Summary
Den här artikeln innehåller en beskrivning av hur att dissekera och spela in från den isolerade näthinnans beredning i mus. Framför allt beskriver vi hur man spelar in ljus svar från en fluorescerande gangliecell befolkning och därefter identifiera och analysera dess morfologi.
Abstract
De första stegen i ryggradsdjurens visionen sker när ljuset stimulerar tappar och stavar fotoreceptorer på näthinnan 1. Denna information är sedan uppdelade i så kallade ON och OFF vägar. Den fotoreceptorer ljussignal information till den bipolära celler (kand.), som depolarize svar på höjningar (På kand.) eller minskar (Av kand.) i ljusintensitet. Denna segregering av ljus information är kvar på samma nivå av näthinnans ganglion celler (RGC: er), som har dendriter stratifiera i antingen Off sublamina av det inre plexiform lagret (IPL), där de får direkt excitatoriska input från Off BCS, eller stratifierad i On sublamina av IPL, där de får direkt excitatoriska input från På BCS. Denna segregering av information om ökningar eller minskningar av belysning (den på och stänga vägar) bevaras och signaleras till hjärnan parallellt.
Den RGC: er är resultatet cellerna i näthinnan, och är därmed en viktig cell att studera för att förstå hur ljus informationen signaleras till visuell kärnor i hjärnan. Framsteg inom musen genetik under de senaste decennierna har resulterat i en mängd olika fluorescerande linjer reporter mus där specifika RGC populationer är märkta med ett fluorescerande protein för att möjliggöra identifiering av RGC subtyper 2 3 4 och särskild inriktning för elektrofysiologiska inspelning. Här presenterar vi en metod för inspelning ljus svar från fluorescerande ganglion celler i en intakt, isolerade retinal beredning. Denna isolerade näthinnan förberedelse möjliggör inspelningar från RGC: er där dendritiska Arbor är intakt och ingångar hela RGC dendritiska bersån bevaras. Denna metod är tillämplig i en mängd olika subtyper gangliecell och är mottaglig för en mängd olika encelliga fysiologiska tekniker.
Protocol
Användning av djur Uttalande: Djur omhändertogs i enlighet med riktlinjer som beskrivs i Guide för skötsel och användning av försöksdjur, med hjälp av protokoll godkändes av University of Minnesota Institutional Animal Care och användning kommittén.
1) Beredning av lösningar
- Innan du utför elektrofysiologiska inspelning, intracellulär, extracellulära och enzym lösningar behöver förberedas.
- Extracellulära lösning: blanda en flaska (8.8g) finmalen Ames medium (Sigma) med 1 l H 2 O och 1,9 g natriumbikarbonat (23 mM). På alla punkter den extracellulära lösningen är mättad med 95% O 2 / 5% CO 2 gasblandning. Överför 200 ml till en bägare på näthinnan lagring. Placera den återstående lösningen i perfusionen systemet behållaren för gravitationen perfusion gång näthinnan är monterad.
- Intracellulär lösning: Intracellulär lösning borde ha gjorts tidigare och då konstaterat i 500-1000 mikroliter alikvoter och lagras vid -20 ° C. Intracellulär lösning varierar beroende på behov experimentet för strömtång inspelningar som visas här använder vi (i mm): 125 K-glukonat, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na 2-ATP, 0,5 mm NaGTP pH till 7,2 med KOH 5. En fluorescerande spårämne som 10 mikrometer Alexafluor-594 hydrazid (Invitrogen) kan läggas att visualisera dendriter under försöket och neurobiotin (0,3%) kan också inkluderas för analys av cellens anatomi efter inspelningen. När du är redo att spela in, tina intracellulära lösning.
- Enzym lösning: Kombinera 10 tusen enheter kollagenas (Worthington Chemicals) med 83 mg Hyaluronidas (Worthington Chemicals) till 4,150 mL extracellulärt lösning. Förvaras i 50 mikroliter alikvoter vid -20 ° C. Portioner kan användas i flera veckor. När du är redo att behandla näthinnan, späd uppmätt till 500 mikroliter av bubblade extracellulärt lösning.
