Summary
تم تصنيعها من indinavir النانوية ، ريتونافير ، وايفافيرنز atazanavir باستخدام الطحن الرطب ، والتجانس وultrasonication. هذه nanoformulations ، ووصف العلاج المضاد للفيروسات بشكل جماعي nanoformulated (nanoART) ، المقررة بلعم المستندة إلى تسليم المخدرات. وتم تحديد الوحيدات المستمدة من امتصاص nanoART بلعم والاحتفاظ بهم والإفراج المستمر. هذه الدراسات الأولية تشير إلى إمكانات nanoART للاستخدام السريري.
Abstract
يمكن للعقاقير الدوائية وNanoformulated تحسين التوافر البيولوجي في حين يعمل أيضا للحد من السميات المخدرات عن الأدوية (ART) المضاد للفيروس. ولهذه الغاية ، وقد طبقت مختبرنا مبادئ النانوي لتبسيط نظم ART وعلى هذا النحو في حين خفض السميات تحسين الامتثال والمخدرات الدوائية. وتظهر وسائل بسيطة وموثوق بها لتصنيع nanoformulated ART (nanoART). يتم تغليف جزيئات المخدرات النقي بواسطة طبقة رقيقة من الطلاء الدهني السطحي والتي تنتجها تجزئة بلورات أكبر المخدرات في أصغر حجما من قبل أي من الطحن الرطب أو التجانس ذات الضغط العالي. في أسلوب بديل يوقف الدواء مجانا في قطيرة من البوليمر. هنا ، هو حل المخدرات داخل البوليمر المهتاج ثم ultrasonication حتى تتشكل قطرات nanosized الفردية. ديناميكية تشتت الضوء والفحص المجهري تميز الخصائص الفيزيائية للجزيئات (حجم الجسيمات ، والتهمة والشكل). ويتم تحديد الخصائص البيولوجية الخاصة بهم (امتصاص الخلايا والاحتفاظ بها ، وفعالية المضادة للفيروسات السمسة) مع الضامة الوحيدات المستمدة من الإنسان (MDM). وتستمد من MDM حيدات الإنسان الدموية المحيطية معزولة عن leukopacks تصويل باستخدام الطرد المركزي لتنقية. ويمكن استخدام مثل هذه التي يحملها الدم الضامة كما نقل الخلوية للتوزيع nanoART على فيروس نقص المناعة البشرية (الإيدز) الأجهزة المصابة. نحن يفترض أن تحزيم من الأدوية المضادة للفيروسات المتاحة سريريا في النانوية لHIV - 1 العلاجات قد تحسن الامتثال وينعكس إيجابا على نتائج المرض.
Protocol
NanoART تصنيع
1. الرطب NanoART طحن بواسطة طرق MicroCer NETZSCH
- وزن بلورات المخدرات والسطحي المختلفة التي سيتم استخدامها لجعل nanoformulations باستخدام رصيد التحليلية ومزجها مع 10 ملي Hepes العازلة ، ودرجة الحموضة 7.8 باستخدام T - 18 خلاطة Ultraturrax حتى فرقت تماما. وينبغي في المئة من المخدرات في صياغة ما بين 1-2 ٪.
- لطحن المستمر ، تأكد من أن المبرد والضاغط على. وينبغي أن يكون منفذا للضغط نحو 100 PSI قبل البدء في طاحونة عينتك.
- تشغيل وحدة التحكم وتدوير الدبابة طحن بحيث يمكن تحميل وسائل الاعلام طحن في الخزان.
- إضافة 50 مل من الخرز إلى غرفة الطحن باستخدام القمع. تأكد من أنه لا توجد حبات في المواضيع أو في أي مكان خارج غرفة طحن لتجنب تسرب في ختم الميكانيكية.
- تأكد من أن O - الدائري هو في مكانه في غرفة الطحن. حدد حجم الشاشة المناسبة شبكة واستخدام غطاء التجمع المناسبة وتأمين أغطية من خلال تشديد المكسرات. يجب أن يكون حجم فتحات الشباك الشاشة لا يقل عن نصف حجم الخرز. استخدام شبكة شاشة كبيرة الحجم لتفادي المنتجات من انسداد فلتر حين طحن مستمر.
- انخفاض غرفة طحن لجعله الأفقي باستخدام مقبض المقدمة على الجزء العلوي من الغرفة والتأكد من أن يفرغ أنبوب المنتج المنفذ في الإناء جمع.
