Summary
En metod att visualisera och kvantifiera F-aktin taggtråd slutar i neuronala tillväxt kottar beskrivs. Efter odling nervceller på glas täckglas, celler permeabilized med en saponin-innehållande lösning. Sedan innehåller en kort inkubation med saponin buffert innehållande Rhodamine-aktin fluorescerande aktin på fri aktin hullingar slutar.
Abstract
Den rörliga tips av växande axoner kallas tillväxt kottar. Tillväxt kottar leda navigera axoner genom att utveckla vävnader genom att interagera med lokalt uttryck molekylära vägledning ledtrådar som binder receptorer tillväxt konen och reglera dynamiken och organisationen av tillväxten konen cytoskelettet 3-6. Det huvudsakliga målet för dessa navigations-signaler är aktin filament meshwork som fyller i periferin tillväxt konen och som driver tillväxten konen motilitet genom ständig aktin polymerisation och dynamiska remodeling 7. Positivt eller attraktiva vägledning cues inducerar tillväxt kotte vrida genom att stimulera aktin filament (F-aktin) polymerisation i regionen av tillväxten konen periferin som är närmast källan till lockbete kö. Detta aktin polymerisation driver lokal tillväxt kotte utstick, vidhäftning av de ledande marginal och axonal töjning mot lockmedel.
Aktin filament polymerisation beror på tillgången av tillräckliga aktin monomer och polymerisation atomkärnor eller aktin filament hullingförsedda slutar för tillsättning av monomer. Actin monomer finns i överflöd i chick retinal och dorsala ganglion (DRG) tillväxt kottar. Följaktligen ökar polymerisation snabbt när fri F-aktin taggtråd slutar blir tillgängliga för monomer tillägg. Detta sker i chick DRG och retinal kottar tillväxt via de lokala aktivering av F-aktin bryta proteinet aktin depolymerizing faktor (ADF / cofilin) i tillväxten konen regionen närmare ett lockmedel 8-10. Denna förhöjda ADF / cofilin aktivitet bryter aktin filament för att skapa nya F-aktin taggtråd ändar för polymerisation. Följande metod visar denna mekanism. Totala innehållet av F-aktin är synliga genom färgning med fluorescerande phalloidin. F-aktin taggtråd ändar synliga genom införlivandet av Rhodamine-aktin inom tillväxtområden koner som är permeabilized med det förfarande som beskrivs i följande, som är anpassad från tidigare studier av andra rörliga celler 11, 12. När Rhodamine-aktin läggs vid en koncentration över den kritiska koncentrationen för aktin monomerer Förutom taggtråd ändar, monterar Rhodamine-aktin på fri hullingar slutar. Om attraktiva Cue presenteras i en lutning, som släpps från en mikropipett placerad på ena sidan av en tillväxt kon, kommer införlivandet av Rhodamine-aktin på F-aktin taggtråd slutar vara större i tillväxten konen sidan mot mikropipetten 10 .
Tillväxt kottar är små och ömtåliga cellstrukturer. Förfarandena i permeabilization, Rhodamine-aktin bolagsordning, fixering och fluorescens visualisering är alla omsorgsfullt gjort och kan utföras på scenen av ett inverterat mikroskop. Dessa metoder kan tillämpas för att studera lokala aktin polymerisation i migrerar nervceller, andra primära celler vävnad eller cellinjer.
Protocol
För Rhodamine-aktin märkning är nervceller odlade på glas täckglas placeras i botten av 35 mm plastskålar, eller på täckglas limmas in i "video" rätter.
1. Beredning av Täckglas eller "Video" rätter
- Många neuronala typer är dåligt lim in vitro substrat. Glas täckglas, som krävs för detta förfarande, får inte tillräckligt neuron-substrat vidhäftning om de inte är tillräckligt rengjorda och förberedda. Ett detaljerat förfarande för syra tvätt-och rengöringsmedel glas täckglas finns beskrivet i Nerve boken Odling Cells, redigerad av Banker och Goslin. Alternativt är en nitrocellulosa beläggning för täckglas, som glupskt binder substrat molekyler, som beskrivs i steg 1,7 och 1,8 nedan.
