Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

Summary

Dieser Artikel enthält eine Beschreibung, wie zu sezieren und Datensatz aus der isolierten Netzhaut Vorbereitung in der Maus. Insbesondere beschreiben wir, wie Licht von Antworten eines fluoreszenzmarkierten Ganglienzelle Bevölkerung aufzunehmen und anschließend zu identifizieren und zu analysieren, ihre Morphologie.

Abstract

Die ersten Schritte in Wirbeltieren Vision statt, wenn das Licht regt den lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen der Netzhaut ^1. Diese Information wird dann in das, was als die ON und OFF Wege bekannt getrennt. Die Photorezeptoren Signallicht Informationen zu den bipolaren Zellen (BCS), die als Reaktion auf Erhöhungen (über BCS) oder verringert (Off BCs) in der Lichtintensität depolarisieren. Diese Trennung von Licht Informationen auf der Ebene des retinalen Ganglienzellen (RGC), die Dendriten Stratifizierung entweder im Off sublamina der inneren plexiformen Schicht (IPL), wo sie erhalten direkten exzitatorischen Input von Off BCs haben behauptet, oder Stratifizierung in der On sublamina der IPL, wo sie erhalten direkten exzitatorischen Input von über BCS. Diese Trennung von Informationen über Erhöhungen oder Verminderungen Beleuchtung (die Ein-und Ausschalten Wege) konserviert ist und signalisiert dem Gehirn in parallel.

Die RGCs sind der Ausgang Zellen der Netzhaut, und sind somit eine wichtige Zelle in Ordnung Studie zu verstehen, wie Licht Informationen zu visuellen Kerne im Gehirn signalisiert. Advances in Mausgenetik in den letzten Jahrzehnten wurden in einer Vielzahl von fluoreszierenden Reporter-Maus Linien, in denen spezifische RGC Populationen mit einem fluoreszierenden Protein markiert sind, für die Identifizierung von RGC-Subtypen ^{2 3 4} und Targeting für die elektrophysiologische Ableitung ermöglichen geführt. Hier präsentieren wir eine Methode zur Aufzeichnung von Licht Antworten von fluoreszenzmarkierten Ganglienzellen in einer intakten, isolierten retinalen Vorbereitung. Diese isolierten retinalen Vorbereitung ermöglicht Aufnahmen aus RGCs wo die dendritischen Dorn ist intakt und die Eingänge über die gesamte RGC dendritischen Dorn bleiben erhalten. Dieses Verfahren ist anwendbar für eine Vielzahl von Ganglienzellen Subtypen und ist offen für eine Vielzahl von Single-Cell-physiologischen Methoden.

Protocol

Verwendung von Tieren Statement: Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren beschrieben gepflegt, mit Protokollen, die von der University of Minnesota Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1) Herstellung von Lösungen

