Summary
שיטה לחזות ולכמת F-אקטין מסתיים דוקרני קונוסים הצמיחה העצבית מתוארת. לאחר נוירונים culturing על coverslips זכוכית, תאים permeabilized עם פתרון saponin המכילים. ואז, דגירה קצר עם למאגר saponin המכיל rhodamine-אקטין משלבת אקטין פלואורסצנטי על קצות אקטין חינם תיל.
Abstract
טיפים ניעתי של אקסונים הגוברת נקראים גביעי צמיחה. קונוסים צמיחה להוביל בניווט אקסונים דרך הרקמות המתפתחות על ידי אינטראקציה עם ביטוי מקומי רמזים הדרכה המולקולרי אשר נקלטות חרוט קולטנים הצמיחה להסדיר את הדינמיקה ארגון של חרוט צמיחה cytoskeleton 3-6. היעד העיקרי של האותות הללו ניווט היא נימה אקטין meshwork הממלא את חרוט צמיחה בפריפריה וכי כוננים חרוט צמיחה תנועתיות באמצעות פילמור אקטין מתמשכת שיפוץ דינמי 7. רמזים הדרכה חיובית או אטרקטיבי לגרום חרוט צמיחה מפנה ידי גירוי אקטין נימה (F-אקטין) פילמור באזור הפריפריה צמיחה חרוט כי הוא קרוב יותר למקור של המקל attractant. זה פילמור אקטין כוננים הצמיחה המקומית חרוט בליטה, הדבקה של השוליים המובילים התארכות axonal כלפי attractant.
פילמור אקטין נימה תלוי בזמינות של מונומר אקטין מספיק על גרעינים פילמור או חוט תיל אקטין מסתיים עבור תוספת של מונומר. מונומר אקטין זמין בשפע הגנגליון ברשתית ואת השורש הגבי חומוס (DRG) קונוסים צמיחה. כתוצאה מכך, גדל במהירות כאשר פילמור חינם F-אקטין מסתיים תיל להיות זמינים בנוסף מונומר. זה מתרחש חומוס DRG קונוסים צמיחה הרשתית באמצעות הפעלת המקומית של ה-F-אקטין אקטין ניתוק חלבון depolymerizing גורם (ADF / cofilin) באזור הגידול חרוט קרוב 8-10 attractant. זו פעילות מוגברת ADF / cofilin מנתקת סיבי אקטין ליצור חדש F-אקטין מסתיים תיל פילמור. השיטה הבאה ממחישה את המנגנון הזה. תוכן הכולל של ה-F-אקטין הוא מדמיין על ידי צביעה עם phalloidin ניאון. F-אקטין מסתיים תיל הם דמיינו על ידי שילוב של אקטין rhodamine בתוך קונוסים צמיחה כי הם permeabilized עם ההליך המתואר להלן, אשר מותאם ממחקרים קודמים של תאים אחרים ניעתי 11, 12. כאשר rhodamine-אקטין נוסף בריכוז מעל ריכוז קריטי בנוסף מונומר אקטין מסתיים תיל, rhodamine-אקטין מרכיבה על קצות התיל חינם. אם קיו אטרקטיבית מוצג שיפוע, כגון ששוחרר micropipette ממוקם בצד אחד של חרוט צמיחה, שילוב של rhodamine-אקטין על ה-F-אקטין קצוות התיל יהיה גדול בצד חרוט הצמיחה כלפי micropipette 10 .
קונוסים הצמיחה הם מבנים תאים קטנים ועדינים. הנהלים של permeabilization קיבעון rhodamine-אקטין, שילוב ויזואליזציה הקרינה הם עשו בקפידה ניתן לבצע על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה. שיטות אלה ניתן ליישם לומד פילמור אקטין המקומית נוירונים נודדים, תאים ורקמות אחרות ראשוני או שורות תאים.
Protocol
עבור תיוג rhodamine-אקטין, הנוירונים תרבותי על coverslips זכוכית ממוקם בתחתית צלחות פלסטיק 35 מ"מ, או מודבק על coverslips לתוך מנות "וידאו".