- Fosfatbuffrad Solution (PBS): I 800 ml H 2 O lägga 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na 2 HPO 4 och 0,24 g KH 2 PO 4. Ta pH till 7,4 med NaOH. Justera volymen till 1 l.
- 0,2 M fosfatbuffert: I 800 ml H 2 O lägga 21,8 g Na 2 HPO 4 och 6,4 g NaH 2 PO 4. Ta volymen till 1 l.
- 4% Paraformaldehyd Lösning: Heat 50ml H 2 O till 60 ° C. Lägg 4g paraformaldehyd, rör om flera minuter. Tillsätt några droppar 1M NaOH (ca 5 droppar), rör tills lösningen är klar. Tillsätt 50 ml 0,2 M fosfatbuffert i bägare. Kontrollera pH med pH-remsor (~ 7,4). Filter och cool.
- Blockerande lösningen (10% get serum, 0,5% TritonX100): I 1,8 ml PBS lägga 0,2 ml av get serum och 10 mikroliter Triton X-100. TritonX-100 används för att permeabilise vävnaden.
- Streptavidin lösning (5% get serum, 0,5% TritonX100, 1:500 Streptavidin 594): I 1,9 ml PBS lägga 0,1 ml get serum, 10 mikroliter Triton X-100 och 4 mikroliter av Streptavidin 594.
2) Isolering av näthinnan från mus
Dissection verktyg som behövs: 1 # 2 Tång, 2 # 5 Tång, oftalmologiska sax
- Euthanize mus enligt godkänd protokoll, i detta fall CO 2 kvävning och enucleate ögongloben genom att försiktigt föra in ett vinklat # 2 pincetten bakom ögat och lyfta ut ögongloben.
- Placera ögongloben till en 35 mm petriskål med extracellulära lösning. Skär synnerven och alla anslutna muskler extraocular eller bindväv med oftalmologiska sax. Klipp bort hornhinnan med en oftalmologiska sax och dra ut linsen med # 5 pincett. Riv sklera hjälp av ett par # 5 pincett och använda pincett för att avskilja synnerven där näthinnan och sklera träffas på optiska disken. Dra försiktigt näthinnan bort från ögonmusslan. Tips: Gör varje steg på båda näthinnan innan han flyttade till nästa steg för att minimera tiden.
- Använd pincett för att avlägsna glaskroppen fäst vid näthinnan. Detta kan utföras genom att "ta tag" den genomskinliga glaskroppen över näthinnan med pincett. Glaskroppen, om det tagits bort, bör synas som en tydlig, gelatinös ämne på pincett. Tips: Skivning näthinnor i hälften efter borttagning av glaskropp kommer att maximera mängden användbara vävnad och göra montage i kammaren lättare.
- Håll näthinnor i syresatt extracellulära lösning vid rumstemperatur i en mörk miljö med minimal omgivande ljus tills de är redo att brytas ned. Näthinnor kan lagras på detta sätt för ~ 6 timmar.
3) Behandling av näthinnan med enzym blandning och montering i inspelningen kammare
- Späd en alikvot av kollagenas / hyaluronidas i 500 mikroliter extracellulärt lösning, placera lösning i en 35 mm petriskål och överför näthinnan.
- Håll näthinnan, innehållerning petriskål, täckt och i mörker, i en 95% O2 / 5% CO 2 miljö för 15 minuter under försiktig omrörning. Detta steg hjälpmedel att smälta kvarvarande glaskropp och tillåter enklare åtkomst till ganglion cellager. Tips: för näthinnor från yngre djur med mindre glaskroppen eller om biverkningar observeras, kan tiden förkortas till ~ 5 minuter.
- Ta bort näthinnan från enzym-innehållande medium och tvätta mycket i extracellulära lösning
- Överför näthinnan i inspelningen kammare 6 med ljusmätare lagret nedåt. Transportera bort kvarvarande vätska antingen med en pipett eller vävnad och utbyggnad sidor av näthinnan att platta vävnad utan att röra något bara kanterna på näthinnan, särskilt undvika kontakt med ganglion cellager. Placera en platina ring med nylonmesh över näthinnan för att förankra vävnad och omedelbart fylla kammaren med extracellulära lösning.
- Montera inspelningen kammaren på mikroskop scenen, fäst röret för gravitationen perfusion och vakuum sug och fästa jordledningen.