- Glas täckglas (t.ex. 18 mm kvadratisk eller 24 mm cirklar) sköljs i dH 2 O och bakas i torr värme (≥ 225 ° C) så länge som möjligt (minst flera dagar upp till tre månader eller längre) för att avlägsna spår av organiska föreningar. Gå till steg 1,6 eller för video maträtter vidare till 1,3.
- För att skapa ett tunt genomskinligt glas substrat för hög upplösning videomicroscopy, är runda hål av lämplig diameter borras i botten på 35 eller 50 mm plast Petri eller vävnad rätter kultur med hjälp av en elektrisk kork borr (eller liknande instrument). Borrning sker långsamt med lätt tryck för att undvika sprickor i plasten. Kanter borrade hålet skrapas med en sax för att skapa en slät yta på båda sidor.
- Glas täckglas rengörs för vävnadsodling bruk, som beskrivs i 1,1 eller 1,2. Täckglas limmas på plats över hålen med hjälp av giftfria cement silikon akvariet (för 18x18mm täckglas, är en 12mm diameter lite används). Cementen är härdat i 24 timmar.
- (Följande steg görs med sterila förhållanden) Videon rätterna sköljas tre gånger med sterilt dH 2 O och får lufttorka.
- Täckglas är belagda med substrat molekyler för neuronala kultur. För det första är täckglas ytan belagd med (250 mikroliter för 18x18 täckglas) en lösning av 100 mikrogram / ml poly-D-lysin i PBS i 4-8 timmar (eller över natten) i en fuktig 38 ° C inkubator. Täckglas sedan sköljas tre gånger med sterilt dH 2 O för att avlägsna obundna poly-D-lysin och får lufttorka. Många neuronala typer odlas på täckglas belagd med poly-D-lysin ensam, om serumproteiner ingår i odlingsmedium. Men resultatet mer relevant för in vivo-förhållanden erhålls genom att använda naturliga substrat molekyler. Lösningar av dessa molekyler, såsom laminin, fibronektin eller L1 CAM (1-20 mikrogram / ml i PBS), kan direkt appliceras på poly-D-lysin belagd täckglas i 4-8 timmar eller över natten, men i vårt labb vi rutinmässigt belägga förberett täckglas med en tunn film av nitrocellulosa innan molekyler celladhesion att öka protein-substrat bindande.
- Gör en 1% nitrocellulosa genom att lösa 5 g nitrocellulosa i 5 ml 100% amylacetat. Applicera 10 mikroliter av denna lösning till täckglas och försiktigt sprida den över ytan. Lufttorka 10 minuter.
- Applicera 250 mikroliter av en lösning av 25 mikrogram / ml laminin eller 4 mikrogram / ml L1 CAM i PBS och fördelas över nitrocellulosa ytan. Inkubera 4 timmar (eller över natten) i en fuktig 38 ° C inkubator, aspirera substrat och omedelbart lägga odlingsmedium, så att substratet inte torkar.
2. Beredning av Neuronal kulturer
- Embryonala dag 7 kycklingembryon tas ur ägg, och placeras i 100 mm petriskålar innehållande odlingsmedium med 10% serum för dissekering för att ta bort de inre organen från bröstkorgen och buken, med hjälp av ett stereomikroskop.
- Embryona sedan sköljs med medium och flyttade till en 60 mm skålen med vätska och ytterligare dissekeras för att ta bort och förbereda explants av dorsalrotsganglier (DRG) eller neurala retinal vävnader. En detaljerad dissektion beskrivning finns i Metoder i cellbiologi, volym 71, neuroner: Metoder och applikationer för Cell Biolog, redigerad av Hollenbeck och Bamburg. DRG explants är 1/2-whole ganglier och neurala näthinnan explants är 1 mm eller mindre i diameter.