- إضافة تعليق المخدرات مع كميات متنوعة من السطحي إلى مدخل المنتج. وينبغي أن الحجم الأدنى للتعليق هو 100 مل. وهذا سيمنع غرفة الطحن من الانهاك وأيضا تجنب تلوث حبة بسبب ارتداء أقل في أجزاء
- بدء تشغيل المضخة باستخدام وحدة التحكم. يمكن أن تختلف معدل التدفق على النحو المطلوب لصياغة الخاص (~ 50-150 مل / دقيقة).
- المحرض على تحويل وضبط السرعة على وحدة التحكم. ويمكن زيادة السرعة من 620 إلى 4320 دورة في الدقيقة في الدقيقة على MicroCer. رصد درجة الحرارة باستخدام مقياس درجة الحرارة التي تعلق على قمة على غرفة الطحن وتأكد من عدم وجود تضخم.
- طاحونة العينة بسرعات مختلفة ومعدلات التدفق وإخراج aliquots صغيرة (~ 1 مل) من صياغة لقياس حجم وتهمة باستخدام تشتت الضوء حيود بروكهافن Zetasizer (الجدول 1).
- بعد الحصول على الحجم المطلوب ، ووقف الطحن باستخدام وحدة التحكم. مع المضخة لا يزال على وجمع العينة إلى قارورة. السماح لاستنزاف تماما المخدرات في قارورة جمع العينة.
- إيقاف المضخة. لإزالة الخرز ، ووضع تحت درج جمع الوحدة. تخفيف الجوز على لوحة أمام الجمعية الغطاء وجمع حبات في الدرج. تقلع اللوحة الأمامية واستخدام زجاجة مياه لغسل منزوع الأيونات الخرز في الدرج.
- نقل تعليق المضروب في 50 مل أنابيب الطرد المركزي وتعيين أجهزة الطرد المركزي إلى 10،000 دورة في الدقيقة (10174 RCF) لمدة 30 دقيقة. عند الانتهاء من دورة الطرد المركزي ، وقياس كمية طاف واستبدالها مع نفس الكمية من محلول بالسطح الطازجة.
- بمجرد اكتمال إعادة تعليق ، ونقل التعليق الى غرفة الطحن وطاحونة لمدة 10 دقيقة. يأخذ قسامة (~ 1mL) وقياس حجم والمسؤول عن العينة مرة أخرى باستخدام Zetasizer (الجدول 1).
- تنفيذ عملية التنظيف بعد استخدام MicroCer باستخدام الماء منزوع الأيونات والايثانول 70 ٪.
- قياس تركيز باستخدام تركيبات nanoART HPLC. في حالتنا ، قمنا بتقييم عينات بواسطة عكس المرحلة HPLC باستخدام الحقن ثلاث نسخ 20 ميكرولتر على عمود C8 الأوكتيل YMC (المياه ، وشركة ميلفورد ، MA) مع خرطوشة حارس C8. ويتم ضخ المرحلة المتنقلة تتكون من أسيتونتريل 48 ٪ / 52 ٪ 25mM KH 2 PO 4 ، ودرجة الحموضة عند 0.4 4.15 مل / دقيقة مع الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية / فيس في 272 نانومتر. لجميع القياسات المخدرات ، ويتم تحديد الكميات من خلال المقارنة إلى منحنى مستوى كل دواء مجاني (،025-100 ميكروغرام / مل) التي أعدت في الميثانول.
2. NanoART التجانس باستخدام EmulsiFlex Avestin C5
- قياس المخدرات والسطحي البلورات المختلفة التي سيتم استخدامها لجعل nanoformulations باستخدام رصيد التحليلية ومزجها مع 10 ملي Hepes العازلة ، ودرجة الحموضة 7.8 باستخدام T - 18 Ultraturrax خلاط للحصول على تشتت كاملة.
- تعليق نقل إلى السفينة المجانسة وبدء إعادة التدوير. تأكد من أن المبرد على البدء من قبل لتجانس العينة
- زيادة الضغط تدريجيا حتى يقرأ العداد 20000 ± 2000 رطل ، ومواصلة التجانس حتى يتحقق الهدف حجم الجسيمات. هذا عادة ما يستغرق ما بين 45 -- 60 دقيقة. يأخذ قسامة (~ 1mL) دوريا وقياس حجم والمسؤول عن العينة باستخدام Zetasizer (الجدول 1).
