Summary
この記事では、細かく分析し、マウスで分離された網膜の準備から記録する方法の説明を提供します。特に、我々は、蛍光標識神経節細胞集団からの光の応答を記録し、続いてその形態を特定し分析する方法について説明します。
Abstract
光が網膜1のロッドと錐体光受容体を刺激するときに脊椎動物のビジョンの最初の手順が行われます。その後、この情報は、ONとOFF経路として知られているものに分けています。光強度の増大（BCSオン）または減少（BCSオフ）に反応して脱分極、双極細胞に光受容体の信号光情報（BCS）、。光情報のこの分離は、彼らがオフのBCから直接興奮性入力を受け取る内網状層（IPL）のオフsublamina、のいずれかで層化樹状突起を持つ網膜神経節細胞（RGCs）、のレベルで維持、またはに階層化され彼らはBCの上から直接興奮性入力を受け取るIPLの上sublamina、。照明の増減に関する情報（経路オンとオフ）のこの分離は、保存と並行して脳に通知されます。
RGCsは、網膜の出力細胞であるため、光情報は脳内の視覚的な核に通知される方法を理解するために勉強する重要な細胞です。ここ数十年にわたって、マウス遺伝学の進歩により、特定のRGC集団が電気生理学的記録のために標的とRGCサブタイプ2 3 4と特定の識別を可能にするために蛍光タンパク質で標識されている蛍光レポーターマウス系統の様々をもたらしました。ここで、我々はそのまま、孤立した網膜準備で蛍光標識神経節細胞からの光の応答を記録するための手法を提案する。この孤立した網膜の準備は、樹状アーバが損なわれていないと全体のRGC樹あずまやでの入力が保たれているRGCsから録音することができます。このメソッドは、神経節細胞のサブタイプの多様にわたって適用可能であり、単一細胞生理学的手法を用いての多種多様に従順です。
Protocol
動物の使用に関する声明：動物は、ミネソタ動物実験の大学および使用委員会によって承認されたプロトコルを使用して、 実験動物の管理と使用に関するガイドに記載されているガイドラインに準拠して世話をした。
1）溶液の調製は、
- 電気生理学的細胞内記録、、外、及び酵素のソリューションを実行する前に準備する必要があります。
- 細胞外溶液：H 2 Oと炭酸水素ナトリウム1.9gの（23 mM）を1リットルと粉末エイムズ"メディアのミックスを一瓶（8.8グラム）（シグマ）。すべての点で、細胞外溶液を95％O 2 / 5％CO 2混合ガスで飽和されている。網膜のストレージのためのビーカーに200 mlを入れる。網膜がマウントされると、重力の灌流のための灌流システムコンテナ内の残りの溶液を置きます。
- 細胞内液：細胞内液は、以前行われ、その後、500から1000μLアリコートに分注し、-20℃で保存されているはず125 K -グルコン酸、2のCaCl 2、2のMgCl 2、10 EGTA、10 HEPES、2ナトリウム2 - ATP、0.5mMのNaGTP：細胞内液は、我々が使用するここに示されている現在のクランプ記録（mMで）のために、必要な実験によって異なりますKOH 5の7.2にpHを。このような10μMAlexafluor - 594のような蛍光トレーサーヒドラジド（Invitrogen）を実験中に樹状突起を可視化するために追加することができます、とneurobiotin（0.3％）も録音後の細胞の解剖学の分析のために含めることができます。ときに録音する準備ができて、細胞内液を解凍。
- 酵素溶液：細胞外液の4.150 mLに83 mgのヒアルロニダーゼ（ワーシントンの化学薬品）で104単位コラゲナーゼを（ワージントンの化学）結合。 -20℃で50μL分注し店アリコートを、数週間に使用することができます。ときに網膜を治療するために準備ができて、バブル細胞外液の500μLに分注して希釈する。
- リン酸溶液（PBS）をバッファ：H 2 O 800ml中にNaClを8gを、塩化カリウム0.2gのは、Na 2 HPO 4 1.4 gおよびKH 2物0.24g PO 4を追加。 NaOHで7.4にpHをもたらす。 1リットルの音量を調節する