1. הכנת Coverslips או מנות "וידאו"
- סוגי נוירונים רבים דבק גרוע במבחנה מצעים. Coverslips זכוכית, אשר נדרשים לצורך הליך זה, לא יכול לאפשר הדבקה מספיק נוירון-המצע אלא אם כן הם ניקו כראוי ומוכן. נוהל מפורט עבור חומצה כביסה וניקוי coverslips זכוכית מתואר בספר culturing לתאי עצב, בעריכת הבנקאי Goslin. לחילופין, ציפוי nitrocellulose עבור coverslips, אשר נקשר בשקיקה מולקולות המצע, מתואר צעדים 1.7 ו 1.8 להלן.
- זכוכית coverslips (למשל 18 מ"מ או 24 ריבועים עיגולים מ"מ) הם ושטף DH 2 O ו אפויים בחום יבש (≥ 225 ° C) ארוכה ככל האפשר (מינימום של מספר ימים עד שלושה חודשים או יותר) כדי להסיר עקבות של אורגני תרכובות. עבור לשלב 1.6 או מנות וידאו להמשיך 1.3.
- כדי ליצור מצע דק זכוכית שקופה עבור videomicroscopy ברזולוציה גבוהה, חורים עגולים בקוטר המתאים הם קדחו לתוך תחתית של פטרי 35 או 50 מ"מ פלסטיק או תרבות מנות רקמות באמצעות מקדח חשמלי הפקק (או מכשיר דומה). הקידוח נעשה לאט עם לחץ קל כדי למנוע פיצוח הפלסטיק. קצוות של החור קדח הם שרטו במספריים כדי ליצור משטח חלק משני הצדדים.
- Coverslips זכוכית מנקים לשימוש בתרבית רקמה, כמתואר 1.1 או 1.2. Coverslips מודבקים במקום על חורים, באמצעות רעיל לאקווריום סיליקון מלט (עבור coverslips 18x18mm, קצת בקוטר 12 מ"מ משמש). המלט הוא נרפא במשך 24 שעות.
- (השלבים הבאים הם עשו שימוש בתנאים סטריליים) המנות וידאו שטופים 3 פעמים עם סטרילי DH 2 O ו מותר אוויר יבש.
- Coverslips הם מצופים במולקולות המצע לתרבות עצביים. ראשית, פני השטח coverslip מצופה (250 μL עבור 18x18 coverslip) פתרון של 100 מיקרוגרם / מ"ל poly-D-ליזין ב PBS עבור 4-8 שעות (או לילה) בתוך humidified 38 ° C חממה. Coverslips הם שטופים אז 3 פעמים עם סטרילי DH 2 O להסיר מאוגד poly-D-ליזין מותר אוויר יבש. סוגי נוירונים רבים בתרבית על coverslips מצופה פולי-D-ליזין לבד, אם חלבונים בסרום כלולים בינוני התרבות. עם זאת, תוצאות רלוונטיות יותר בתנאים vivo מתקבלים באמצעות מולקולות המצע הטבעי. פתרונות של מולקולות אלה, כגון laminin, פיברונקטין או L1-CAM (10-20 מיקרוגרם / מ"ל PBS), ניתן ליישם ישירות poly-D-ליזין coverslips מצופה עבור 4-8 שעות או למשך הלילה, אבל במעבדה שלנו אנו שגרתי המעיל coverslips מוכן עם סרט דק של nitrocellulose לפני החלת מולקולות הדבקה תא להגדיל חלבון המצע מחייב.
- בצע פתרון nitrocellulose 1% על ידי המסת 5 nitrocellulose גרם 5 מ"ל של אצטט amyl 100%. החל 10 μL של פתרון זה coverslip בעדינות להפיץ אותו מעל פני השטח. האוויר יבש 10 דקות.
- החלת 250 μL של פתרון של 25 מיקרוגרם / מ"ל laminin או 4 מיקרוגרם / מ"ל L1-CAM ב PBS ולהתפשט על פני השטח nitrocellulose. דגירה 4 שעות (או לילה) בתוך humidified 38 ° C חממה, המצע לשאוב ומיד להוסיף בינוני תרבות, ולכן המצע אינו יבש.
