Summary
描述的方法来可视化和量化，F -肌动蛋白在神经生长锥刺完。盖玻片上培养神经细胞后，细胞透用含皂甙的解决方案。然后，潜伏期短皂苷含有若丹明-肌动蛋白的缓冲区纳入到免费的肌动蛋白刺完肌动蛋白的荧光。
Abstract
轴突生长的能动的小技巧，被称为生长锥。生长锥导致导航轴突通过发展组织与当地表达的分子的指导线索，结合生长锥的受体和调节的动态和组织的生长锥细胞骨架3-6交互。这些导航信号的主要目标是肌动蛋白丝小梁，填补了生长锥外围和驱动器的增长，通过不断的肌动蛋白聚合和动态重构7锥蠕动。正或有吸引力的指导线索诱导生长锥转向通过刺激肌动蛋白丝（F - actin的）聚合在生长锥的外围接近源引诱提示地区。此肌动蛋白聚合驱动本地生长锥突领先的利润率和走向的诱食性轴索伸长率，附着力强。
肌动蛋白丝聚合取决于可用性和足够的肌动蛋白单体聚合单体此外细胞核或肌动蛋白丝刺结束。肌动蛋白单体是十分小鸡视网膜和背根神经节（DRG）生长锥。因此，聚合迅速增加F -肌动蛋白刺结束时成为单体此外的。出现这种情况通过当地的大义灭亲“F -肌动蛋白的蛋白质因子（ADF / cofilin）肌动蛋白解聚在生长锥地区接近一个引诱 8-10激活在鸡背根神经节和视网膜生长锥。这加剧ADF / cofilin活动中断微丝创造新的F -肌动蛋白聚合刺完。下面的方法演示了这种机制。 F -肌动蛋白总含量是荧光灯的鬼笔环肽染色观察。 F -肌动蛋白刺两端增长以下，这是适应从其他运动型细胞11，12以前的研究中所描述的程序透视锥细胞内的肌动蛋白罗丹明纳入可视化。当罗丹明-肌动蛋白浓度高于临界浓度的肌动蛋白单体除刺完补充说，罗丹明-肌动蛋白组装到免费的刺完。如果有吸引力的线索是在梯度，如被释放从定位到一个生长锥的一侧一个微量，纳入到F -肌动蛋白刺结 束罗丹明-肌动蛋白在生长锥端提高对微量10 。
生长锥，小巧精致的细胞结构。通透，罗丹明-肌动蛋白的法团，固定和荧光可视化的程序都用心去做，可在倒置显微镜阶段进行。这些方法可以适用于研究当地的肌动蛋白聚合中迁移神经元，其他基层组织细胞或细胞株。
Protocol
罗丹明-肌动蛋白标签，在35毫米的塑料菜底部，或盖玻片粘到“视频”菜放在玻片上培养神经元。
1。制备盖玻片或“视频”菜
- 许多神经类型不佳胶粘剂体外基板。盖玻片，此过程需要的，可能不允许，除非他们有足够的清理和准备足够的神经底材的附着力。酸洗涤和清洁玻片一个详细的过程描述在书中培养的神经细胞，由银行家和Goslin编辑。另外，盖玻片，如饥似渴地结合底物分子，硝化棉涂料是在下面的步骤1.7和1.8。
- 盖玻片（如18平方毫米或24毫米的圆圈）卫生署2 O冲洗和烘烤干热（≥225 ° C）只要尽可能（数天的最低可达3个月或更长的时间），去除有机的痕迹化合物。转到步骤1.6或视频菜肴进行1.3。
- 要创造一个清晰的玻璃基板薄高分辨率videomicroscopy，适当直径的圆形孔钻成35或50毫米的塑料的Petri或组织培养皿的底部使用电动软木螟（或类似的文书）。钻探是慢慢与轻的压力，以避免开裂的塑料。钻孔的边缘刮用剪刀，双方创建一个光滑的表面。
- 组织培养用玻片清洗，如1.1或1.2中所述。盖玻片粘在孔，采用无毒硅胶水族馆水泥（18x18mm盖玻片，直径12mm位）。水泥固化24小时。
- （以下步骤使用无菌条件下进行）视频菜用无菌的dh 2 O冲洗3次，并允许空气干燥。
- 盖玻片上都涂有神经元文化的底物分子。首先，盖玻片表面涂（250μL18 × 18盖玻片）100μg/ mL的聚- D -赖氨酸PBS为4-8小时（或过夜）在饱和湿度38℃孵化器的解决方案。盖玻片，然后用无菌DH 2 O冲洗3次，以去除未结合的D -聚赖氨酸，并允许在空气中晾干。许多神经类型与D -聚赖氨酸单独涂的，如果在培养基中的血清蛋白的盖玻片上培养。然而，结果更具相关性，在体内条件下，使用天然的底物分子获得。的解决方案，如层粘连蛋白，纤维连接蛋白或L1 CAM（1-20微克/毫升的PBS），这些分子可直接应用D -聚赖氨酸涂布盖玻片为4-8小时或过夜，但在我们的实验室中，我们经常大衣与薄膜的细胞粘附分子在提出申请前增加蛋白底物结合的硝化棉的准备盖玻片。
- 通过了1％硝酸纤维素溶液溶解在5毫升100％戊酯5克硝化棉。应用10μL解决盖玻片，轻轻地分布在表面上。空气干燥10分钟。