1. Vor der Durchführung elektrophysiologischer Aufzeichnung, müssen intrazellulär, extrazellulär und Enzymlösungen vorbereitet werden.
2. Extrazellulären Lösung: mix eine Flasche (8,8 g) gepulvertem Ames 'Medium (Sigma) mit 1 l H ₂ O und 1,9 g Natriumhydrogencarbonat (23 mM). An allen Punkten der extrazellulären Lösung wird mit 95% O ₂ / 5% CO _2-Gasgemisch gesättigt. Transfer-200 mL in ein Becherglas für Netzhaut Lagerung. Legen Sie die restliche Lösung in der Perfusion System Behälter für Schwerkraft Perfusion einmal Netzhaut angebracht wird.
3. Intrazelluläre Lösung: Intrazelluläre Lösung hätte erfolgen zuvor und dann aliquotiert in 500-1000 ul Aliquots und bei -20 ° C. Intrazelluläre Lösung variiert je nach Experiment benötigt werden, für Stromzange Aufnahmen gezeigt, hier benutzen wir (in mm): 125 K-Gluconat, 2 CaCl _{2, 2} MgCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na _2-ATP, 0,5 mM NaGTP pH-Wert auf 7,2 mit KOH ^5. Ein fluoreszierender Tracer wie 10 uM AlexaFluor-594 Hydrazid (Invitrogen) hinzugefügt werden, um Dendriten während des Experiments, und neurobiotin (0,3%) zu visualisieren kann auch für die Analyse von Zell-Anatomie nach der Aufnahme aufgenommen werden. Wenn Sie bereit sind zu erfassen, zu tauen intrazelluläre Lösung.
4. Enzymlösung: Kombinieren 10000 Stück Collagenase (Worthington Chemicals) mit 83 mg Hyaluronidase (Worthington Chemicals) in 4,150 ml extrazellulären Lösung. Shop in 50 ul Aliquots bei -20 ° C. Aliquots können mehrere Wochen verwendet werden. Wenn Sie bereit sind, um die Netzhaut zu behandeln, verdünnten Aliquots in 500 ul von sprudelte extrazellulären Lösung.
5. Phosphat-gepufferte Lösung (PBS): In 800 ml H ₂ O add 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na ₂ HPO ₄ und 0,24 g KH ₂ PO _4. Bringen Sie den pH mit NaOH auf 7,4. Stellen Sie die Lautstärke auf 1 L.
6. 0,2 M Phosphatpuffer: In 800 ml H ₂ O hinzu 21,8 g Na ₂ HPO ₄ und 6,4 g NaH ₂ PO _4. Bringt Volumen auf 1 L.
7. 4% Paraformaldehyd-Lösung: Wärme 50ml H ₂ O bis 60 ° C. Add 4g Paraformaldehyd, rühren für einige Minuten. Fügen Sie einige Tropfen 1M NaOH (ca. 5 Tropfen), immer schön rühren, bis die Lösung klar ist. 50 ml 0,2 M Phosphat-Puffer in das Becherglas. Überprüfen Sie pH-Wert mit pH-Streifen (~ 7,4). Filter und kühl.
8. Blocking-Lösung (10% Ziegenserum, 0,5% TritonX100): In 1,8 ml PBS add 0,2 ml Ziegenserum und 10 l Triton X-100. TritonX-100 dient dazu, das Gewebe permeabilisieren.
9. Streptavidin-Lösung (5% Ziegenserum, 0,5% TritonX100, 1:500 Streptavidin 594): In 1,9 ml PBS add 0,1 ml Ziegenserum, 10 l Triton X-100 und 4 ul Streptavidin 594.

2) Isolierung der Netzhaut von der Maus

Dissection Werkzeuge benötigt: 1 # 2 Pinzetten, 2 # 5 Pinzetten, Scheren ophthalmologische

1. Euthanize Maus nach anerkannten Protokollen, in diesem Fall CO ₂ Ersticken und entkernen Augapfel durch vorsichtiges Einsetzen einer abgewinkelten Pinzette # 2 hinter dem Auge und Herausheben des Augapfels.
2. Setzen Sie den Augapfel in eine 35 mm Petrischale mit extrazellulären Lösung. Schneiden Sie den Sehnerv und alle angeschlossenen Augenmuskeln oder Bindegewebe mit ophthalmologischen Schere. Cut entfernt die Hornhaut mit einer augenärztlichen Schere und ziehen Sie das Objektiv mit Nr. 5 Pinzette. Reißen Sie die Lederhaut mit einem Paar Nr. 5 Pinzette und nutzen Sie die Zange an den Sehnerv, wo die Netzhaut und Sklera am Sehnervenkopf treffen zu durchtrennen. Vorsichtig schälen die Netzhaut weg von der Augenmuschel. Tipp: Lassen Sie jeden Schritt auf beiden Netzhäute, bevor er zum nächsten Schritt zu Zeit zu minimieren.
3. Verwenden einer Pinzette, um Glaskörper an der Netzhaut zu entfernen. Dies kann durch "Greifen" der transparente Glaskörper vor der Netzhaut mit einer Pinzette durchgeführt werden. Der Glaskörper, wenn erfolgreich entfernt, sichtbar sein soll als eine klare, gallertartige Substanz an der Zange. Tipp: Schneiden Netzhaut in der Mitte nach der Entfernung des Glaskörpers wird die Menge der verwendbaren Gewebe zu maximieren und die Montage in der Kammer zu erleichtern.
4. Halten Sie die Netzhaut in Sauerstoff extrazellulären Lösung bei Raumtemperatur in einer dunklen Umgebung mit minimalem Umgebungslicht bis sie bereit sind verdaut werden. Netzhaut kann auf diese Weise für ca. 6 Stunden aufbewahrt werden.