- 0.2 Mリン酸緩衝液：H 2 Oを800mlのNa 2 HPO 4 21.8 gおよびのNaH 2 PO 4 6.4 gを加える。 1リットルの容積をもたらす
- 4％パラホルムアルデヒド溶液：ヒート60〜50ミリリットルH 2 O℃の4gのパラホルムアルデヒドを追加、数分間攪拌する。 1MのNaOH（5滴程度）を数滴を追加、溶液が透明になるまで攪拌してください。ビーカーに50ミリリットルの0.2 Mリン酸緩衝液を追加します。 pHのストリップを（〜7.4）を使用してpHを確認してください。フィルタと涼しい。
- ブロッキング溶液（10％ヤギ血清、0.5％TritonX100は）：PBSの1.8 mlにヤギ血清および10μLのトリトンX - 100 0.2 mlを加える。 TritonX - 100は、組織をpermeabiliseに提供しています。
- ストレプトアビジン溶液（5％ヤギ血清、0.5％TritonX100、1:500ストレプトアビジン594）：PBSの1.9 mlに10μLトリトンX - 100およびストレプトアビジン594 4μL、ヤギ血清の0.1 mlを加える。
2）マウスから網膜の単離は、
必要な解剖ツール：1＃2鉗子、2＃5鉗子、眼科用はさみ
- この場合には、承認されたプロトコールに従って、マウスを安楽死させるには優しく目の後ろ斜めに第2鉗子を挿入し、眼球を持ち上げて2窒息と摘出眼球のCO。
- 細胞外液で35ミリメートルシャーレに眼球を置きます。視神経と眼科はさみを使用して接続されているすべての外眼筋や結合組織をカット。眼科はさみで角膜を切り取ると＃5鉗子を用いてレンズを引き出します。 ＃5ピンセットを使用して強膜を引き裂き、網膜と強膜が視神経乳頭に会う視神経を切断するために鉗子を使用する。静かにアイカップから網膜ピール。ヒント：時間を最小限に抑えるために、次のステップに進む前に、両方の網膜上の各ステップを行います。
- 網膜に接続されている硝子体を除去するために鉗子を使用してください。これは、鉗子で網膜上に透明な硝子を"つかん"で行うことができます。硝子体は、正常に除去されている場合、鉗子で明確に、ゼラチン状の物質として見えるはずです。ヒント：硝子体の半分以下の除去のスライスの網膜は、使用可能な組織の量を最大化し、チャンバー内に取り付けが容易になります。
- 彼らは消化できるようになるまで、最小限の環境光で暗い環境で室温で酸素細胞外液中で網膜をしてください。網膜は〜6時間のためにこの方法で保存することができます。
3）酵素混合物と網膜の治療と録音室に取り付け
- 500μLの細胞外液中のコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼの分量は35mmシャーレ内の場所のソリューションを希釈し、網膜を転送する。
- 網膜は、含まれておいてください穏やかに振とうしながら15分間95％O2 / 5％CO 2環境で暗闇に覆われ、INGペトリ皿、、。このステップでは、残りの硝子体の消化にも役立ちますし、神経節細胞層に容易にアクセスすることができます。ヒント：以下の硝子体の有無に悪影響が認められた場合には、若い動物から網膜のために、時間が〜5分に短縮することができます。
- 酵素含有培地から網膜を取り出して、細胞外液中に広範囲に洗う
- 下向きに光受容体層とのチャンバ6を記録するに網膜を移す。ピペットまたは組織のいずれかで、残りの液体を離れて芯と、特に神経節細胞層との接触を避ける網膜の端だけを、触れないように注意して組織をフラット化する網膜の側面をロールアウト。組織を固定し、すぐに細胞外溶液チャンバーを埋めるために網膜上のナイロンメッシュでプラチナのリングを置きます。
- 、顕微鏡のステージに録音室をマウントする重力流と真空吸引用チューブを接続し、アース線を取り付けます。
4）EGFPを発現する神経節細胞の局在と光刺激
- を1 mL / minまたはより速い速度で細胞外液で重力によって網膜を灌流。ヒントは：灌流速度が遅すぎる場合は、組織が十分に酸素化されず、シナプスのシグナル伝達が中断されることがあります。
- 細胞内液と記録ピペットを記入し、ピペットホルダーに挿入します。ヒント：3〜5MΩの範囲の抵抗値を持つピペットは最良の結果を与える。
