Summary
Existem obstáculos técnicos para a medição do fluxo de corrente através de canais iónicos simultaneamente, e mais tarde discernir o que parte da corrente transmembrana é devido a cada tipo de canal. Para atender a essa necessidade, este método apresenta uma forma para gerar a curva IV de tipos de canais individuais usando componentes de freqüência específica.
Abstract
INTRODUÇÃO: Atualmente, não existem métodos estabelecidos para medir tipos múltiplos canais de íon simultaneamente e decompor a corrente medida em porções atribuível a cada tipo de canal. Este estudo demonstra como espectroscopia de impedância pode ser usado para identificar freqüências específicas que altamente correlacionados com a amplitude estado estacionário corrente medida durante as experiências braçadeira de tensão. O método envolve a inserção de uma função de ruído contendo freqüências específicas para o protocolo de degrau de tensão. No trabalho apresentado, uma célula de modelo é usado para demonstrar que não altas correlações são introduzidas pelo circuito braçadeira de tensão, e também que a função do ruído em si não introduzir qualquer altas correlações quando não canais iônicos estão presentes. Esta validação é necessária antes que a técnica pode ser aplicada às preparações que contêm canais iônicos. O objetivo do protocolo apresentado é demonstrar como para caracterizar a resposta de freqüência de um único tipo de canal iônico para uma função de ruído. Uma vez freqüências específicas foram identificadas em um tipo de canal individual, eles podem ser usados para reproduzir o constante estado atual tensão curva (IV). Freqüências que altamente correlacionados com um tipo de canal e minimamente se correlacionam com os tipos de outro canal pode então ser usada para estimar a contribuição atual de tipos de canais múltiplos medidos simultaneamente.
MÉTODOS: medições braçadeira de tensão foram realizadas em uma célula modelo usando um protocolo passo padrão de tensão (-150 a +50 mV, 5mV passos). Funções de ruído contendo magnitudes iguais de 15/01 kHz (zero ao pico amplitudes: 50 ou 100mV) foram inseridos em cada etapa de tensão. A componente real da Fast Fourier Transform (FFT) do sinal de saída foi calculado com e sem ruído para cada potencial passo. A magnitude de cada freqüência como uma função de degrau de tensão foi correlacionada com a amplitude da corrente nas tensões correspondentes.
RESULTADOS E CONCLUSÕES: Na ausência de ruído (controle), magnitudes de todas as freqüências, exceto o componente DC correlacionados mal (| R | <0,5) com a curva IV, enquanto que o componente DC teve um coeficiente de correlação maior que 0,999 em todas as medições. A qualidade da correlação entre as freqüências individuais e da curva IV não se alterou quando uma função de ruído foi adicionada ao protocolo passo de tensão. Da mesma forma, aumentando a amplitude da função de ruído também não aumentou a correlação. Medidas de controle demonstram que o circuito clamp tensão por si só não causa qualquer freqüências acima de 0 Hz a alta correlação com a curva IV steady-state. Da mesma forma, as medições na presença de ruído a função demonstrar que a função de ruído não causa qualquer freqüências acima de 0 Hz para correlacionar com a curva IV steady-state quando não há canais de íons estão presentes. Com base nesta constatação, o método já pode ser aplicado a preparações contendo um tipo único canal de íons com a intenção de identificar as freqüências cujos amplitudes correlacionam especificamente com esse tipo de canal.
Protocol
1. Prepare Função Ruído e Sinal de Entrada
- Crie uma função de ruído contendo os componentes de freqüência desejada. Isto pode ser feito por descrever os componentes de freqüência desejada no domínio da freqüência e depois calcular o inverso Transformada Rápida de Fourier. Neste estudo, 1 - 15 kHz foi utilizado. Todas as transformadas de Fourier e Fourier inversa transforma descritos neste estudo foram calculados utilizando Matlab FFT e IFFT funções.
- Dimensionar a amplitude da função de ruído de forma adequada. Neste estudo, a função de ruído foi escalado de modo que o zero a amplitude de pico da função de ruído foi de 50 ou 100 mV.
- Criar um arquivo de estímulo através de métodos apropriados para a aquisição de software a ser utilizado. Para Clampex 8, primeiro criar um arquivo de texto com o cabeçalho apropriado. Abaixo do cabeçalho, introduza os incrementos de tempo para uma única varredura na primeira coluna. Os incrementos de tempo deveria ter o mesmo espaçamento temporal como o intervalo de amostragem utilizado nas medições. Para cada varredura no protocolo de degrau de tensão inserir as tensões exato desejado em cada passo de tempo. Isto deve incluir a função de ruído.