- Efter rengöring explants främmande vävnader, är individuella explants flyttade med urmakare pincett till täckglas, som redan i kultur rätter med substratet. Enligt en dissekera mikroskop är explantation försiktigt pressas till mitten av täckglaset med pincett för att förhindra rörelser under transport till inkubatorn. Explants odlas i F12 medium med B27 tillsatser, buffras med 10 mM HEPES till pH 7,4 och placeras över natten i en fuktig 38 ° C inkubator. Tillväxtfaktorer kan läggas till vid behov, till odlingsmedium. Neurotrofinernas som ofta läggs till DRG kulturer från äldre embryon, även E7 DRG nervceller kommer att förlänga axoner från explants utan tillsats neurotrofinernas. Explants av neurala näthinnan utöka axoner i denna kultur medium utan endding tillväxtfaktorer.
- Kulturer inkuberas i minst 18 timmar för att ge tillräcklig axonutväxt innan proceduren nedan.
3. Beredning av Rhodamine-aktin Permeabilization Buffer
- En stamlösning av permeabilization buffert innehållande 138 mm KCl, 10 mm rör, 3 mm EGTA, 4mm MgCl 2, och 1% BSA (pH = 6,9) kan hållas upp till 2 veckor vid 4 ° C11. Strax före användning, är följande komponenter läggas till för en slutlig koncentration av: 0,025% saponin, 0,1 mM ATP och 100 nM Alexa-fluor 350 phalloidin.
- En separat lösning är också beredas omedelbart före användning med samma komponenter plus 0.45μM Rhodamine icke-muskel actin Lösningen är omväxlande vortexed och tritrated i 5 minuter att lösa upp Rhodamine-aktin klumpar, och är vortexed i 1 min under den inledande permeabilization steget för att förhindra polymerisation i röret. Om det trots detta förblir glödtråden montering i röret ett problem, kan lösningen centrifugeras före användning.
4. Permeabilization av neuronala kulturer och Införlivande av Rhodamine-aktin på F-aktin Barbed Slutar
- En kultur fat med DRG eller retinala explants är försiktigt bort från inkubatorn och följande steg utföras vid rumstemperatur.
- Alla ändringar av lösningar måste göras noggrant. Pipettspetsen bör placeras i kanten av täckglaset och lösningar bör tas bort och läggas långsamt och med minimal kraft.
- Odlingsmediet tas bort med pipett försiktigt, men stadigt, och tillräckligt permeabilization buffert för att täcka celler läggs i 1 min (för 18mm x 18mm täckglas, ~ 60 mikroliter). Kulturen är inte sköljs med några andra lösningar innan du lägger till permeabilization buffert, och täckglas inte får torka innan du lägger till permeabilization buffert.
- Den permeabilization bufferten är försiktigt bort med pipett och ersättas med permeabilization buffert som innehåller 0,45 mikroM Rhodamine icke-muskel aktin för 4 min.
- Den Rhodamine-aktin som innehåller buffert är försiktigt bort med pipett, och de nervceller är fast genom att lägga till en lösning på 4% paraformaldehyd (laboratoriekvalitet gjorde med fosfatbuffert, pH 7,3), 0,05% glutaraldehyd och 10% sackaros. Efter 5 minuter fixering av täckglas är försiktigt sköljas med PBS, och monterade i Slowfade den 3-tums glas diabilder.
- En alternativ ansats till föränderliga lösningar är att använda ett flöde cell. Detta kan vara en kommersiellt tillgänglig flöde cell, eller en enkel flöde cell kan göras genom att placera små bitar av plast (≤ 1 mm tjock) som distanser i hörnen av täckglas, och sedan montera en lika stora täckglas ovanpå täckglas. Lösningar kan bytas genom att placera pipett på ena sidan av flödet cellen och återkalla lösningar med en veke (bomull eller en Kimwipe) på andra sidan.
- Införlivandet av Rhodamine-aktin på F-aktin hullingförsedda ändar och fluorescerande-phalloidin märkning av F-aktin tillväxt kottar visualiseras med epi-fluorescens optik genom en 60X oljeimmersion objektiv och bilder samlas in, med hjälp av en kyld CCD-kamera. En konfokalmikroskop kan ge förbättrad avbildning.