2. הכנת תרבויות העצבית
- עובריים 7 יום עוברים חומוס יוסרו ביצים, ממוקם 100 מ"מ צלחות פטרי המכילות בינוני תרבות עם סרום 10% לנתיחה כדי להסיר את האיברים הפנימיים של בית החזה והבטן, באמצעות stereomicroscope.
- עוברים הם שטופים אז עם המדיום ועבר צלחת 60 מ"מ עם מדיום נוזלי גזור נוספת כדי להסיר ולהכין explants של הגרעינים השורש הגבי (DRG) או רקמות הרשתית העצבית. תיאור מפורט לנתיחה ניתן למצוא שיטות בביולוגיה של התא, בנפח 71, נוירונים: שיטות יישומים עבור הביולוג Cell, בעריכת הולנבק ו Bamburg. Explants DRG הם הגרעינים 1/2-whole ו explants הרשתית העצבית הם 1 מ"מ או פחות קוטר.
- לאחר ניקוי explants של רקמות זרים, explants בודדים עברה עם מלקחיים שענים על coverslips, אשר כבר נמצאים הכלים תרבות עם המדיום לתרבות. תחת מיקרוסקופ לנתח, explant היא לחצה בעדינות למרכז coverslip עם מלקחיים כדי למנוע תנועה תוך הובלת אל האינקובטור. Explants הם בתרבית בינוני F12 עם תוספים B27, שנאגרו עם 10 HEPES מ"מ עד pH 7.4 והניח לילה humidified 38 ° C חממה. גורמי גדילה ניתן להוסיף, לפי הצורך, עד בינוני התרבות. Neurotrophins מתווספים לעתים קרובות DRG תרבויות מעוברים מבוגר, למרות E7 נוירונים DRG ירחיבו אקסונים מ explants ללא neurotrophins הוסיף. Explants של הרשתית העצבית להאריך אקסונים במדיום תרבות זו ללאdding גורמי גדילה.
- תרבויות מודגרת במשך לפחות 18 שעות כדי לאפשר תוצאה axonal מספיק לפני תחילת ההליך בהמשך.
3. הכנת מאגר Rhodamine-אקטין Permeabilization
- פתרון המניות של חיץ permeabilization המכיל 138 mM KCl, 10 צינורות מ"מ, 3 מ"מ EGTA, 4mm MgCl 2, BSA 1% (pH = 6.9) ניתן לשמור עד 2 שבועות 4 ° C11. רק לפני השימוש, על הרכיבים הבאים מתווספים ריכוז סופי: saponin 0.025%, 0.1 mM ATP, ו - 100 ננומטר-Alexa פלואוריד 350 phalloidin.
- פתרון נפרד הוא גם מוכן טרי רק לפני השימוש עם רכיבים אלה זהה בתוספת rhodamine 0.45μM הלא שריר אקטין הפתרון הוא vortexed לסירוגין tritrated 5 דקות לפזר rhodamine-אקטין גושים, והוא vortexed דקות 1 במהלך השלב הראשוני permeabilization כדי למנוע פילמור בצינור. אם למרות זאת, הרכבה נימה בצינור נותרה בעיה, הפתרון יכול להיות centrifuged לפני השימוש.
4. Permeabilization תרבויות עצב התאגדות של אקטין Rhodamine על ה-F-אקטין מסתיים דוקרני
- צלחת עם תרבות explants DRG או הרשתית מוסרת בזהירות מן החממה את הפעולות הבאות מבוצעות בטמפרטורת החדר.
- שינויים כל הפתרונות חייב להיעשות בזהירות. טיפ פיפטה צריך להיות ממוקם בקצה coverslip, פתרונות יש להסיר והוסיף לאט עם כוח מינימלי.