3) Die Behandlung von Netzhaut mit Enzym-Mischung und Montage in der Aufnahme Kammer

1. Ein Aliquot des Kollagenase / Hyaluronidase in 500 ul extrazellulären Lösung, Place-Lösung in einer 35 mm Petrischale und Transfer der Netzhaut.
2. Halten Sie das Retina-enthaltenIng. Petrischale abgedeckt und in der Dunkelheit, in einem 95% O2 / 5% CO _2-Umgebung für 15 min unter leichtem Schütteln. Dieser Schritt hilft bei der Verdauung alle verbleibenden Glaskörpers und ermöglicht einen leichteren Zugang zu den Ganglienzellen. Tipp: für Netzhäute von jüngeren Tieren mit weniger Glaskörper oder wenn schädliche Wirkungen beobachtet werden, Zeit zu ~ 5 Minuten verkürzt werden.
3. Entfernen Netzhaut von Enzym-haltigen Medium und waschen ausgiebig in extrazellulären Lösung
4. Übertragen Sie die Netzhaut in der Aufnahme Kammer ⁶ mit dem Photorezeptorschicht nach unten. Wick entfernt Restflüssigkeit entweder mit einer Pipette oder Gewebe-und Roll-out Seiten der Netzhaut, um Gewebe zu achten, nur die Ränder der Netzhaut, insbesondere die Vermeidung von Kontakt mit dem Ganglienzellschicht Touch zu glätten. Legen Sie ein Platin-Ring mit Nylon-Mesh über Netzhaut, um das Gewebe zu verankern und sofort füllen die Kammer mit extrazellulären Lösung.
5. Montieren Sie die Aufnahme Kammer auf den Mikroskoptisch legen Rohr für die Schwerkraft Perfusion und Vakuum-Saug-und befestigen Erdungskabel.