- 应用250μL25微克/毫升层粘连蛋白或4微克/毫升L1 CAM在PBS和硝酸纤维素表面传播的解决方案。在饱和湿度38 ° C培养箱中培养，吸基板孵育4小时（或过夜），并立即加入培养基，使基材不燥。
2。神经元文化的制备
- 从胚胎第7天的鸡胚蛋，放置在100毫米培养皿盘含有10％的夹层血清培养基中删除从胸部和腹部的内脏器官，使用立体显微镜。
- 胚胎冲洗中和转移到与液体介质中盘60毫米，并进一步解剖，删除和准备背根神经节（DRG）或神经视网膜组织的外植体。一个详细清扫描述，可以发现在细胞生物学，71卷，神经元：细胞生物学家，编辑霍伦贝克和Bamburg方法和应用方法。背根神经节植1/2-whole神经节神经视网膜植或直径小于1毫米。
- 清洗后的多余组织植，个别植移动到这是已经在培养基的培养皿中的盖玻片，镊子制表大师。在解剖显微镜下，外植体，轻轻压盖玻片，用镊子而运送到孵化器，以防止运动的中心。 F12培养基中培养外植体与B27的添加剂，与10毫米HEPES pH值7.4的缓冲和放置在饱和湿度38℃培养箱中过夜。必要时，可以添加生长因子，作为培养基。神经营养因子往往添加到DRG的年纪较大的胚胎培养，尽管E7的DRG神经元轴突将扩大从没有补充神经营养因子的植。神经视网膜植延长没有在此培养基中的轴突dding增长的因素。
- 文化孵育至少18小时，以便在开始以下步骤之前，有足够的轴突生长。
3。罗丹明肌动蛋白的制备通透缓冲
- 一个通透含有138毫米氯化钾，10毫米的管道，3毫米EGTA，4MM MgCl 2的，和1％BSA（pH值= 6.9）缓冲库存解决方案可以保持2个星期在4 ° C11。使用前，加入终浓度为以下几部分组成：0.025％，皂甙，0.1毫米ATP和100 nm的Alexa的福陆公司的350鬼笔环肽。
- 一个单独的解决方案是也只是之前使用这些相同的组件加上0.45μm的罗丹明非肌动蛋白，解决的办法是交替振荡5分钟解散罗丹明-肌动蛋白团块tritrated新鲜配制，振荡1分钟，在最初的通透性一步管，以防止聚合。如果尽管这样，在管的灯丝大会仍然是一个问题，该解决方案可以事先离心使用。
4。神经元文化的通透性和罗丹明-肌动蛋白结合到F -肌动蛋白刺完
- 一个背根神经节或视网膜植培养皿仔细从孵化器中删除，并在室温下执行以下步骤。
- 解决方案的所有更改必须小心。枪头应放置在盖玻片边缘的解决方案应该除掉，并缓慢加入，用最少的力。
- 培养基通过吸管小心被删除，但稳步增长，和足够的通透缓冲盖细胞添加1分钟（18毫米x 18毫米盖玻片，〜60μL）。文化不与任何其他的解决方案之前加入通透缓冲冲洗，并盖玻片不允许晾干后方可加入通透缓冲区。
- 通透缓冲区吸管轻轻地去除和替换包含4分钟0.45微米罗丹明非肌动蛋白的通透性缓冲区。
- 罗丹明-肌动蛋白含有缓冲区是通过吸管轻轻除去，神经元是固定的，加入4％多聚甲醛（实验室级，用磷酸盐缓冲液，pH值7.3），0.05％戊二醛和10％的蔗糖溶液。 5分钟后固定在盖玻片，用PBS轻轻冲洗，并安装在Slowfade 3英寸的载玻片上。
- 不断变化的解决方案的另一种方法是使用流动池。这可能是一个市售的流动池，或可以由一个简单的流动细胞间隔在盖玻片的角落放置小的塑料件（≤1毫米厚），然后安装上的前一个同等大小的盖玻片盖玻片。可以通过流动池的一侧放置的吸管和撤回解决方案，在对方芯（棉或Kimwipe）交换解决方案。
- 罗丹明-肌动蛋白纳入到F -肌动蛋白刺结束，鬼笔环肽荧光标签的F - actin的生长锥是通过60X油浸物镜落射荧光光学可视化，图像收集，使用冷却CCD相机。共聚焦显微镜可以提供更好的成像。
- 为了获得最佳的量化罗丹明-肌动蛋白掺入的所有图像应收集在一个会话中，使用相同的增益和曝光设置为每个图像的数码相机的灵敏度。标签分析，应该从每个图像相当于地区; Metamorph，图像J或类似的计算机化图像分析工具可以使用。
此过程的变异
5。变化之一：罗丹明肌动蛋白标签之前收集活细胞图像
- 视频菜肴被放置到一个温暖的显微镜阶段，并收集现场生长锥图像。可用于网格盖玻片，或蚀刻和/或盖玻片上的笔标记可以更容易地找到特定的细胞后，标签，或视频盘可以固定在显微镜舞台上过程的持续时间。
- 通透，掺入罗丹明-肌动蛋白和细胞固定进行视频菜，打开或关闭在显微镜阶段。固定后，PBS添加到立即成像的视频菜。要保留的样本以供日后成像，slowfade安装介质添加到盖玻片和同等大小的盖玻片轻轻地放置在上面（避免气泡），和边缘，然后用透明指甲油密封。