- בינוני התרבות מוסר על ידי פיפטה בזהירות, אך בהתמדה, חיץ permeabilization מספיק כדי לכסות את התאים הוא הוסיף דקות 1 (עבור coverslip x 18mm 18mm, ~ 60 μL). תרבות אינה שטפה עם כל פתרונות אחרים לפני הוספת חיץ permeabilization, ואת coverslip אסור יבש לפני הוספת חיץ permeabilization.
- המאגר permeabilization מוסר בעדינות על ידי פיפטה והוחלפו למאגר permeabilization המכיל 0.45 rhodamine מיקרומטר הלא שריר אקטין דקות 4.
- Rhodamine-אקטין המכיל מאגר מוסר בעדינות על ידי פיפטה, את הנוירונים קבוע על ידי הוספת פתרון paraformaldehyde של 4% (מעבדה כיתה, עשה עם חיץ פוספט, pH 7.3), glutaraldehyde 0.05% ו 10% סוכרוז. לאחר קיבוע 5 דקות coverslips הם שטופים בעדינות עם PBS, ועלה ב Slowfade על 3 אינץ' שקופיות הזכוכית.
- גישה חלופית פתרונות שינוי היא להשתמש התא זרימה. זה יכול להיות התא זרימה זמינים מסחרית, או תא זרימה פשוט יכול להתבצע על ידי הנחת חתיכות קטנות של פלסטיק (≤ 1 מ"מ עובי), כמו מפרידי בפינות coverslip, ולאחר מכן הרכבה coverslip שווים בגודלם על גבי coverslip. פתרונות ניתן להחליף על ידי הנחת פיפטה בצד אחד של התא זרימה נסיגה פתרונות עם הפתיל (כותנה או Kimwipe) על הצד השני.
- שילוב של אקטין rhodamine על ה-F-אקטין מסתיים דוקרני ניאון phalloidin תיוג של אקטין-F ב קונוסים הצמיחה דמיינו עם עלית פלואורסצנציה אופטיקה דרך יעד שמן 60x טבילה, ותמונות נאספים, באמצעות מצלמה מקורר CCD. מיקרוסקופ confocal עשויה לספק הדמיה משופרת.
- עבור כימות הטוב ההתאגדות rhodamine-אקטין כל התמונות יש לאסוף בפגישה אחת, באמצעות לזכות אותו והגדרות חשיפה רגישות המצלמה הדיגיטלית עבור כל תמונה. ניתוח של תיוג צריך להיעשות מאזורים המקבילה של כל תמונה; Metamorph, תמונה J או כלים ממוחשבים לניתוח תמונה דומה ניתן להשתמש.
וריאציות של הליך זה
5. וריאציה אחת: איסוף תמונות תא חי לפני תיוג Rhodamine-אקטין
- מנות וידאו ממוקמות לבמה מיקרוסקופ התחמם, וחיים חרוט צמיחה תמונות נאספים. Coverslips Gridded ניתן להשתמש, או תחריטים ו / או סימני עט על coverslip יכול להתבצע בקלות רבה יותר למצוא תאים ספציפיים לאחר תיוג, או את המנה וידאו יכול להיות קבוע במקומו על הבמה מיקרוסקופ למשך ההליך.
- , Permeabilization שילוב של אקטין rhodamine, וכן קיבוע תא נערכים בצלחת וידאו, או כבוי הבמה מיקרוסקופ. לאחר תיקון, PBS מתווסף מנות וידאו הדמיה מיידית. כדי לשמר את המדגם עבור הדמיה מאוחר יותר, בינוני slowfade הרכבה מתווסף coverslip לבין coverslip בגודל זהה מונחת בעדינות על גבי (הימנעות בועות), ואת הקצוות סגורים אז עם לק ברור.
6. וריאציה שני: Immunochemistry לשתף תווית חלבונים נוספים
- Rhodamine-אקטין ההתאגדות ואת הקיבעון יכול להתנהל על נוירונים בתרבית על coverslips או מנות וידאו, כמתואר לעיל (4.2-4.4).