- 記録ピペットをローカライズするために、低倍率（10倍目標、NA 0.3）で赤外線微分干渉コントラスト（DIC）光学系の下で網膜を視覚化する。赤外光は、可視光に対する網膜の露出を最小限に抑え、明順応を最小限に抑えるために使用されます。より高い倍率（40倍目標、NA 0.8）に移動して、単に組織上のビューに電極をもたらす。
- 高倍率（40倍目標）で、落射蛍光（EGFPは480 nm）を網膜に点灯し、テープ（図1A）を使用してコンピュータのモニター上で蛍光神経節細胞とマーク]を選択します。
- DICと赤外線照明下で、標的神経節細胞（図1A）の近くに記録電極を配置します。すぐにポリエチレンチューブとピペットホルダーに接続されている12ccプラスチック製の注射器を介して、記録電極に穏やかな陽圧を印加することにより、セルをカバーするクリーンエリア。アンプでは、任意の電圧オフセットをゼロに。ディンプルは、細胞表面上に表示されるまで、選択された神経節細胞に電極を配置。
- 電圧クランプモードのアンプでは、テストパルスを適用し、ピペットを流れる電流を監視します。電極とセルの間にシールを作成するために負圧を適用します。セルが保持電流は、細胞の膜とピペット間GΩ電気的シールの指標になるまで封印して待つことから始まる負圧を離します。容量性の過渡現象が現れるまで、負圧の穏やかなパルスを適用し、圧力の任意のアプリケーションをリリースする。ヒント：アクセス（シリーズ）抵抗が高い場合（>30mΩ以下）、これは多くの場合、負圧の追加、非常に穏やかな、パルスによって改善することができる。
- いったん安定したシールが負圧のパルスを印加達している。全細胞モードが得られた後、セルが濃い5分間に適応することができます。フルフィールド、白色光刺激（図1B）に記録、電流クランプモードでは、応答。
- 記録に続いて、Alexafluor - 594は、樹状突起への拡散があります。トレーサーは、594 nmで落射蛍光で可視化すると神経節細胞は、オン、オフ、または落射蛍光とDIC赤外線光学系5の間の切り替えによるBi -成層であるかどうかを判断するために使用できます。
- neurobiotinはピペットと網膜に含まれている場合は、ピペットを静かに膜の中断を最小限に抑えるを提供するために撤回されている必要があります、免疫組織化学のために処理されようとしています。
記録された神経節細胞の解剖学の5）の分析
neurobiotinで充填すると、記録は、次の神経細胞の詳細な形態学的な分析が可能になります。ヒント：記録された神経節細胞と詳細な形態との間の特定の相関関係が必要な場合は、それは準備に1つだけRGCを記録して記入するのがよいでしょう。
- neurobiotinが細胞内液に含まれていた場合は、パラホルムアルデヒド溶液で網膜を配置し、4℃で一晩固定し℃、
- 、少なくとも2時間、PBSで少なくとも6変更をすすいでください。ブロッキング溶液を含むプレートに網膜を転送します。シェーカー上で、2時間室温をブロッキング溶液で残す。
- ストレプトアビジン溶液とブロッキング溶液を交換してください。 4℃で2日間振とう機上でCをインキュベートする。 PBSで網膜、6すすぎ、20分ごとにすすいでください。
- スライドガラスにVectashieldと網膜をマウントします。網膜は神経節細胞にまで配置する必要があります。共焦点顕微鏡（図1C）を実行します。
代表的な結果
網膜が正常であると解離が成功した場合、個々の神経節細胞は、高倍率（図1A）でDICの下に表示されるはずです。不健康な網膜は、大規模な、粒状の核を持つことになりますし、破棄する必要があります。特定の神経節細胞のシナプス応答が変更されていない場合は、その後、細胞は本質的に感光性神経節細胞（図1B）、持続的な脱分極の場合には、光開始時に応答したり、活動電位を相殺してください。
図1。ローカライゼーション、録音、および蛍光標識網膜神経節細胞の染色は、（A）GFP陽性RGCは40X倍率（左パネル）およびDIC照明（右パネル）の下で落射蛍光照明の下で可視化した。蛍光標識されたRGCからホールセル電流クランプモードで記録されたM2本質的に感光性の網膜神経節細胞の（B）シナプスの光の応答。 （C）neurobiotinで満たされた細胞全体の記録を対象と落射蛍光で識別されたM1本質的に感光性の網膜神経節細胞を、、、そしてその後、免疫組織化学用に処理。