4) Lokalisering av EGFP uttrycka ganglion celler och lätt stimulering
- BEGJUTA näthinnan av gravitationen med extracellulära lösning på 1 ml / min eller snabbare priser. Tips: Om perfusionshastighet är för långsam, kommer vävnaden inte vara tillräckligt syresatt och synaptic signalering kan störas.
- Fyll en inspelning pipett med intracellulära lösningen och sätt in den i pipetten hållaren. Tips: Pipetter med motstånd i intervallet 3 till 5MΩ ger bäst resultat.
- Visualisera näthinnan i infraröda kontrast differential interferens (DIC) optik vid låg förstoring (10X objektiv, NA 0,3) för att lokalisera inspelningen pipetten. Infrarött ljus används för att minimera näthinnan utsätts för synligt ljus och minimera ljus anpassning. Flytta till högre förstoring (40x objektiv, NA 0,8) och ta med elektroden i sikte strax ovanför vävnad.
- Vid hög förstoring (40X objektiv), belyser näthinnan med epifluorescence (480 nm för EGFP) och välj ett fluorescerande ganglion cell och märke på datorskärm med tejp (Figur 1A).
- Enligt DIC och IR-belysning, placera inspelningen elektroden nära riktade ganglion cellen (Figur 1A). Rengör område som omfattar omedelbart cellen genom ett lätt övertryck för att spela in elektroden via en 12cc plastspruta ansluten till pipetten innehavaren med polyeten slang. På förstärkaren, noll någon spänning förskjutningar. Placera elektroden på utvalda gangliecell tills en grop visas på cellytan.
- Med förstärkaren i spänningen klämma läge, tillämpa ett test puls och övervaka den nuvarande passerar genom pipetten. Applicera negativt tryck för att skapa tätning mellan elektroden och cell. Släpp undertryck när cellen börjar täta och vänta tills hållström är ett tecken på en GΩ elektrisk tätning mellan cellens membran och pipett. Försiktigt pulser av undertryck tills kapacitiv transienter visas och släpp sedan varje tillämpning av tryck. Tips: Om tillträde (serie) resistansen är hög (> 30MΩ), kan detta ofta förbättras genom ytterligare, mycket mild, pulser av undertryck.
- När en stabil tätning uppnåtts tillämpa en puls av undertryck. Efter hela cell-läge erhålls, kan cellen till mörk anpassa sig i 5 minuter. Rekord i strömtång läge, svar på full-området, vitt ljus stimulering (Figur 1B).
- Efter inspelning kommer Alexafluor-594 har spritt till dendriter. Den spårämne kan visualiseras i epifluorescence vid 594 nm och som används för att avgöra om en ganglion cell On-, Av-eller Bi-stratifierat genom att växla mellan epifluorescence och DIC Infraröd optik 5.
- Om neurobiotin ingår i pipett och näthinnan kommer att behandlas för immunohistokemi, då pipett måste vara försiktigt tillbaka för att ge minimala störningar av membranet.
5) Analys av anatomi inspelade ganglion celler
Fyllning med neurobiotin möjliggör mer detaljerad morfologisk analys av ganglion celler efter inspelningen. Tips: Om specifika samband mellan en inspelad gangliecell och detaljerad morfologi önskas, kan det vara bäst att spela in och fylla bara en RGC per förberedelse.
- Om neurobiotin ingick i den intracellulära lösningen sedan placera näthinnan i paraformaldehyd lösning och fixa över natten vid 4 ° C.
- Skölj i PBS, minst 2 timmar, minst 6 förändringar. Överför näthinnan till en skylt som innehåller blockerande lösningen. Lämna in blockerande lösningen för 2 timmar, rumstemperatur på shaker.
- Byt ut den blockerande lösningen med Streptavidin lösningen. Inkubera 2 dygn vid 4 ° C på shaker. Skölj näthinnan i PBS, 6 sköljningar, 20 min vardera.
- Montera näthinnan med Vectashield i en glasskiva.Näthinnan måste placeras med ganglion celler uppåt. Utför konfokalmikroskopi (Figur 1C).