6。两个变化：合作标签附加蛋白的免疫组织化学
- 纳入罗丹明肌动蛋白和固定，可进行对在盖玻片上或视频菜培养神经元以上（4.2-4.4）所述。
- 固定后，PBS漂洗，细胞治疗与0.1 M甘氨酸的PBS 15分钟，然后提取0.1％的Triton X - 100的2％山羊血清和1小时1％BSA的PBS（TX - 100）盖玻片PBS稀释的抗体，1小时含1％BSA孵育在盖玻片，然后冲洗和TX - 100的PBS 2％山羊血清和1％的牛血清白蛋白1小时，在提出申请前1小时1％BSA的荧光抗体1:1000稀释的PBS孵育0.1％，冲洗后，再次培养盖玻片在0.1％TX - 100的PBS，2％山羊血清和1％BSA 30分钟，冲洗，并安装在抗衰落介质中。一些蛋白质的本地化被打乱步骤（4.3）由最初的通透性。可以添加到要保留这些蛋白抗体的本地化，0.05％和0.05％的多聚甲醛戊二醛通透缓冲1分（即前加入罗丹明-肌动蛋白），而不会影响罗丹明-肌动蛋白的刺末端标记。
- 三重标记的生长锥的荧光或共聚焦显微镜图像采集。
7。变化之三：评估F - actin的免费刺完的指导线索的影响
- 一种生长因子或指导提示，是在几分钟的几个毫微克/毫升（或适当的治疗时间）的浓度在孵化器的培养皿前从孵化器中删除的菜，并开始通透过程。这使得生长因子或F - actin的自由刺完的指导线索的短期效应的评估。
- 一个视频与神经元的文化菜，可以放在一个温暖的显微镜阶段，并在附近生长锥开始之前的通透性和罗丹明-肌动蛋白掺入的梯度，生长因子或指导线索可以从微发布。例如，NGF可以释放为背根神经节神经视网膜神经节细胞神经元或netrin。移液器可引入短1-2分钟才开始的通透性程序。这允许指导提示梯度上形成的F -肌动蛋白在生长锥的利润（见图像的参考引文10）刺完当地的影响进行评估。
- 这些变化可在6.2以上所述，与其他神经元组件的抗体介导的标签相结合。
8。变化之四：F - actin的免费转染神经元刺末端标记
- 组成性激活或显性负构造或蛋白敲除利用RNAi（用荧光标记识别）的使用，可用于评估一种蛋白质在参与调节F -肌动蛋白刺结束。根据生长锥内的蛋白质，其本土化，而且，如果它是融合一个荧光标记，荧光蛋白表达在转染细胞后可通透丢失。如果是这样的情况下，视频菜可以用来识别显微镜前一个转染的细胞通透性，并可以执行的通透性标记转染细胞的位置后，在显微镜舞台上。另外，GFP -肌动蛋白的构造，可以共同转染GFP的构建利益。 GFP -肌动蛋白在这种情况下，将被纳入F -肌动蛋白，并不会丢失的通透性，从而使转染细胞的识别后通透性。
- 这种变化可以结合另外的指导线索，在7.1-7.3以上所述。
9。代表性的成果
图1。 NGF的全球除了增加总的F -肌动蛋白和F -肌动蛋白在生长锥的领先保证金刺完 ，当一个背根神经节生长锥是5分钟的神经生长因子（NGF）的刺激，肌动蛋白聚合是在领先的保证金的刺激，罗丹明-肌动蛋白标签的亮带周围可见生长锥外围。图1比较罗丹明-肌动蛋白掺入到未刺激背根神经节生长锥和一个神经生长因子刺激的背根神经节生长锥。在合并后的图像中的绿色荧光鬼笔环肽标记F -肌动蛋白在生长锥的红色罗丹明-肌动蛋白标签。刺末端标记的一个很好的控制是添加在步骤4.2和4.3通透缓冲区10-6 M或更高的细胞松弛素B或D。 Cytochalasins第F -肌动蛋白刺完，抑制刺完罗丹明-肌动蛋白结合。这严重降低或消除掺入罗丹明-肌动蛋白进入细胞。比例尺，10微米。
图2。一种神经生长因子的梯度本地增加F -肌动蛋白刺完一个释放NGF的微量F -肌动蛋白标签免费刺完，一个2分钟的背根神经节生长锥的一侧。下面的图片显示，暴露于梯度本地的NGF刺激增加F -肌动蛋白在生长锥地区接近移液器刺完。合并后的图像显示在绿色的鬼笔环肽红色罗丹明-肌动蛋白。比例尺，10微米。
图3。激活ERM蛋白积聚在生长锥领先的利润率。phospho-Ezrin/Radixin/Moesin免疫组织化学标记（PERM）与F - actin的自由刺完。 Gluteraldehyde（0.05％）和多聚甲醛（0.05％），分别加入1分钟，以保持企业风险管理本地化的初步通透缓冲。罗丹明-肌动蛋白，红烫发，绿色;鬼笔环肽，蓝。比例尺，10微米。