- نقل تعليق المتجانس من الخالط إلى 50 مل أنابيب الطرد المركزي وتعيين أجهزة الطرد المركزي إلى 10،000 دورة في الدقيقة (10174 RCF) لمدة 30 دقيقة. عند الانتهاء مندورة الطرد المركزي ، وقياس كمية طاف واستبدالها مع حجم مساو من حل بالسطح الطازجة.
- بعد إعادة تعليق ، ونقل إلى تعليق الخالط C5. استئناف التداول وعودة الضغط إلى المجانسة 20000 ± 2000 رطل والتجانس لمدة 30 دقيقة. قياس حجم والمسؤول عن صياغة باستخدام Zetasizer (الجدول 1).
- تنفيذ تنظيف آخر وحدة مع الماء والإيثانول منزوع الأيونات مثل المذيبات.
- قياس تركيز العينات باستخدام HPLC.
3. صوتنة باستخدام المعالج Parmer كول بالموجات فوق الصوتية
- قياس 50 مل من ثنائي كلورو ميثان في الدورق الزجاجي. قياس 6 غرام من بولي (اللبنيك المشترك ، حمض الجليكوليك) (PLGA) باستخدام ميزان تحليلي ، إضافة إلى ثنائي كلورو ميثان ، وتخلط حتى يتم حل وحظ كاملة.
- قياس 1.25 غرام من بلورات المخدرات وإضافة إلى ثنائي كلورو ميثان / PLGA الحل. مزيج من الحصول على حل كامل.
- جعل 1 ٪ كحول البولي فينيل حل بالسطح (PVA) وتبريده باستخدام حمام جليدي. تأكد من أن الحل هو بالسطح تبرد قبل إضافة المحلول العضوي الذي يحتوي على المخدرات المنحل.
- من أجل حل المخدرات في حل 1 ٪ بالسطح PVA وبدء ultrasonicator في السعة بنسبة 50 ٪. تأكد من أن يتم وضع حل بالسطح في حمام جليدي. ويمكن تخفيض السعة من sonicator لسعة ~ 30 ٪ للدفعات أصغر من العينات. يصوتن العينة لمدة 10 دقيقة.
- تحصل على قسامة صغيرة (~ 1 مل) لتحليل حجم الجسيمات (الجدول 1). إذا كان حجم الجسيمات أكبر من 1.5 ميكرون ، يصوتن العينة في 2 دقيقة فترات تصل إلى حد أقصى قدره 16 دقيقة المجموع. مراقبة العينات تحت المجهر في 20X والملاحظات وثيقة (الشكل 1A).
- استخدام لوحة تحريك لخلق دوامة كافية لتعليق المتبقية ويستمر الخلط بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- تزن 8 ز مانيتول في دورق الماء وإضافة 80 مل ريال عماني. المزيج حتى يتم حل كامل لوحظ وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. وسوف تستخدم ذلك لإعادة تعليق بعد الطرد المركزي إذا العينات تحتاج إلى مجفف بالتجميد.
- جمع تعليق بعد 24 ساعة ، وتصب في أنابيب الطرد المركزي 50 مل. الطرد المركزي عينات بسرعة 8000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة في 5 درجة مئوية. صب وطاف وresuspend نصف العينة في 75 مل من التناضح العكسي تصفيتها (ريال عماني) المياه ، والنصف الآخر في 75 مل من 0.5 ٪ بروميد trimethylammonium سيتيل (CTAB) بالسطح.
- الطرد المركزي العينات مرة أخرى في 8000 دورة في الدقيقة سرعة لمدة 20 دقيقة عند درجة 5 و resuspend كل من الكريات مع ما مجموعه 20 مل من محلول مانيتول.
- بعد إعادة تعليق الثانية ، قياس حجم الجسيمات باستخدام Zetasizer (الجدول 1).
- استخدام قوارير مناسبة لنقل تعليق المتبقية ووضعها في lyophilizer.
- قياس تركيز العينات باستخدام HPLC.
4. NanoART المورفولوجيا
- تعليق اتخاذ nanoART ويصوتن لفترة وجيزة في السعة بنسبة 20 ٪ لمدة 5 ثوان مع التحقيق الذي تجريه صوتنة. نقل 10 ميكرولتر من التعليق الى 1.5 مل من المياه ريال عماني خلال أنبوب مل microcentrifuge 1.7 و دوامة لمدة 10 ثانية.