- För bästa kvantifiering av Rhodamine-aktin införliva alla bilder ska samlas i en enda session, med samma förstärkning och exponering av den digitala kameran känsligheten för varje bild. Analys av märkning bör göras från motsvarande regioner i varje bild, metamorfa, Bild J eller liknande datoriserade verktyg för bildanalys kan användas.
VARIANTER av detta förfarande
5. Variation ett: Samla levande cell bilder Före Rhodamine-aktin Labeling
- Video rätter är placeras på en varm mikroskop skede och leva tillväxt konen bilder samlas in. Inrutade täckglas kan användas, eller etsningar och / eller markeringar penna på täckglas kan göras för att lättare hitta specifika celler efter märkningen, eller videon skålen kan fästas på plats på mikroskop scenen under hela förfarandet.
- Permeabilization, inkorporering av Rhodamine-aktin, och cell fixering sker i videon skålen, antingen på eller utanför mikroskop scenen. Efter fastställande är PBS läggs till video rätter för omedelbar bildframställning. För att bevara prov för senare avbildning, är slowfade monteringsmedium läggs till täckglas och ett täckglas av samma storlek är försiktigt ovanpå (för att undvika bubblor), och att kanterna sedan förseglas med tydliga nagellack.
6. Variation Två: Immunokemisystem till Co-etikett Ytterligare Proteiner
- Rhodamine-aktin bildandet och fixering kan utföras på nervceller odlade på täckglas eller i video rätter, som beskrivits ovan (4,2-4,4).
- Efter fixering och sköljning i PBS, är celler som behandlats 15 min med 0,1 M glycin i PBS och sedan extraheras med 0,1% Triton X-100 (TX-100) i PBS med 2% get serum och 1% BSA, 1 h. Täckglasinkuberas med primära antikroppar som spätts i PBS som innehåller 1% BSA, 1 h. Den täckglas sedan sköljas och inkuberas i 0,1% TX-100 i PBS med 2% get serum och 1% BSA för 1 timme, innan fluorescerande sekundära antikroppar vid 1:1000 spädning i PBS med 1% BSA, 1 h. Efter sköljning, är täckglasen igen inkuberas i 0,1% TX-100 i PBS med 2% get serum och 1% BSA i 30 min, sköljde och monteras i anti-fading medium. Lokalisering av vissa proteiner störs av det första permeabilization steget (4,3). För att behålla dessa proteiner för lokalisering med antikroppar, 0,05% paraformaldehyd och 0,05% glutaraldehyd kan läggas till permeabilization buffert för 1 minut (dvs. före tillsats av Rhodamine-aktin) utan att det påverkar hullingförsedda slutet märkning av Rhodamine-aktin.
- Bilder av triple-märkt tillväxt kottar samlas in av fluorescens eller konfokalmikroskopi.
7. Variation Tre: Bedömning av effekterna av Vägledning Cues på F-aktin gratis Barbed Slutar
- En tillväxtfaktor eller vägledning kö läggs till kultur rätter i inkubatorn vid koncentrationer av flera ng / ml i några minuter (eller en lämplig behandling tid) innan du tar bort skålen från kuvösen och början permeabilization förfarande. Detta gör bedömningen av de kortsiktiga effekterna av tillväxtfaktorer eller ledtrådar vägledning om F-aktin utan hullingar slutar.
- En video fat med neuronala kulturer kan placeras på en varm mikroskop skede och tillväxtfaktorer eller ledtrådar vägledning kan frigöras från en mikropipett i en gradient nära en tillväxt kon innan den permeabilization och Rhodamine-aktin bolagsordningen. Till exempel kan NGF frigöras för DRG nervceller eller netrin för neurala retinal ganglion celler. Pipetten kan införas för så kort tid som 1-2 minuter innan du påbörjar permeabilization förfarande. Detta möjliggör utvärdering av de lokala effekterna av en vägledning kö lutning på bildandet av F-aktin fri taggtråd slutar i ledande tillväxt kotte marginaler (se referens citat 10 för bilder).
- Dessa variationer kan kombineras med antikroppsmedierat märkning av andra neuronala komponenter, som beskrivs i 6.2 ovan.