2. Realizar medições de tensão Grampo
- Criar um protocolo de medição dentro do software de aquisição que é compatível com o arquivo de estímulo gerado anteriormente. Em Clampex, há um menu que permite ao usuário associar um arquivo de estímulo com o protocolo atual.
- Anexar um modelo (ou biológicas) da célula para o equipamento de medição.
- Realizar o experimento, como previsto. Para efeitos de controlo, certifique-se de incluir medições periódicas que não incluem todas as funções de ruído.
3. Análise Experimental de pós
- Calcular a curva IV de uma gravação individual. Se a gravação é no estado de equilíbrio quando a função de ruído é aplicado, a curva IV pode ser criado usando uma porção de estado estacionário da gravação temporariamente fora do intervalo da função de ruído. Se a gravação não estava em estado estacionário, a função de ruído pode interferir com o cálculo da curva IV, então uma segunda gravação deve ser feita sem a função de ruído presente.
- Para cada etapa de tensão em uma gravação de calcular a Transformada Rápida de Fourier da parte da gravação em que a função do ruído foi inserido. Combine a transformada de Fourier para cada etapa de tensão em amxn matriz, onde m é o número de frequências na FFT, e n é o número de passos de tensão. Nesta configuração, cada linha da matriz representa a amplitude de uma única freqüência em todas as etapas de tensão no experimento.
- Para cada freqüência (ou seja, cada linha na matriz acima) correlacionar a linha com a curva IV gerada em 3.1 e gravar o coeficiente de correlação.
- Trama a correlação de frequência vs coeficiente de visualizar frequências que altamente correlacionados com a curva IV. Como o componente DC está contida dentro da primeira freqüência da FFT, o coeficiente de correlação para esta freqüência deve ser sempre> 0,99.
4. Resultados representativos:
As medições representativas braçadeira de tensão são apresentados para uma célula modelo sem (Figura 1A) e com (Figura 1B) um ruído função inserida no protocolo de degrau de tensão. A curva IV também foi calculado para a célula do modelo (Figura 1C). Para cada varredura, nas gravações da Figura 1, a FFT foi calculado sobre o período de tempo onde a função do ruído foi inserido (ver caixa vermelha nas figuras 1A, 1B). Figuras 2A e 2B mostram os FFTs calculado para as gravações mostrado na Figura 1A e 1B, respectivamente. Após a inspeção visual, o componente DC (destacado em vermelho) aparece para imitar a forma da curva IV. Sem a função de ruído, todas as frequências acima DC parecem ter amplitudes próximas de zero (Figura 2A). Quando a função de ruído é inserido, as freqüências entre 1 e 15 kHz têm amplitudes visualmente perceptível (Figura 2B). A Figura 3 mostra o resultado de correlacionar amplitudes de freqüência individual sobre a gama de medidas de tensão contra a curva IV. Figura 3A-C mostra os coeficientes de correlação quando o experimento foi feito sob condições de controle (sem função de ruído) e com amplitudes de ruído de 50 e 100 mV, respectivamente. Observe em todos os casos, o componente DC parece correlacionar quase perfeitamente com a curva IV. De fato, para todas as gravações, o coeficiente de correlação para esta freqüência foi maior que 0,99 (R = 0,9996 ± 1E-5, média ± desvio padrão). Quando olhamos para a Figura 3A (condições de controle), não existem frequências para além da componente DC, cuja amplitude significativamente correlaciona-se com a curva IV. Especificamente, nenhuma dessas freqüências têm coeficientes de correlação maior que 0,5. Após a inserção dos mais baixos da função da amplitude de ruído (50 mV), estas mesmas freqüências ainda tinha coeficientes de correlação inferior a 0,5. Os coeficientes de correlação para ofreqüências si só também não se tornou maior do que 0,5 quando a amplitude do ruído foi aumentada para 100 mV.
. Figura 1 Modelo Recordings Cell: gravações braçadeira de tensão são apresentados para uma célula de modelo sem (1A) e com (1B) um ruído função incluída no protocolo de degrau de tensão. Para o primeiro eo último 20 ms de cada varredura, o potencial foi mantido em potencial exploração (0 mV). Cada passo de tensão foi de 80 ms de comprimento, ea função do ruído foi inserido 40 ms após o início da etapa. A função do ruído teve uma duração de 30 ms e continha freqüências entre 1 e 15 kHz. Tensão foi intensificada fro, -150 a +50 mV em incrementos de 5 mV. Uma curva IV para a célula modelo também é mostrado (1C). Para fazer as gravações mais fáceis de ler, apenas varrer toda quinta foi incluída na 1A e 1B, mas todas as varreduras foram incluídos no 1C.