- לאחר קיבוע, ושטיפה של PBS, תאים מטופלים 15 דקות עם 0.1 M גליצין ב PBS ולאחר מכן חילוץ עם 0.1% Triton X-100 (TX-100) ב-PBS עם סרום עז 2% ו -1% עבור BSA 1 ח Coverslipsמודגרת עם נוגדנים העיקרי מדולל PBS BSA המכיל 1% ל 1 ח Coverslips הם שטופים אז מודגרות ב 0.1% TX-100 ב-PBS עם סרום עז 2% ו BSA 1% עבור 1 שעה, לפני החלת פלורסנט נוגדנים משני בדילול 1:1000 ב-PBS עם BSA 1% ל 1 ח לאחר השטיפה, coverslips מודגרת שוב עם סרום עז 2% ו BSA 1% למשך 30 דקות ב 0.1% TX-100 ב-PBS, שטופים, ועלה במדיום נגד דהייה. לוקליזציה של חלבונים מסוימים מופרת על ידי לשלב permeabilization הראשונית (4.3). כדי לשמר את החלבונים האלה עבור לוקליזציה עם נוגדנים, paraformaldehyde 0.05% ו 0.05% glutaraldehyde ניתן להוסיף למאגר permeabilization דקות 1 (כלומר, לפני הוספת rhodamine-אקטין) מבלי להשפיע על תיוג סוף דוקרני על ידי אקטין rhodamine.
- תמונות של קונוסים צמיחה משולשת שכותרתו נאספים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal.
7. וריאציה שלישי: הערכה של ההשפעות של רמזים הדרכה על ה-F-אקטין מסתיים דוקרני חינם
- גורם גדילה או קיו הדרכה מתווסף מנות התרבות בחממה בריכוזים של ננוגרם למ"ל מספר / לכמה דקות (או זמן הטיפול המתאים) לפני הסרת צלחת מן החממה בתחילת ההליך permeabilization. זה מאפשר הערכה של ההשפעות קצרות הטווח של גורמי גדילה או רמזים הדרכה על ה-F-אקטין מסתיים דוקרני חינם.
- צלחת וידאו עם תרבויות העצבית ניתן להציב על הבמה מיקרוסקופ מחוממת, גורמי גדילה או רמזים הדרכה יכולים להשתחרר micropipette ב שיפוע ליד חרוט צמיחה לפני תחילת permeabilization rhodamine ו-אקטין ההתאגדות. לדוגמה, NGF ניתן לשחרר עבור DRG נוירונים או netrin עבור תאים עצביים הגנגליון ברשתית. פיפטה ניתן הציג עבור קצר ככל 1-2 דקות לפני תחילת ההליך permeabilization. זה מאפשר הערכה של השפעות מקומיות של מפל הדרכה רמז על היווצרות של ה-F-אקטין מסתיים תיל חופשי חרוט שולי הגידול המוביל (ראה הציטוט התייחסות 10 עבור תמונות).
- שינויים אלה יכול להיות משולב עם תיוג נוגדן בתיווך של רכיבים עצביים אחרים, כמתואר לעיל 6.2.
8. וריאציה ד ': ה-F-אקטין תיוג חינם סוף דוקרני על נוירונים transfected
- השימוש בונה פעיל constitutively או דומיננטי שלילי או מציאה חלבון באמצעות RNAi (בטוש לזיהוי פלורסנט) ניתן להשתמש כדי להעריך את מעורבותו של החלבון בוויסות F-אקטין מסתיים דוקרני חינם. בהתאם החלבון, לוקליזציה שלה בתוך חרוט הצמיחה, אם הוא התמזגו לתג פלורסנט, החלבון הביעו פלורסנט בתאים transfected עלולים ללכת לאיבוד על permeabilization. אם זה המקרה, מנות וידאו שניתן להשתמש בהם כדי לזהות תא transfected מיקרוסקופית לפני permeabilization, ואת permeabilization יכול להתבצע על הבמה מיקרוסקופ, לאחר המציינת את מיקומם של תאים transfected. לחלופין, לבנות GFP-אקטין יכול להיות שותף transfected עם GFP-לבנות עניין. במקרה זה, ה-GFP-אקטין ישולבו F-אקטין, ולא יאבדו ידי permeabilization, המאפשרת זיהוי של תאים transfected לאחר permeabilization.