- أخذ عينة 50 ميكرولتر من محلول المياه nanoART ونقلها إلى جهاز تنقية تتكون من مادة البولي بروبيلين Swinnex صاحب 13 فلتر تجميعها مع غشاء 0.2 ميكرون الترشيح البولي (Nuclepore المسار - المحفور). وتستعد اجهزة تنقية 0.2μm مع 50 ميكرولتر تصفية الماء المقطر قبل إضافة تعليق المخدرات المخفف. ثم يتم تطبيق فراغ إلى الجهاز حتى يتم حل كامل حجم انسحبت تماما الماضية غشاء الترشيح.
- بمجرد أن يجف الغشاء ، والملصقة على كعب مصنوع من الألومنيوم باستخدام دبوس الشريط المزدوج عصا الكربون الموصلة وبصق المغلفة مع البلاديوم. ومن ثم تصويرها باستخدام عينة كعب ، في حالتنا ، والجهد المنخفض JSM6300F JEOL الانبعاثات الميدان والمسح الضوئي المجهر الالكتروني (الشكل 2).
5. NanoART التصور
- أخذ تعليق nanoART أعدت لهم ويصوتن لمدة 10 ثانية في السعة بنسبة 20 ٪ مع تحقيق صوتنة.
- تتخذ غطاء شريحة المجهر زلة ووضعه على مجهر مقلوب. على قسيمة 15 ميكرولتر تغطية مزيج من تعليق nanoART مع 100 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ، ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. تصور النانوية باستخدام الهدف 20X (الشكل 3).
بيولوجيا nanoART
6. العزلة وإعداد تقوم البلاعم التي تنقلها الدم الوحيدات والمشتقة من الوحيدات (MDM)
- الحصول على حيدات الإنسان leukapheresis من HIV - 1 والجهات المانحة سلبيين التهاب الكبد وتنقية الخلايا الحالية لمكافحة تصويل الطرد المركزي. تقييم النقاء الخلية immunolabeling المضادة للCD68 (استنساخ KP-1) من رايت الملطخة cytospins 1.
- حيدات الثقافة المنقى في DMEM تستكمل مع المعطل للحرارة بنسبة 10 ٪ مصل الإنسان المجمعة ، الجلوتامين 1 ٪ ، و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، 10 ميكروغرام / مل سيبروفلوكساسين و 1000 U / مل المؤتلف مستعمرة بلعم عامل تحفيز الإنسان (MCSF) في تركيز 1x10 6 خلية / مل عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5 ٪ CO 2. لوحة 2x10 6 خلايا لكل بئر في 6 لوحات الخلايا بشكل جيد والثقافة لمدة 7 أيام من أجل السماح للتمييز في حيدات الضامة 1. (الشكل 3A)
7. امتصاص الخلايا وكوكتيل
- مزيج nanoART الثقافة مع وسائل الاعلام (بدون MCSF) إلى التركيز النهائي من 100 ميكرومتر وإضافة 1 مل من العلاج المتوسطة إلى كل بئر.
- المطلوب في نقطة زمنية ، أو عندما يتم تحميلها بالكامل مع الخلايا nanoART (الشكل 2) ، وإزالة كافة المتوسطة العلاج وغسل خلايا 3 مرات مع PBS مل 1 إلى إزالة أي الجزيئات التي لم تؤخذ في الخلايا. في 1 مل من برنامج تلفزيوني ، وإزالة الخلايا الملتصقة من قاع البئر باستخدام رافعة الخلية ووضعها في أنبوب 1.7 مل microcentrifuge 2-4.
- الطرد المركزي الخلايا في 1000 في إطار التعاون الإقليمي 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف وإضافة 200 ميكرولتر من الميثانول بنسبة 100 ٪. ليز الخلايا والتي تذوب nanoART لفترة وجيزة (2-5 ثانية) sonicating الكرية مع التحقيق الذي تجريه في sonicating السعة 20 ٪. متجر في عينات -80 درجة مئوية حتى على استعداد لتحليل محتوى المخدرات.
8. جواني الاحتفاظ NanoART
- MDM علاج كما هو موضح في 7.1.
- في نقطة الوقت المطلوب ، وغسل الخلايا كما هو موضح في 7.2 ، ولكن بدلا من إلغاء فورا الخلايا ، وتحديد الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في حل غلوتارالدهيد 3 ٪ في 0.1 م العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.4) وكذلك إصلاح لهم لمدة 10 دقيقة مع رباعي أكسيد الأوزميوم 1 ٪ في 0.1 م العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.4).