Figura 2 FFT de Gravações:. A FFT foi calculado para a parcela ms 30 de cada varredura, onde a função de ruído é para ser inserido (a área delimitada pela caixa vermelha nas figuras 1A, 1B). Figuras 2A e 2B mostram os FFTs calculados sem e com a função do ruído, respectivamente. Mais uma vez, para maior clareza, apenas os FFT de cada quinta varredura está incluído na figura, mas todos varre foram usados nos cálculos futuros.
. Figura 3 Correlações Frequency IV: Os resultados das correlações entre a curva IV de uma gravação ea amplitude de freqüências individuais em toda a gama de medidas de tensão é mostrado. Figuras 1A - 1C mostram o coeficiente de correlação para freqüências 0-20 kHz em condições de controle, e na presença de 50 ou 100 funções ruído mV, respectivamente.
Figura 4 Re-Criação da Curva IV:. A curva IV para a célula do modelo (igual à Figura 1C) ea magnitude de duas freqüências foram sobrepostos. A primeira frequência foi o componente DC (R = 0,995), eo segundo foi uma freqüência escolhidos aleatoriamente com baixa correlação (R = 0,3212). As amplitudes de freqüência foram dimensionadas para aproximadamente a mesma amplitude que a curva IV.
Discussion
Existem obstáculos técnicos que atualmente impedem os investigadores de medir tipos múltiplos canais de íon simultaneamente com a intenção de posteriormente determinar a quantidade de corrente deve ser atribuída a cada tipo de canal. Devido a esta limitação, canais iônicos são geralmente estudadas individualmente usando técnicas como tensão, corrente, acção e clamp potencial. Para um estudo tipos de canais individuais, sistemas de expressão heteróloga são usadas frequentemente. 2 Ao trabalhar com células isoladas de tecido, tais como cardiomiócitos , outros meios devem ser usados para bloquear os canais de íons diferentes. Por exemplo, os canais de sódio podem ser inativados por uma rampa de tensão lenta despolarizantes, 3 canais de potássio para dentro de retificação pode ser bloqueado com BaCl2 extracelular, 4 e canais de cálcio pode ser bloqueado utilizando verapamil 5.
Um método utilizado que parcialmente supera essa limitação é medir o fluxo de corrente através de dois tipos de canais em simultâneo, em seguida, repita a medição após seletivamente bloqueando um tipo de canal com um agente apropriado. Subtração das duas medições pode então ser usada para estimar a quantidade de atribuíveis atual para o tipo de canal que foi bloqueado. 6 No entanto, existem duas grandes limitações a esta técnica. Primeiro, agentes químicos não foram identificados que podem bloquear seletivamente cada canal iônico, e algumas drogas amplamente utilizadas têm interacções não específicas com os tipos de outro canal. 5,7 segundo lugar, não pode ser determinada a partir desta técnica se um canal é modulado por um outro canal. Por exemplo, a expressão heterogênea de Nav 1.5 e Kir 2.1 foi mostrado na ventrículos cobaia, e tem sido sugerido que existe uma relação sinérgica entre os dois canais, tais que a maior Kir 2,1 expressão no ventrículo direito deprime velocidade de condução. 8 Atualmente , isto não pode ser verificada.