- וריאציה זו יכולה להיות משולבת עם תוספת של רמזים הדרכה, כמתואר 7.1-7.3 לעיל.
9. נציג תוצאות
באיור 1. תוספת גלובלית של NGF מגדיל מסך ה-F-אקטין ו-F-אקטין מסתיים דוקרני בשוליים חרוט צמיחה מוביל. כאשר חרוט צמיחה DRG מגורה עם גורם הגדילה העצבי (NGF) במשך 5 דקות, פילמור אקטין מגורה בשוליים המובילים, הלהקה בהיר של תיוג rhodamine-אקטין נתפסת סביב בפריפריה חרוט צמיחה. תרשים 1 משווה rhodamine-אקטין הכללתו גביע unstimulated DRG צמיחה גביע NGF-מגורה צמיחה DRG. פלואורסצנטי ירוק את התמונות הממוזג תיוג phalloidin עבור אקטין-F בחרוט הצמיחה אדום הוא rhodamine-אקטין תיוג. שליטה טובה עבור תיוג סוף דוקרני היא להוסיף M 10-6 ומעלה cytochalasin B או D במאגר permeabilization צעדים 4.2 ו 4.3. Cytochalasins כובע F-אקטין מסתיים דוקרני לעכב rhodamine-אקטין מחייב מסתיים תיל. זה אמור קשות לצמצם או למנוע שילוב של אקטין rhodamine לתוך התא. סולם ברים, 10 מיקרומטר.
איור 2. שיפוע NGF מקומי מגביר F-אקטין קצוות התיל. Micropipette המשחרר NGF מובא בצד אחד של חרוט צמיחה DRG במשך 2 דקות, ואחריו תיוג של ה-F-אקטין מסתיים דוקרני חינם. התמונות למטה מראות כי חשיפה שיפוע של NGF מקומית מגרה עלייה F-אקטין מסתיים דוקרני חינם באזור צמיחה חרוט קרוב פיפטה. התמונה מראה הממוזגת phalloidin בירוקו rhodamine-אקטין באדום. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר.
איור 3. חלבונים הופעל ERM להצטבר בשוליים חרוט צמיחה מוביל. תיוג Immunocytochemical של phospho-Ezrin/Radixin/Moesin (פרם) עם ה-F-אקטין מסתיים דוקרני חינם. Gluteraldehyde (0.05%) ו paraformaldehyde (0.05%) נוספו למאגר permeabilization הראשונית דקות אחד לשמר לוקליזציה ERM. Rhodamine-אקטין, אדום, פרם, ירוק; phalloidin, כחול. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר.
איור 4. גירוי של פילמור אקטין דורש חלבונים ERM פעיל. DRGs ניתק היו שיתוף transfected עם GFP-אקטין שליטה GFP פלסמיד או דומיננטי שלילי Ezrin / Radixin / Moesin (DN ERM) לבנות. השימוש של ה-GFP-אקטין מאפשרת זיהוי תאים transfected לאחר permeabilization. הנה, היה NGF הוסיף 5 דקות לפני תיוג של ה-F-אקטין מסתיים תיל. שים לב חרוט צמיחה transfected עם ד.נ. ERM הפחיתה רמות סוף דוקרני בשוליים חרוט צמיחה מוביל (פאנל הבינוני הנמוך), אשר בניגוד חרוט צמיחה הסמוכים untransfected (לוחות נמוך יותר), או עם שליטה GFP (פאנל הבינוני העליון). Rhodamine-אקטין, אדום, GFP-אקטין, ירוק. סולם ברים, 10 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטות שהוצגו כאן לאפשר ברזולוציה של זמן ומרחב של מרכיבים תאיים המעורבים בשיפוץ הדינמי של cytoskeleton אקטין בשוליים מובילה של נודדות קונוסים צמיחה. הפעולה של מולקולות attractant, כמו NGF או netrin, במהירות כדי לעורר פילמור אקטין נימה מתגלה גידול מקומי מסתיים אקטין תיל, נוצר על ידי ניתוק חוט אקטין מופעל על ידי ADF / cofilin 10, כפי שמוצג איורים 1 ו -2. השיטה מאפשרת לוקליזציה של חלבונים אחרים המעורבים בתיווך חרוט צמיחה התגובות chemotropic, כגון radixin, חלבון ERM, בתמונה במספרים 3 ו -4. שיטות אלה יכול להיות מיושם גם לנתח את הסדרת תנועתיות אקטין מבוססי בנוירונים נודדות, ותאי גלייה או סוגי תאים אחרים.