- إزالة تثبيتي ، وتتخلص من الخلايا في برنامج تلفزيوني مل 1 كما هو موضح في 7.2. أيضا ، وجمع وأجهزة الطرد المركزي في الخلايا كما تصف 7.2 ، ولكن بدلا من إضافة الميثانول إلى بيليه ، إضافة 200 ميكرولتر من غلوتارالدهيد حل مثبت.
- خفض الخلية بيليه إلى أقسام (80 نانومتر) رقيقة مع مشراح. وصمة عار المقاطع مع اليورانيل خلات الرصاص وسترات. مراقبة أقسام الملون باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال (الشكل 4).
9. النسخة ART
- علاج الخلايا كما هو موضح في 7،1-7،2 ، ولكن بدلا من جمع الخلايا بعد الغسيل واستبدال برنامج تلفزيوني مع 2 مل خلية متوسطة الثقافة دون MCSF ودون nanoART.
- في الأيام المشار إليها ، أو كما أشار مستنبت الخلية تحول الصفراء half الصرف ، من المتوسط.
- في اليوم المطلوب ، وجمع 1 مل من المتوسط على طول الخلية مع الخلايا نسخ كما هو موضح في 7،2-7،3.
- عملية الخلايا كما هو موضح في 7.3. متوسطة عملية بإضافة 150 ميكرولتر من العينة المتوسطة إلى 1 مل من الميثانول بنسبة 100 ٪ ودوامة بأقصى سرعة لمدة 10 ثانية. ثم الطرد المركزي العينات في إطار التعاون الإقليمي 21000 لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف وتحويلها إلى أنبوب جديد. يتبخر الميثانول مع جهاز للطرد المركزي فراغ ، وهذا يمكن أن تتخذ في أي مكان 1-4 ساعات حسب العينة. متجر في عينات -80 درجة مئوية حتى على استعداد لتحليل المخدرات.
10. في الوقت الحقيقي من امتصاص NanoART بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر
- MDM ناضجة تأخذ من الخطوة 6.2 و تسمية الخلايا باستخدام حل وسم الخلية مثل خلية Vybrant الحل وصفها التالية لتعليم صناعة. شطف الخلايا 3 مرات باستخدام 1 مل من مستنبت لإزالة أي صبغة الزائدة.
- مزيج nanoART مع مستنبت كما في الخطوة 7.1 باستخدام nanoART fluorescently المسمى.
- إضافة المتوسطة المعاملة مع nanoART المسمى مباشرة قبل التصوير مع المجهر مبائر. التقاط صورة كل 30 ثانية لمدة 4 ساعات باستخدام الهدف 60x 5 (أفلام 1 & 2).
HIV - 1 العدوى وفحوصات العدوى
11. HIV - 1 ADA العدوى
- علاج الخلايا كما هو موضح في 9،1-9،3.
- في الأيام المطلوب ، وإزالة كافة المتوسطة استبدال المتوسطة ، دون MCSF ، تحتوي على HIV - 1 ADA في عدد وافر من العدوى بنسبة 0.01 الجسيمات الفيروسية / خلية واحتضان لمدة 24 ساعة 1. إزالة المتوسطة الفيروسية واستبدال وسائط الإعلام الجديدة خالية من الفيروسات. ثقافة الخلايا لمدة 10 أيام تبادل نصف المتوسط مرة كل يومين أو حسب الضرورة للحفاظ على الخلايا على قيد الحياة (الشكل 5) 6.
- عشرة أيام بعد الإصابة جمع 10 ميكرولتر من المتوسط من كل جانب ومكان في لوحة 96 - جيدا ، وتخزينها في -80 درجة مئوية ، حتى على استعداد لإجراء تحليل فيروسات الناسخ (عكس)
12. الناسخ العكسي (RT) الفحص
- مع كل عينة من الخطوة 10 ميكرولتر 11.3 ، 10 ميكرولتر مزيج من محلول يحتوي على 100 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.9) ، 300 ملي بوكل ، 10 DTT مم ، 0.1 ٪ nonyl phenoxylpolyethoxylethanol - 40 (NP - 40) ، والمياه. احتضان هذا الخليط لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية 7.
- التالية الحضانة ، بإضافة 50 ميكرولتر من الجليد الباردة حمض حمض التريكلوروسيتيك 10 ٪ (TCA) إلى كل بئر. حصاد الآبار على مرشحات الألياف الزجاجية ، وتقييم المرشحات لإدراجها H - 3 في التلألؤ TTP - β الطيفي 7.