8. Variation fyra: F-aktin gratis Barbed End märkning på transfekterade Neuroner
- Användningen av konstitutivt aktiv eller dominant-negativa konstruktioner eller protein ÖVERVÄLDIGANDE använda RNAi (med ett fluorescerande identifiera markör) kan användas för att bedöma ett protein inblandning i regleringen av F-aktin utan hullingar slutar. Beroende på protein, dess lokalisering inom tillväxtområdet konen, och om det är smält till ett fluorescerande tagg kan den fluorescerande uttryckt proteinet i transfekterade cellerna gå förlorad vid permeabilization. Om så är fallet kan video rätter användas för att identifiera en transfekterade cell mikroskopiskt innan permeabilization och permeabilization kan utföras på mikroskop skede, efter märkning positioner transfekterade cellerna. Alternativt kan en GFP-aktin konstruera bli gemensamma transfererats med en GFP-konstruktion av intresse. I detta fall kommer GFP-aktin införlivas i F-aktin, och kommer inte att försvinna av permeabilization, vilket möjliggör identifiering av transfekterade celler efter permeabilization.
- Denna variation kan kombineras med tillägg av vägledning ledtrådar, som beskrivs i 7,1-7,3 ovan.
9. Representativa resultat
Figur 1. Global tillägg av NGF ökar totalt F-aktin och F-aktin hullingförsedda slutar vid tillväxt konen ledande marginal. När en DRG tillväxt kon stimuleras med nervtillväxtfaktor (NGF) i 5 minuter, aktin polymerisation stimuleras på de ledande marginal och ett ljust band av Rhodamine-aktin märkning ses runt tillväxten konen periferin. Figur 1 jämförs Rhodamine-aktin införlivande i en ostimulerade DRG tillväxt kon och en NGF-stimulerad DRG tillväxt konen. Den gröna fluorescens i det sammanslagna bilderna är phalloidin märkning för F-aktin i tillväxten konen och den röda är Rhodamine-aktin märkning. En bra kontroll för hullingförsedda slutet märkningen är att lägga till 10-6 M eller högre cytochalasin B eller D i permeabilization buffert i steg 4,2 och 4,3. Cytochalasins cap F-aktin hullingförsedda ändar och hämmar Rhodamine-aktin bindning till hullingar slutar. Detta bör kraftigt minska eller eliminera inkorporering av Rhodamine-aktin in i cellen. Skala barer, 10 mikrometer.
Figur 2. En NGF lutning ökar lokalt F-aktin hullingar slutar. En mikropipett som frigör NGF kommer till en sida av ett DRG tillväxt kotte i 2 minuter, följt av märkning av F-aktin utan hullingar slutar. Bilderna nedan visar att exponering för en lutning på NGF lokalt stimulerar en ökning av F-aktin fri hullingförsedda slutar i tillväxten konen regionen närmare pipett. Det sammanslagna Bilden visar phalloidin i gröntoch Rhodamine-aktin i rött. Skala Bar, 10 mikrometer.
Figur 3. Aktivt ERM proteiner ansamlas på tillväxten konen ledande marginal. Immuncytokemiska märkning av phospho-Ezrin/Radixin/Moesin (Perm) med F-aktin utan hullingar slutar. Gluteraldehyde (0,05%) och paraformaldehyd (0,05%) lades till det ursprungliga permeabilization buffert för en minut att bevara ERM lokalisering. Rhodamine-aktin, röd, Perm, grönt, phalloidin, blå. Skala Bar, 10 mikrometer.