4) Lokalisierung von EGFP exprimieren Ganglienzellen und leichte Stimulation

1. Versorgen die Netzhaut durch die Schwerkraft mit extrazellulären Lösung bei 1 mL / min oder schneller Preisen. Tipp: Wenn Perfusionsrate zu langsam ist, das Gewebe wird nicht ausreichend mit Sauerstoff und synaptische Signalisierung kann gestört werden.
2. Füllen Sie eine Aufzeichnung Pipette mit intrazellulären Lösung und setzen Sie sie in den Pipettenhalter. Tipp: Pipetten mit Widerständen im Bereich von 3 bis 5MΩ die besten Ergebnisse.
3. Visualisieren Sie die Netzhaut unter Infrarot-Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Optik bei geringer Vergrößerung (10fach Objektiv, NA 0,3) zur Lokalisierung der Aufnahme Pipette. Infrarot-Licht wird verwendet, um Netzhaut Belichtung mit sichtbarem Licht zu minimieren und zur Minimierung Helladaptation. Umzug in höherer Vergrößerung (40fach Objektiv, NA 0,8) und bringen Elektrode in den Blick knapp über Gewebe.
4. Bei hoher Vergrößerung (40fach Objektiv), beleuchten die Netzhaut mit Epifluoreszenz (480 nm für EGFP) und wählen Sie einen fluoreszierenden Ganglienzellen und markieren Sie auf dem Computer-Monitor mit Klebeband (Abbildung 1A).
5. Unter DIC und IR-Beleuchtung, Position der Aufnahme Elektrode in der Nähe der gezielten Ganglienzellen (Abb. 1A). Den Bereich sofort für Zelle durch leichten Überdruck, um die Aufnahme Elektrode über eine 12cc Plastikspritze mit dem Pipettenhalter mit PE-Rohre. Auf dem Verstärker, Null jede Spannungs-Offsets. Die Elektrodenspitze auf ausgewählte Ganglienzelle bis ein Grübchen erscheint auf der Zelloberfläche.
6. Mit dem Verstärker in Voltage-Clamp-Modus anwenden Testpuls und Überwachung der Strom durch die Pipette. Bewerben Unterdruck zur Abdichtung zwischen Elektrode und Zelle zu schaffen. Release-Unterdruck, wenn die Zelle beginnt zu versiegeln und bis Haltestrom deutet auf eine GOhm elektrische Abdichtung zwischen Zellmembran und Pipette zu warten. Bewerben sanfte Impulse von negativer Druck, bis kapazitiven Transienten und erscheinen dann los jede Anwendung von Druck. Tipp: wenn der Zugriff (Serie) Widerstand ist hoch (> 30MΩ), kann dies oft durch zusätzliche, sehr sanft, Impulse von negativer Druck gelindert werden.
7. Sobald eine stabile Abdichtung erreicht gelten ein Impuls von Unterdruck. Nach Ganzzell-Modus erhalten, ermöglichen Zelle zu dunkel für 5 Minuten anzupassen. Record, in Stromzange Modus Reaktion auf full-field, weißes Licht Stimulation (Abbildung 1B).
8. Nach der Aufnahme wird AlexaFluor-594 haben diffundiert, um die Dendriten. Der Tracer kann unter Epifluoreszenz visualisiert bei 594 nm und verwendet werden, um festzustellen, ob eine Ganglienzelle On-, Off-oder Bi-Schichtspeicher durch Umschalten zwischen Epifluoreszenz und DIC Infrarotoptik ^5. Ist
9. Wenn neurobiotin in Pipette und der Netzhaut wird sich für die Immunhistochemie verarbeitet werden enthalten ist, dann muss Pipette vorsichtig eingefahren werden, um minimale Unterbrechung der Membran.

5) Analyse der Anatomie des aufgezeichneten Ganglienzellen

Füllen mit neurobiotin ermöglicht genauere morphologische Analyse von Ganglienzellen nach der Aufnahme. Tipp: Wenn bestimmte Korrelationen zwischen einem aufgezeichneten Ganglienzellen und detaillierte Morphologie gewünscht wird, kann es am besten zu erfassen und zu füllen nur ein RGC pro Präparat.

1. Wenn neurobiotin in der intrazellulären Lösung enthalten war dann die Netzhaut in Paraformaldehyd-Lösung und fix über Nacht bei 4 ° C.
2. Spülen in PBS, mindestens 2 Stunden, mindestens 6 ändert. Übertragung der Netzhaut zu einer Platte mit Blocking-Lösung. Lassen Sie in Blocking-Lösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur auf Schüttler.
3. Ersetzen Sie die Blocking-Lösung mit dem Streptavidin-Lösung. Inkubieren 2 Tage bei 4 ° C am Schüttler. Spülen Sie die Netzhaut in PBS, 6 Spülungen, jeweils 20 min.
4. Montieren Sie die Netzhaut mit Vectashield in einem Glasträger.Die Netzhaut ist mit den Ganglienzellen platziert werden bis. Führen Sie die konfokale Mikroskopie (Abbildung 1C).

Repräsentative Ergebnisse

Wenn die Netzhaut gesund ist und das Sezieren erfolgreich war, sollten die einzelnen Ganglienzellen unter DIC sichtbar bei hoher Vergrößerung (Abbildung 1A). Ungesunde Netzhaut haben große, granulierte Kerne und muss entsorgt werden. Wenn der synaptischen Antwort eines bestimmten Ganglienzellen intakt ist, dann ist die Zelle sollte bei leichten Einsetzen reagieren oder versetzt Aktionspotentiale und, im Falle eines intrinsisch lichtempfindlichen Ganglienzellen (Abbildung 1B), eine anhaltende Depolarisation.