האופי העדין של קונוסים צמיחה או מבנים אחרים ניעתי קטן הוא מגבלה משמעותית של השימוש בשיטה זו. חרוט הצמיחה שולי מובילים או אזורים ניעתי דומה של תאים מכילים אלמנטים מבניים אחדים אחר מאשר סיבי אקטין את הממברנה הפלסמטית, ולכן יש להקפיד על כל צעד ושעל. אגרגטים נייד או explants עשויה להיות מופרת על ידי שינוי מתח הפנים, כמו פתרונות מוחלפים. כאמור בפרוטוקול, עדיף למקם pipettes בקצה coverslips לשינוי פתרונות, ושימוש התא זרימה היה למנוע בעיות של מתחים על פני השטח.
שיטה חלופית לדמיין מסתיים אקטין דוקרני באזורים ניעתי של תאים כרוך transfection תא להביע אנלוגים הניאון של סוף מחייבת חלבונים תיל, כגון Ena / VASP או שרירן X. עם זאת, הדינמיקה אקטין בשוליים חרוט צמיחה ניתן לשנות על ידי ביטוי מוסדרת של החלבונים האלה אקטין הרגולציה.
Filopodia אינם כפי שכותרתו במידה רבה על ידי שיטה rhodamine-אקטין זה תיוג כמו גם lamellipodia. Filopodia עשויה להיות מופרת, למרות שהם מסומנים ו מיוצב על ידי phalloidin ניאון הכלול למאגר permeabilization. זה ההבדל ההתאגדות לעומת lamellipodial filopodial של אקטין rhodamine עשוי לשקף מגבלה כמותית להדמיה של שולבו rhodamine-אקטין, או ייתכן שיש הבדל בנוכחות סוף דוקרני מכסת החלבונים מבנים אלה ניעתי. זה מעלה מגבלה נוספת כי תיוג של קצוות תיל חופשי עם שיטה זו אינה מגלה אם מסתיים דוקרני שכותרתו נוצרים חדשים, כגון על ידי ניתוק ADF / cofilin של ה-F-אקטין, או אם ה-F-אקטין לא ניתק אלא מסתיים דוקרני הם שוחררו על ידי הסרה של סוף דוקרני מכסת החלבונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מודים לד"ר ג'יימס Bamburg ואנשי המעבדה שלו לשיתוף פעולה במחקרים אלה. עבודה זו מומנה על ידי מענקים NIH HD19950, EY07133 ועל ידי תרומות של קרן רפואית מינסוטה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18x18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | |
| 35mm Petri dishes | Falcon BD | 351008 | |
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | |
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| L1 CAM | R&D Systems | 777-NC | |
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen | A22281 | |
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | |
| F12 Culture medium | Invitrogen | 21700-075 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Letourneau, P. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. Encyclopedia of Neuroscience. Squire, L. R. , Academic Press. Oxford. 1139-1145 (2008).
- Kalil, K., Dent, E. W. Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton. Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40, 209-227 (2003).
- Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. Actin-binding proteins take the reins in growth cones. Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).
- Guan, K. L., Rao, Y. Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).
- Gallo, G., Letourneau, P. C. Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues. J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).
- Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin. Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).
- Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. ADF/cofilin: A functional node in cell biology. Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).
- Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1. Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).
- Symons, M. H., Mitchison, T. J. Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts. J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).
- Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells. J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).