Figur 4. Stimulering av aktin polymerisation kräver aktiv ERM proteiner. Gavs samtidigt transfererats med GFP-aktin och en GFP kontroll plasmid eller en dominant-negativ Ezrin / Radixin / Moesin (DN ERM) konstruera dissocierade DRG. Användningen av GFP-aktin medger identifiering av transfekterade celler efter permeabilization. Här var NGF lagt till 5 min före märkning av F-aktin hullingar slutar. Notera tillväxt konen transfekterade med DN ERM har minskat taggtråd slutet nivåer på tillväxten konen ledande marginal (lägre mellersta panelen), som kontrast till en närliggande untransfected tillväxt konen (lägre paneler), eller med GFP-kontroll (övre mitten panelen). Rhodamine-aktin, röd, GFP-aktin, grön. Skala barer, 10 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder som presenteras här kan tidsmässiga och rumsliga upplösningen i cellulära komponenter som ingår i den dynamiska ombyggnaden av aktin cytoskelettet på ledande marginalen att migrera tillväxt kottar. Den handling av lockbete molekyler, såsom NGF eller netrin, att snabbt stimulera aktin filament polymerisation avslöjas som en lokal ökning av aktin taggtråd slutar, skapad av aktin filament bryta av aktivt ADF / cofilin 10, som visas i figur 1 och 2. Metoden möjliggör lokalisering av andra proteiner inblandat i chemotropic tillväxt kotte reaktioner, såsom radixin, en ERM-protein, avbildad i figurerna 3 och 4. Dessa metoder kan också tillämpas för att analysera regleringen av aktin-baserade motilitet i vandrande nervceller, gliaceller eller andra celltyper.
Den känsliga natur tillväxt koner eller andra små rörliga strukturer är en betydande begränsning i användningen av denna metod. Tillväxt kon ledande marginaler eller liknande rörliga delar av celler innehåller några strukturella andra element än aktin filament och plasmamembran, så måste man vara försiktig vid varje steg. Cell aggregat eller explants kan störas av förändringar i ytspänning, liksom lösningar utväxlas. Som nämndes i protokollet, är det bäst att placera pipetter vid kanten av täckglas för att byta lösningar, samt användning av ett flödescell skulle eliminera problem från yta spänningar.
En alternativ metod för att visualisera aktin taggtråd slutar i rörliga delar av celler innebär cell transfektion att uttrycka fluorescerande analoger av hullingar slut-bindande proteiner, t.ex. Ena / VASP eller myosin X. Dock kan aktin dynamik i marginalerna tillväxt kotte ändras genom oreglerade uttryck av dessa aktin reglerande proteiner.
Filopodia är inte lika starkt märkta av denna Rhodamine-aktin märkning metod som är lamellipodia. Den filopodia kan störas, även om de är märkta och stabiliserats med den fluorescerande-phalloidin finns i permeabilization buffert. Denna skillnad i lamellipodial vs filopodial inkorporering av Rhodamine-aktin kan återspegla en kvantitativ begränsning i visualisering av ingående Rhodamine-aktin, eller det kan finnas en skillnad i närvaro av hullingförsedda slutet tak proteiner i dessa rörliga strukturer. Detta väcker ytterligare en begränsning att märkningen av fria hullingar slutar med den här metoden inte avslöja om den märkta hullingförsedda ändarna nyetablerade, till exempel genom ADF / cofilin skära av F-aktin, eller om F-aktin inte skiljas men taggtråd slutar frigörs genom avskaffande av hullingförsedda slutet tak proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr James Bamburg och medlemmar av hans laboratorium för samverkan i dessa studier. Detta arbete har finansierats av NIH bidrag HD19950, EY07133 och med bidrag från Minnesota Medical Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18x18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | |
| 35mm Petri dishes | Falcon BD | 351008 | |
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | |
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| L1 CAM | R&D Systems | 777-NC | |
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen | A22281 | |
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | |
| F12 Culture medium | Invitrogen | 21700-075 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Letourneau, P. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. Encyclopedia of Neuroscience. Squire, L. R. , Academic Press. Oxford. 1139-1145 (2008).
- Kalil, K., Dent, E. W. Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton. Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40, 209-227 (2003).
- Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. Actin-binding proteins take the reins in growth cones. Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).
- Guan, K. L., Rao, Y. Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).
- Gallo, G., Letourneau, P. C. Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues. J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).
- Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin. Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).
- Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. ADF/cofilin: A functional node in cell biology. Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).
- Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1. Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).
- Symons, M. H., Mitchison, T. J. Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts. J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).
- Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells. J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).
