Summary
هذا المقال يقدم وصفا لكيفية تشريح وسجل من إعداد الشبكية معزولة في الماوس. على وجه الخصوص ، ونحن تصف كيفية تسجيل الاستجابات الضوء من السكان خلية عقدية fluorescently المسمى لاحقا ، وتحديد وتحليل مورفولوجيا والخمسين.
Abstract
الخطوات الأولى في الرؤية الفقارية تأخذ مكان عند الضوء يحفز المستقبلات الضوئية قضيب ومخروط في شبكية العين 1. ثم يتم فصل هذه المعلومات في ما يعرف المسارات وإيقاف تشغيله. المعلومات مبصرات إشارة الضوء على الخلايا القطبين (BCS) ، والذي يزيل الاستقطاب استجابة للزيادات (في BCS) أو النقصان (إيقاف BCS) في شدة الضوء. هو الحفاظ على هذا الفصل من المعلومات الضوء على مستوى الخلايا الشبكية العقدة (RGCs) ، والتي التشعبات تقسيمها في sublamina إما الخروج من طبقة ضفيري الداخلية (IPL) ، حيث يتلقون مدخلات استثارية مباشرة من BCS معطلة ، أو تقسيمها في في يوم من sublamina IPL ، حيث يتلقون مدخلات استثارية مباشرة من على BCS. هذا الفصل هو الحفاظ على معلومات بشأن الزيادة أو النقصان في الإضاءة (وعلى الممرات وخارج) ، وأشار إلى الدماغ بشكل متواز.
وRGCs هي الخلايا الناتج من شبكية العين ، وبالتالي فهي خلية هامة لدراسة من أجل فهم الكيفية التي اشارت المعلومات الضوء على نواة البصرية في الدماغ. وقد أدت التطورات في مجال علم الوراثة الماوس على مدى العقود الأخيرة في مجموعة متنوعة من خطوط الماوس مراسل فلوري حيث وصفت السكان RGC محددة مع بروتين فلوري للسماح لتحديد الأنواع الفرعية RGC 2 3 4 ومحددة تستهدف لتسجيل الكهربية. هنا ، فإننا نقدم وسيلة لتسجيل ردود الضوء من خلايا العقدة fluorescently المسمى في إعداد سليمة ، الشبكية معزولة. هذا التحضير معزولة الشبكية يسمح للتسجيلات RGCs من حيث جذع شجيري سليمة والحفاظ على المدخلات عبر جذع شجيري RGC بأكمله. هذا الأسلوب هو المعمول عبر مجموعة متنوعة من أنماط فرعية خلية العقدة ، وهي قابلة للطائفة واسعة من التقنيات وحيدة الخلية الفيزيولوجي.
Protocol
بيان استخدام الحيوان : لم يهتم للحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المبينة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ، وذلك باستخدام البروتوكولات التي وافقت عليها جامعة مينيسوتا رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام.
1) إعداد حلول
- قبل إجراء تسجيل الكهربية ، والحلول بين الخلايا ، خارج الخلية ، والانزيم ابد أن نكون مستعدين.
- خارج الخلية الحل : مزيج زجاجة واحدة (8.8g) من مسحوق المتوسطة أميس '(سيغما) مع 1 لتر من H 2 O و 1.9 غرام من بيكربونات الصوديوم (23 ملم). في جميع نقاط مشبعة حل خارج الخلية مع O 95 ٪ 05/02 ٪ خليط أكسيد الكربون غاز 2. نقل 200 مل إلى الدورق لتخزين شبكية العين. وضع حل المتبقية في حاوية نظام لنضح نضح الجاذبية مرة واحدة هي التي شنت الشبكية.
- جواني الحل : يجب أن يكون الحل بين الخلايا التي سبق وaliquoted ثم إلى 500-1000 aliquots ميكرولتر وتخزينها على -20 درجة مئوية. حل الخلايا تختلف تبعا للتجربة الحاجة ، للتسجيلات المشبك الحالي هو موضح هنا نستخدم (مم) : 125 K - غلوكونات ، 2 CaCl 2 ، 2 MgCl 2 ، 10 EGTA ، 10 HEPES ، 2 نا 2 - ATP ، 0.5 مم NaGTP الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 مع KOH 5. يمكن يمكن إضافة التتبع الفلورسنت مثل 10 ميكرومتر Alexafluor - 594 هيدرازيد (Invitrogen) لتصور التشعبات خلال التجربة ، وneurobiotin (0.3 ٪) أن تدرج أيضا لتحليل تشريح الخلية التالية تسجيل. عندما تكون جاهزا لتسجيل ، أذاب حل داخل الخلايا.