Representativa resultat
Om näthinnan är frisk och dissektion lyckades, bör individuella ganglion celler synas i DIC vid hög förstoring (Figur 1A). Ohälsosamma näthinnor kommer att ha stora, granulerad kärnor och ska kasseras. Om det synaptiska svar i en viss gangliecell är intakt, då cellen ska reagera på ljus debut eller kompenseras med aktionspotentialer och, i händelse av ett elektriskt-ljuskänslig ganglion cell (Figur 1B), ett ihållande depolarisation.
Figur 1. Lokalisering, inspelning, och färgning av ett fluorescerande retinal ganglion celler. (A) GFP positiv RGC visualiseras i epifluorescent belysning på 40X förstoring (till vänster) och under DIC belysning (högra panelen). (B) Synaptic ljus svar ett M2 inneboende ljuskänsliga näthinnan gangliecell in i helcells-strömtång läge från fluorescerande RGC. (C) M1 sig är ljuskänsliga näthinnan ganglion cell som identifierats enligt epifluorescence, riktade till helcells-inspelning, fylld med neurobiotin, och sedan bearbetas för immunohistokemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna teknik är tillämplig på alla näthinnan inspelningarna ganglion cell från en isolerad näthinnan. Även hos mus linje används ovan inneboende ljuskänsliga, melanopsin som uttrycker RGC: er är märkta med EGFP 2, 5, detta protokoll lätt kan överföras till andra fluorescerande RGC linjer eller kan generaliseras för att spela in från slumpmässigt utvalda RGC: er också. Denna teknik är särskilt värdefullt eftersom dendritiska berså varje RGC och dess respektive nervceller ingång finns kvar helt intakta. Inspelningar kan lätt utföras i ström eller spänning klämma lägen, cell-ansluten eller lös-patch-konfiguration, eller kan även användas för kärnförsedda patch, inom-eller utanför ut konfigurationer plåster från näthinnan membran ganglion cell. Denna teknik kan lätt anpassas för att spela in från fluorescerande fördrivna märkt amakrina celler 7 eller till icke-flyktingar amakrina celler 8 En begränsning av användningen av fluorescens för att lokalisera ganglion celler är att näthinnan alltid måste utsättas för ljus i RGC identifiering före inspelningen . Således kan denna beredning vara lämplig för inspelning av stav-medierade reaktioner om inte exogent kromofor ingår i badet lösning och / eller ögonmusslan och retinal pigment epitel är lämnas kvar på näthinnan 9. Om målet är att spela in stav-medierad ljus svar, då särskilda försiktighetsåtgärder måste vidtas för att undvika blekning av photopigment rhodopsin. Dissection måste utföras under infrarött ljus (dvs 10).
För att utföra en lyckad dissektion, är det viktigt att dissekering utföras så snabbt som möjligt. Det är särskilt viktigt att glaskroppen framgångsrikt tas bort med pincett. Om glaskroppen som finns kvar, då följande enzym matsmältningen näthinnan kommer att täckas med en geggig filmskapande framgångsrika lapp svårt. För att få bra inspelningar är det särskilt viktigt att näthinnan är väl syresatt, vilket innebär att extracellulära lösningen kraftigt är att bubblas och flödet är tillräckligt högt genom kammaren. Det är också viktigt att minimera ljusexponering av vävnad när näthinnan är isolerad från ögonmusslan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av anslag från NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Vi tackar Darwin Hang för hans tekniskt bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ames’ Medium | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| AlexaFluor 594 Hydrazyde | Invitrogen | A10442 | |
| Neurobiotin | Vector Laboratories | SP1120 | |
| Electrodes | Sutter Instrument Co. | BF120-69-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Ophthalmologic Scissor | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Streptavidin 594 | Invitrogen | S32356 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-001 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
References
- Wassle, H.
- Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development. J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).
- Huberman, A. D. Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion. Neuron. 62, 327-334 (2009).
- Siegert, S. Genetic address book for retinal cell types. Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 29, 476-482 (2009).
- Newman, E. A., Bartosch, R. An eyecup preparation for the rat and mouse. J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).
- Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines. Neuroscience. 160, 126-139 (2009).
- Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision. J Neurosci. 27, 692-699 (2007).
- Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination. J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).
- Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina. Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).