Abbildung 1. Lokalisierung, Aufzeichnung und Färbung eines fluoreszenzmarkierten retinalen Ganglienzellen. (A) GFP positive RGC visualisiert unter epifluoreszenten Beleuchtung bei 40-facher Vergrößerung (links) und unter DIC Beleuchtung (rechts). (B) Synaptic Licht Reaktion eines M2 intrinsisch lichtempfindlichen retinalen Ganglienzellen in whole-cell current clamp Modus von fluoreszenzmarkierten RGC aufgezeichnet. (C) M1 intrinsisch lichtempfindlichen retinalen Ganglienzellen, die unter Epifluoreszenz identifiziert wurde, für whole-cell recording gezielt mit neurobiotin gefüllt und dann für die Immunhistochemie verarbeitet.

Discussion

Diese Technik ist für alle retinalen Ganglienzellen Aufnahmen aus einer isolierten Netzhaut. Obwohl in der Mauslinie oben verwendeten intrinsisch lichtempfindlichen, Melanopsin-exprimierenden RGCs mit EGFP ^{2, 5} gekennzeichnet sind, ist dieses Protokoll ohne weiteres auf andere fluoreszenzmarkierte RGC Linien oder verallgemeinert werden können, um aus zufällig ausgewählten RGCs sowie Rekord. Diese Technik ist besonders wertvoll, weil die dendritischen Dorn jedes RGC und ihre jeweiligen Eingangs-Neuronen links sind völlig intakt. Aufnahmen lassen sich leicht in aktuelle oder Voltage-Clamp-Modi, Zell-attached oder loose-Patch-Konfiguration durchgeführt werden, oder sogar für kernhaltigen Patch verwendet werden, innen oder außen-out-Patch-Konfigurationen von retinalen Ganglienzellen Zellmembranen. Diese Technik könnte leicht angepasst werden, um von fluoreszenzmarkierten Vertriebenen Amakrinzellen ⁷ oder auch Nicht-Vertriebene Amakrinzellen Aufnehmen von ⁸ Eine Einschränkung der Nutzung der Fluoreszenz zu lokalisieren Ganglienzellen ist, dass die Netzhaut stets ausgesetzt für RGC Identifikation vor Licht, um die Aufnahme zu . So kann dieses Präparat nicht geeignet für die Aufnahme Stab-vermittelten Reaktionen, wenn exogene Chromophor in der Badlösung und / oder die Augenmuschel und retinalen Pigmentepithel sind links an der Netzhaut ⁹ enthalten ist. Wenn das Ziel ist es, Stab-vermittelten Reaktionen Licht aufnehmen, dann müssen besondere Vorkehrungen getroffen, um zu vermeiden Ausbleichen der Photopigment Rhodopsin werden. Dissection muss unter Infrarot-Licht (also ¹⁰⁾ durchgeführt werden.

Um eine erfolgreiche Präparation, ist es wichtig, dass die Dissektion so schnell wie möglich durchgeführt werden. Es ist besonders wichtig, dass der Glaskörper erfolgreich mit der Pinzette entfernt werden. Wenn der Glaskörper übrig ist, dann folgt Enzymverdau der Netzhaut wird mit einem klebrigen Film machen erfolgreiche Patchen schwer abgedeckt werden. Um gute Aufnahmen, ist es besonders wichtig, dass die Netzhaut gut mit Sauerstoff versorgt wird, was bedeutet, dass die extrazelluläre Lösung wird kräftig sprudelte und die Durchflussmenge ist ausreichend hoch, durch die Kammer. Es ist auch wichtig, um Belichtung des Gewebes zu minimieren, wenn die Netzhaut von der Augenmuschel isoliert ist.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ames’ Medium	Sigma-Aldrich	A1420
Collagenase	Worthington Biochemical	LS005273
Hyaluronidase	Worthington Biochemical	LS002592
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
AlexaFluor 594 Hydrazyde	Invitrogen	A10442
Neurobiotin	Vector Laboratories	SP1120
Electrodes	Sutter Instrument Co.	BF120-69-10
Forceps	Fine Science Tools	11252-30
Ophthalmologic Scissor	Fine Science Tools	15000-00
Streptavidin 594	Invitrogen	S32356
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-001
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210