- حل انزيم : امزج بين 10000 وحدات كولاجيناز (المواد الكيميائية ورثينجتون) مع هيالورونيداز ملغ 83 (كيماويات رثينجتون) إلى 4.150 مل من حل خارج الخلية. متجر في 50 ميكرولتر aliquots في -20 درجة مئوية. ويمكن استخدام Aliquots لعدة أسابيع. عندما تصبح مستعدة لعلاج شبكية العين ، في تمييع قسامة 500 ميكرولتر من محلول فقاعات خارج الخلية.
- الحل التخزين المؤقت الفوسفات (PBS) : في 800 مل من H 2 O إضافة 8 غرام من كلوريد الصوديوم ، 0.2 غرام من بوكل ، 1.4 غرام من الصوديوم 2 هبو 4 و 0.24 غرام من KH 2 PO 4. إحضار الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم. ضبط مستوى الصوت إلى 1 L.
- 0.2 العازلة الفوسفات M : في 800 مل من H 2 O إضافة 21.8 غرام من نا 2 هبو 4 و 6.4 غرام من ناه 2 ص 4. يصل حجم إلى 1 L.
- 4 ٪ لامتصاص العرق الحل : الحرارة 50ml H 2 O إلى 60 درجة مئوية. إضافة بارافورمالدهيد 4G ، وإثارة لعدة دقائق. إضافة بضع قطرات من هيدروكسيد الصوديوم 1M (حوالي 5 نقاط) ، والحفاظ على اثارة حتى حل واضح. إضافة 50 مل M الفوسفات 0.2 العازلة في الدورق. التحقق من الرقم الهيدروجيني باستخدام شرائح الأس الهيدروجيني (~ 7.4). تصفية وباردة.
- حظر حل (10 ٪ مصل الماعز ، و 0.5 ٪ TritonX100) : في 1.8 مل من 0.2 مل PBS إضافة للمصل الماعز و 10 ميكرولتر تريتون X - 100. TritonX - 100 يعمل على permeabilise الأنسجة.
- Streptavidin الحل (5 ٪ مصل الماعز ، و 0.5 ٪ TritonX100 ، 1:500 Streptavidin 594) : في 1.9 مل من برنامج تلفزيوني إضافة 0.1 مل من مصل الماعز ، و 10 ميكرولتر تريتون X - 100 و 4 ميكرولتر من Streptavidin 594.
2) عزل الشبكية من الماوس
أدوات تشريح المطلوبة : 1 # 2 الملقط ، 2 # 5 الملقط ، مقص العيون
- CO الموت ببطء الماوس وفقا لبروتوكولات وافق ، في هذه الحالة 2 اختناق واستأصل مقلة العين عن طريق إدراج بلطف زاوية مقدارها # 2 ملقط وراء العين وانتشال مقلة العين.
- مكان مقلة العين في طبق بتري 35 ملم مع حل خارج الخلية. قطع العصب البصري والعضلات خارج المقلة أي مرفق أو النسيج الضام باستخدام مقص العيون. قطع القرنية مع مقص العيون وسحب العدسة باستخدام الملقط # 5. المسيل للدموع الصلبة باستخدام زوج من ملقط 5 # واستخدام ملقط لقطع العصب البصري حيث شبكية العين والصلبة يجتمع في القرص البصري. بلطف قشر شبكية العين بعيدا عن فنجان العين. نصيحة : هل كل خطوة على كل من شبكية العين قبل ان ينتقل الى الخطوة التالية للتقليل من الوقت.
- استخدام الملقط لإزالة الزجاجي تعلق على شبكية العين. يمكن تنفيذ ذلك من خلال "الاستيلاء" على زجاجي شفاف فوق الشبكية بالملقط. والزجاجي ، إذا نجحت في إزالة ، يجب أن تكون مرئية ومادة واضحة وهلامي على ملقط. نصيحة : تشريح شبكية العين في الشوط التالي لإزالة الجسم الزجاجي وزيادة كمية الأنسجة القابلة للاستخدام وجعل التركيب في غرفة أسهل.