图4。肌动蛋白聚合的刺激，需要积极的ERM蛋白。游离病种付费，共转染GFP -肌动蛋白和GFP控制质粒或一个显性负Ezrin / Radixin / Moesin（DN ERM）的构造。使用GFP -肌动蛋白的允许后，确定转染细胞通透性。这里，神经生长因子增加了5分钟，F -肌动蛋白刺结束标签之前。注意：生长锥的转染DN的企业风险管理，减少生长锥保证金（较低的中间面板），这与附近的未转染生长锥（下板）对比，或与GFP控制（中上部面板）刺年底的水平。若丹明-肌动蛋白，红色; GFP -肌动蛋白，绿色。比例尺，10微米。
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Discussion
这里介绍的方法允许在生长锥的迁移领先保证金，参与肌动蛋白细胞骨架的动态重塑的细胞成分的时间和空间分辨率。诱食分子，如神经生长因子或netrin，行动迅速刺激肌动蛋白丝聚合透露，作为在当地增加肌动蛋白刺完由肌动蛋白丝切断激活ADF / cofilin 10，如在图1和2所示。该方法允许介导生长锥chemotropic反应，如radixin，图，在图3和4的ERM蛋白，参与其他蛋白质的本地化。这些方法也可以应用到分析中迁移神经元，神经胶质细胞或其他类型的细胞的肌动蛋白为基础的运动的调控。
生长锥或其他小型运动型结构的微妙性，在使用这种方法的一个明显的局限性。生长锥领先的利润率或类似的运动型区域的细胞中含有数比微丝和质膜的结构元素，所以必须谨慎采取的每一步。细胞聚集或植有可能遭到破坏的表面张力的变化，作为交换解决方案。在协议中提到的，最好是在不断变化的解决方案的盖玻片边缘移液器，和流通池的使用将消除表面张力的问题。
另一种方法来可视化肌动蛋白在细胞的运动型地区刺完刺最终结合蛋白表达的荧光类似物，如ENA / VASP或肌球蛋白十，然而，涉及细胞转染，肌动蛋白在生长锥的空间动力学可能会改变不受管制的表达这些肌动蛋白的调节蛋白。
丝状伪足不强烈标记，lamellipodia这罗丹明-肌动蛋白的标记方法。丝状伪足可能被打乱，尽管它们是通透缓冲区中的荧光鬼笔环肽标记和稳定。这lamellipodial VS filopodial掺入罗丹明-肌动蛋白的差异可能反映在可视化纳入罗丹明-肌动蛋白的数量限制，或有可能是在刺月底封顶在这些运动型结构的蛋白质存在差异。这就提出了一个额外的限制，免费刺完，用这种方法的标签不透露是否新创建的标记的刺完，如ADF / cofilin大义灭亲“F -肌动蛋白，F -肌动蛋白是否是不能割断的，但带刺的两端被释放的刺年底封顶蛋白质去除。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者感谢詹姆斯Bamburg博士和他在这些研究中的合作的实验室的成员。这项工作是由美国国立卫生研究院补助HD19950，EY07133从美国明尼苏达州医学基金会的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18x18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | |
| 35mm Petri dishes | Falcon BD | 351008 | |
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | |
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| L1 CAM | R&D Systems | 777-NC | |
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen | A22281 | |
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | |
| F12 Culture medium | Invitrogen | 21700-075 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
References
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