Neste estudo, sugerimos que a espectroscopia de impedância pode ser uma ferramenta útil para estudar os tipos de iões de vários canais medidos simultaneamente. Embora o método apresentado nunca foi usado para discernir as correntes a partir de dois tipos de canais medidos simultaneamente, espectroscopia de impedância tem sido usado para estudar uma série de outros aspectos da função do canal de íon. Goodman e Arte mostrou tartaruga usando células ciliadas auditivas que os protocolos de pinça de corrente pode ser modificado para sintonizar uma célula para diferentes freqüências, e as oscilações no potencial transmembrana é devido a uma interação entre um retificador interno da K + e um canal de Ca 2 + canal. 9 Han e Frazier demonstrado que a impedância pode ser medida em uma única célula em uma ampla faixa de freqüências (100 Hz a 5 MHz), eo aumento da impedância observada quando K + ou Ca 2 + canais foram bloqueados poderia ser um meio simples de detectar bloco do canal em telas de drogas de alto throughput. 10 Hayashi e Fishman usaram condutância complexos para estudar propriedades cinéticas de um retificador interno da K + canal 11. Outros grupos têm introduzido uma única freqüência no protocolo de fixação de voltagem de tipos de canais diferentes e mostraram que o resposta de freqüência observada concordou com a resposta esperada para algumas freqüências, mas outros não. 12,13 Millonas Hanck e sugeriu a razão algumas freqüências não produzir a resposta esperada é a presença de constantes de taxa múltipla no modelo de Markov. 12 Estudos como estes, bem como outros, têm demonstrado que existem casos em que as correntes iónicas medidas de canais iônicos, enquanto usando espectroscopia de impedância não concordar com a resposta de freqüência teórica. Esta não é uma preocupação neste estudo porque o objetivo do método neste estudo é identificar as freqüências que se correlacionam com a amplitude da corrente independente dos pressupostos subjacentes do circuito elétrico da membrana. Furtheremore, a amplitude da corrente é calculado a partir de partes das gravações que não têm qualquer função do ruído inserido dentro deles. Uma série de outros estudos também apresentam modelos de canais iônicos numerosas exibindo numerosos estados condução e não condução, todos com suas constantes próprio ritmo. 14,15,16 Thompson et al mostraram que o filtro de seletividade do canal KcsA tem diferentes sítios de ligação para o Na +, Li + e K +, e os custos energéticos de que se deslocam de um sítio de ligação para outro como se move de íons através do filtro de seletividade é o que faz o canal preferencialmente conduta K + íons através de seu poros. 17 Neste trabalho, inserido uma ampla de freqüências (função de ruído) em um protocolo de degrau de tensão e olhou para as frequências cuja amplitude altamente correlacionados com a amplitude total de corrente. Desde forte evidência foi apresentada sugerindo constantes de taxa múltipla desempenhar um papel na condução de íons através different canais, a introdução das freqüências associadas com estas constantes de velocidade podem causar certas freqüências de vibração ou altamente correlacionados com a amplitude da corrente, que não teria de outra forma. A técnica demonstrada neste estudo é realizado em uma célula de modelo, que é um circuito paralelo RC que é normalmente usado para testar o circuito braçadeira de tensão e equipamento de aquisição. Não se espera que qualquer freqüências além DC teria correlação com a magnitude atual, e isso é mostrado em nossos dados. Mostramos também que além da função de ruído não causa nenhum freqüências para altamente correlacionados com a amplitude da corrente. Esses dois achados são fundamentais porque mostram que o equipamento de medição e função de ruído não por si só causa qualquer freqüências para correlacionar com a amplitude atual. Quando estudos futuros fazer medições utilizando membranas contendo canais iônicos, espera-se que, dependendo do canal utilizado, as freqüências que correspondem às constantes de velocidade no filtro de seletividade ou, possivelmente, os poros irão influenciar a resposta de freqüência do canal e do afeto que têm freqüências altas ou baixa correlação com a amplitude atual.
Uma vez que este método é uma nova técnica para estudar canais iônicos, há uma série de direções estudos futuros poderia seguir. Primeiro, a técnica deve ser usada para caracterizar a resposta de freqüência de canais específicos isolados. Trabalho adicional também precisa ser feito para calibrar as amplitudes de freqüência para as amplitudes atual. Uma vez que múltiplos canais são caracterizados individualmente, tipos de canais múltiplos devem ser medidos simultaneamente. A técnica também poderia ser adaptado para uso em grampo do potencial de ação, pinça de corrente, e estudos de estimulação de campo. Embora esta seja uma nova técnica, ele mostra o que pode ser uma forma poderosa de fazer medições eletrofisiológicas que anteriormente não eram possíveis e fornecer valiosas novos insights sobre o papel fisiológico dos canais de íons.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde número de concessão R21-HL094828-01 atribuído ao Dr. Poelzing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matlab | Mathworks | n/a | Natick, MA |
| Clampex 8 | Molecular Devices | Clampex 8 | Sunnyvale, CA |
| Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200 | Sunnyvale, CA |
| Headstage | Molecular Devices | CV202 | Sunnyvale, CA |
| 16-Bit Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1322A | Sunnyvale, CA |
| Model Cell | Molecular Devices | Patch 1 Model Cell | Sunnyvale, CA |
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