- الحفاظ على شبكية العين في حل خارج الخلية الاوكسيجين في درجة حرارة الغرفة في بيئة مظلمة مع الحد الأدنى من الإضاءة المحيطة حتى تكون جاهزة للهضم. ويمكن تخزين شبكية العين في هذا الطريق لساعات 6 ~.
3) علاج شبكية العين مع خليط الانزيم والمتصاعد في غرفة تسجيل
- تمييع an قسامة من كولاجيناز / هيالورونيداز في حل خارج الخلية 500 ميكرولتر ، حل مكان في صحن بيتري 35 ملم ونقل الشبكية.
- الحفاظ على شبكية العين وتحتويجي طبق بتري ، وغطت في الظلام ، في O2 95 ٪ / 5 ٪ CO 2 البيئة لمدة 15 دقيقة مع الإثارة لطيف. هذه الخطوة يساعد في هضم أي الزجاجي المتبقية ، ويتيح سهولة الوصول إلى طبقة الخلايا العقدية. نصيحة : لشبكية العين من الحيوانات الأصغر سنا أقل زجاجي أو إذا لوحظت آثار ضارة ، ويمكن تقصير الوقت لمدة 5 دقائق ~.
- إزالة من شبكية العين تحتوي على انزيم المتوسطة وغسل نطاق واسع في حل خارج الخلية
- نقل الشبكية إلى غرفة تسجيل 6 مع طبقة مبصرة أسفل. ذبالة بعيدا السوائل المتبقية مع ماصة إما أو الأنسجة وطرح جوانب الشبكية لشد الأنسجة الحرص على اتصال فقط على حواف شبكية العين ، لا سيما تجنب الاتصال مع طبقة الخلايا العقدية. وضع خاتم البلاتين مع شبكة من النايلون على شبكية العين لترسيخ النسيج والتعبئة على الفور غرفة مع حل خارج الخلية.
- جبل غرفة تسجيل على خشبة المسرح المجهر ، نعلق أنبوب لشفط نضح الجاذبية والفراغ ونعلق الأسلاك الارض.
4) الترجمة من خلايا العقدة EGFP التعبير عن الضوء والتحفيز
- يروي في شبكية العين عن طريق الجاذبية مع حل خارج الخلية بمعدلات مل / دقيقة أو أسرع 1. نصيحة : إذا كان معدل نضح بطيئة جدا ، والأنسجة لن يكون كافيا والاوكسيجين قد تعطلت إشارات متشابك.
- ملء ماصة تسجيل مع حل داخل وأدخله حامل ماصة. نصيحة : الماصات مع المقاومة في حدود 3 إلى 5MΩ إعطاء أفضل النتائج.
- تصور في شبكية العين تحت الحمراء البصريات تدخل الفرق (DIC) في المقابل التكبير المنخفض (الهدف 10X ، NA 0.3) لتحديد مكان تسجيل ماصة. وتستخدم الأشعة تحت الحمراء للتقليل من التعرض للضوء المرئي الشبكية والحد من التكيف مع الضوء. الانتقال الى أعلى التكبير (الهدف 40X ، NA 0.8) وتقديمهم الى القطب عرض فقط فوق الأنسجة.
- في التكبير عالية (الهدف 40X) ، مع تسليط الضوء على شبكية العين epifluorescence (480 نانومتر لEGFP) وحدد خلية العقدة الفلورسنت وعلامة على جهاز الكمبيوتر باستخدام الشريط (الشكل 1A).
- مدينة دبي للإنترنت تحت الإضاءة والأشعة تحت الحمراء ، موقف القطب تسجيل بالقرب من الخلية المستهدفة العقدة (الشكل 1A). تغطي منطقة نظيفة على الفور خلية من خلال تطبيق الضغط الايجابي لطيف لتسجيل الكهربائي عبر حقنة بلاستيكية متصلة 12cc حامل ماصة مع أنابيب البولي ايثيلين. على مكبر للصوت ، أي إزاحة الصفر الجهد. القطب المكان المحدد على الخلية العقدة حتى الدمل يظهر على سطح الخلية.