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Discussion
この手法は、単離網膜から網膜神経節細胞の録音にも適用可能である。本質的に感光性の上に使用されるマウスのラインでも、メラノプシン発現RGCsがEGFP 2、5で標識され、このプロトコルは、他の蛍光標識RGCラインに容易に譲渡することはできませんかだけでなく、ランダムに選ばれたRGCsから記録するために一般化することができる。各RGCとそのそれぞれの入力ニューロンの樹状東屋が完全にそのまま残されているため、この手法は特に有用です。録音は容易に、電流または電圧クランプモードで実行セル接続またはルーズパッチ設定、あるいは核パッチ、内部または網膜神経節細胞膜から外にアウトパッチの構成に使用することができますすることができます。この手法は、容易に網膜は常に録音する前に、RGC識別のために光を照射する必要があることである神経節細胞をローカライズするためにさらに蛍光標識避難アマクリン細胞7または非置換されたアマクリン細胞からの蛍光の利用の8つの制限を記録するように適合させることができる。外因性発色団を浴溶液および/ またはアイカップと網膜色素上皮に含まれていない限り、このように、この準備は、ロッドを介する応答を記録するのに適していない可能性があります網膜9に接続されて残っている。目標は、ロッドを介した光の応答を記録する場合には、特別な注意が光色素ロドプシンの漂白しないように注意する必要があります。解剖は、赤外光条件（すなわち、10）の下で実行する必要があります。
成功した解剖を実行するには、それは解剖は可能な限り迅速に行なわれることが重要である。それは、硝子体が正常に鉗子で除去することが特に重要です。硝子体が残っている場合は、酵素消化、以下の網膜は、成功へのパッチ適用が困難にねばねばした膜で覆われる。良い録音を得るためには、細胞外溶液を激しくバブリングし、流量はチャンバーを介して十分に高いとされていることを意味し、網膜が十分に酸素であることが特に重要です。網膜は、アイカップから分離されると、組織の光曝露を最小限に抑えることも重要です。
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Acknowledgments
この作品は、NIH R01EY012949、R21EY018885、T32 EY0707133からの補助金によって部分的にサポートされていました。我々は彼の技術支援のためにダーウィンハングに感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ames’ Medium | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| AlexaFluor 594 Hydrazyde | Invitrogen | A10442 | |
| Neurobiotin | Vector Laboratories | SP1120 | |
| Electrodes | Sutter Instrument Co. | BF120-69-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Ophthalmologic Scissor | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Streptavidin 594 | Invitrogen | S32356 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-001 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
References
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