015 | Use any commercial blender |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | SS34 rotor | Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 50.2 Ti rotor | Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Sonicator | Misonix | MP4000X | Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power |
| DyLight antibody Labeling kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 53050 | |
| microcentrifuge | Eppendorf | 55430R | Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g |
| centrifugal filter columns | EMD Millipore | Microcon YM-100 | Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff |
| 8-40 week-old FVB mice | Charles River Laboratories | 207 | Use any inbred mouse strain |
| 1 μm red fluorescent beads | Phosphorex | 2307 | Use any fluorescent bead ≤ 10 μm |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon BD | 352340 | |
| fluorescent antibodies | BD Biosciences | Various | Use any fluorescent antibody appropriate for your application. |
| flow cytometer | Dako | CyanADP | Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection |
References
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