- مع مكبر للصوت في وضع المشبك الجهد ، وتطبيق نبض اختبار ومراقبة المارة الحالي من خلال ماصة. الضغط السلبي لإنشاء ختم بين القطب والخلية. الافراج عن الضغط السلبي عندما تبدأ الخلية لختم والانتظار حتى عقد الراهنة تعد مؤشرا لابرام الكهربائية GΩ بين غشاء الخلية وماصة. نبضات من تطبيق لطيف الضغط السلبي حتى العابرين بالسعة تظهر ثم الإفراج عن أي تطبيق الضغط. نصيحة : إذا كان وصول (سلسلة) مقاومة عالية (> 30MΩ) ، وغالبا ما يكون ذلك عن طريق تحسينها إضافية ، والبقول ، لطيف جدا من الضغط السلبي.
- مرة واحدة وقد تم التوصل إلى ختم مستقرة تطبيق نبضة من الضغط السلبي. بعد الحصول على وضع كامل الخلية ، والسماح للتكيف مع خلية مظلمة لمدة 5 دقائق. سجل ، في الاستجابة الحالية المشبك ، ووضع لكامل الحقل ، والتحفيز الضوء الأبيض (1B الشكل).
- بعد التسجيل ، وسوف Alexafluor - 594 قد تنتشر إلى التشعبات. يمكن أن يكون التتبع في إطار تصور epifluorescence في 594 نانومتر ، ويستخدم لتحديد ما إذا كانت خلية العقدة معطلة ، خارج ، أو ثنائية طبقية عن طريق التبديل بين البصريات الأشعة تحت الحمراء ومدينة دبي للإنترنت epifluorescence 5.
- إذا تم تضمين neurobiotin ماصة في شبكية العين وسوف تتم معالجتها لالمناعية ، ثم يجب أن تكون ماصة تراجع بلطف لتوفير الحد الأدنى من اضطراب الغشاء.
5) تحليل تشريح خلايا العقدة المسجلة
ملء مع neurobiotin يسمح للمزيد من التحليل الصرفي مفصلة للخلايا العقدة التالية تسجيل. نصيحة : إذا كانت هناك رغبة الارتباطات المحددة بين خلية ومورفولوجيا العقدة سجلت تفصيلا ، فإنه قد يكون من الأفضل لتسجيل وملء واحدة فقط RGC في التحضير.
- إذا تم تضمين neurobiotin في حل الخلايا الشبكية ثم ضع في حل بارافورمالدهيد والإصلاح بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- شطف في برنامج تلفزيوني ، على الأقل 2 ساعة ، لا يقل عن 6 تغييرات. نقل إلى لوحة شبكية العين تحتوي على حل حظر. إجازة في عرقلة الحل لمدة 2 ساعة ، في درجة حرارة الغرفة شاكر.
- استبدال حل حجب مع الحل Streptavidin. احتضان 2 يوما في 4 درجات مئوية على شاكر. شطف شبكية العين في برنامج تلفزيوني ، يشطف 6 ، 20 دقيقة لكل منهما.
- تركيب شبكية العين مع Vectashield في شريحة زجاجية.يجب أن توضع في الشبكية مع خلايا العقدة حتى. إجراء الفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 1C).
ممثل النتائج
إذا الشبكية سليمة وتشريح كان ناجحا ، يجب أن يكون الفرد خلايا العقدة مرئية تحت التكبير في مدينة دبي للإنترنت عالية (الشكل 1A). وشبكية العين وغير صحية كبيرة ، نوى حبيبات ، وينبغي أن يكون التخلص منها. وإذا كانت الاستجابة متشابك من خلية العقدة نظرا سليمة ، ومن ثم ينبغي الخلية الرد في ضوء ظهور أو الإزاحة مع إمكانات العمل ، وفي حالة وجود خلايا العقدة في جوهرها ، حساس (1B الشكل) ، والاستقطاب المستمر.
الشكل 1. التوطين ، وتسجيل ، وتلطيخ لخلية العقدة الشبكية fluorescently المسمى : (أ) تصور GFP RGC الايجابية في ظل الإضاءة epifluorescent في التكبير 40X (اللوحة اليسرى) وتحت إنارة مدينة دبي للإنترنت (اللوحة اليمنى). (ب) الاستجابة للضوء متشابك من M2 حساس جوهريا خلية العقدة الشبكية المسجلة في خلية كاملة النمط الحالي من المشبك RGC fluorescently المسمى. (C) M1 حساس جوهريا خلية العقدة الشبكية التي تم تحديدها تحت epifluorescence ، تستهدف خلية كاملة من التسجيل ، مليئة neurobiotin ، ومعالجتها بعد ذلك لالمناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه التقنية قابلة للتطبيق على أي تسجيلات العقدة خلايا شبكية من شبكية العين معزولة. وإن كان في خط الماوس المستخدمة أعلاه حساس في جوهرها ، معربا عن melanopsin - RGCs وصفت مع EGFP 2 ، 5 ، هذا البروتوكول غير قابل للنقل بسهولة إلى خطوط أخرى RGC fluorescently المسمى أو يمكن تعميمها على سجل من RGCs أفلح كذلك. هذا الأسلوب هو قيمة خاصة لأنه يتم ترك جذع شجيري كل RGC والخلايا العصبية في كل مدخلات سليمة تماما. ويمكن بسهولة أن يؤديها التسجيلات في أوضاع الراهنة أو المشبك الجهد ، الخلية المرفقة أو فضفاضة التصحيح التكوين ، أو حتى يمكن أن تستخدم لتصحيح الأنوية ، داخل أو خارج تكوينات التصحيح التدريجي من أغشية الخلايا الشبكية العقدة. ويمكن تكييف هذه التقنية لتسجيل بسهولة من خلايا fluorescently المسمى عديم الاستطالات المشردين (7) أو حتى غير المشردين عديم الاستطالات 8 خلايا واحد الحد من استخدام مضان في توطين خلايا العقدة هي التي يجب أن تكون دائما في شبكية العين تعرضها للضوء لتحديد الهوية قبل تسجيل RGC . وبالتالي ، فإن هذا قد لا تكون مناسبة التحضير لتسجيل ردود بوساطة قضيب ما لم يتم تضمين حامل اللون الخارجية في حل حمام و / أو يتم ترك فنجان العين والشبكية ظهارة الصباغية التي تعلق على شبكية العين 9. إذا كان الهدف هو لتسجيل ردود الضوء بوساطة قضيب ، ثم يجب اتخاذ احتياطات خاصة لتجنب التبييض من رودوبسين صباغ متبدل بالضوء. يجب إجراء التشريح في ظل ظروف ضوء الأشعة تحت الحمراء (أي 10).
لإجراء تشريح ناجحة ، فمن المهم أن يتم اجراء تشريح في أسرع وقت ممكن. فمن الأهمية بمكان أن تتم إزالة بنجاح الزجاجي مع ملقط. إذا كان ما تبقى هو زجاجي ، ثم يلي انزيم الهضم تكون مشمولة في الشبكية مع فيلم لزج مما يجعل من الصعب ترميم ناجحة. للحصول على تسجيلات جيدة ، فمن المهم بصورة خاصة أن شبكية العين بشكل جيد التهوية ، وهذا يعني أن يتم حل خارج الخلية انفجر بقوة ومعدل تدفق عال بما فيه الكفاية من خلال الغرفة. من المهم أيضا للحد من التعرض للضوء مرة واحدة من النسيج معزولة في شبكية العين من فنجان العين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة R01EY012949 ، R21EY018885 ، T32 EY0707133. نشكر داروين هانغ على مساعدته التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ames’ Medium | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| AlexaFluor 594 Hydrazyde | Invitrogen | A10442 | |
| Neurobiotin | Vector Laboratories | SP1120 | |
| Electrodes | Sutter Instrument Co. | BF120-69-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Ophthalmologic Scissor | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Streptavidin 594 | Invitrogen | S32356 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-001 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
References
- Wassle, H.
- Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development. J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).
- Huberman, A. D. Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion. Neuron. 62, 327-334 (2009).
- Siegert, S. Genetic address book for retinal cell types. Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 29, 476-482 (2009).
- Newman, E. A., Bartosch, R. An eyecup preparation for the rat and mouse. J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).
- Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines. Neuroscience. 160, 126-139 (2009).
- Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision. J Neurosci. 27, 692-699 (2007).
- Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination. J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).
- Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina. Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).