13. فيروس العوز المناعي البشري 1p24 الكشوفات
- غسل الخلايا التي كانت من تكرار إزالة فيروسات عينة المنتسخة المتوسطة 11.3 في الخطوة قبل الشطف مع 1 مل من 3 مرات في برنامج تلفزيوني.
- إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4 ٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في صباح اليوم التالي شطف الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- استخدام الماوس الأضداد وحيدة النسيلة لفيروس نقص المناعة 1 - P24 (1:10 ، داكو ، Carpinteria ، CA) لتصور عدوى فيروس الأيدز. الخلايا تحت صورة مشرقة الحقل باستخدام الهدف 40X (الشكل 6).
14. ممثل النتائج :
| دواء | حجم (نانومتر) | PDI | تهمة (MV) | السطحي |
| IDV | 1052 | 0،286 | -24.58 | P188 0.5 ٪ ، 5.0 ٪ SDS ، السكروز 9.25 ٪ |
| RTV | 233 | 0،273 | -7.47 | P188 0.5 ٪ ، 9.25 ٪ سكروز |
| ATZ | 840 | 0،192 | +25.47 | P188 0.5 ٪ ، 0.1 ٪ MPEG - 2000 DSPE ، DOTAP 1.0 ٪ ، 9.25 ٪ سكروز |
| EFV | 347 | 0،235 | -13.52 | 1.0 ٪ PVA |
الجدول 1. الخصائص الفيزيائية للnanoART
يعرض الجدول القيم المحتملة ممثل عن الخصائص الفيزيائية للتركيبات nanoART المصنعة باستخدام السطحي المشار إليها. القيم تشمل القطر يعني بناء على شدة الضوء المتناثرة ، ومؤشر polydispersity (PDI ، تقديرا لتوزيع حجم الجسيمات) ، والقيم المحتملة للعينات التي تم الحصول عليها زيتا nanoformulation المختلفة. المختصرات المستخدمة في الجدول : IDV : indinavir ؛ RTV : ريتونافير ؛ ATV : atazanavir ؛ EFV : effavirenz ؛ PVA : polyvinylalcohol ؛ SDS كبريتات الصوديوم دوديسيل ؛ P188 : بولوكسامير 188 (تسمى أيضا Pluronic F68) ؛ MPEG - 2000 DSPE : بولي ميثيل (جلايكول الاثيلين) 1،2 - distearoyl - فسفاتيديل إيثانولامين - ؛ DOTAP : (1 - oleoyl - 2 - [6 -- [(7 نترو - 2 - 1 ،3 - benzoxadiazol - 4 - YL) الأمينية] hexanoyl] -- 3 trimethylammonium البروبان.
الشكل 1. مخطط تدفق يلخص مختلف الأساليب التي استخدمت لصنع nanoART.
الشكل 1 يلخص مختلف الأساليب التي استخدمت لصنع nanoART. ويتضمن المخطط الانسيابي المتوقعة الوقت المخصص لكل واحدة من المراحل الحاسمة من الأساليب منها.
الشكل 2. الصور ممثل مورفولوجيا NanoART مرغوب فيه وغير مرغوب فيها. التحليل المجهري الإلكترون المسح الضوئي (التكبير ، 15000 X) من nanoART RTV التي تنتجها التجانس ، والطحن الرطب ، وعلى رأس صوتنة غشاء 0.2 ميكرون الترشيح البولي. شريط قياس تساوي 2.0 ميكرون في جميع الأطر. nanoART المرغوب تتألف ، في المتوسط ، من جزيئات صغيرة مكتفية ذاتيا (≤ 2 ميكرون) مع حواف السلس الذي تميل إلى أن تكون نفس الشكل أو ما شابه ذلك. nanoART غير مرغوب فيها تختلف اختلافا كبيرا من حيث الحجم والشكل ويمكن الصمامات و / أو عصا لأحد آخر.
الشكل 3. صور من حل nanoART المرغوب فيه وتناول nanoART MDM. صور مشرقة المجهري الميدان (المكتسبة باستخدام جميع هدفا 20X) من المتجانس RTV - NP MDM وتناول nanoART. بعد دمج 10 ميكرولتر من RTV - NP حل مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني على رأس زلة تغطية الزجاج ، الجزيئات مرئية وتشبه الرمال مع عدد قليل فقط من الجزيئات الكبيرة التي يجري تحديدها بشكل فردي (A). صورة متباينة تماما وعلى شكل مغزلي MDM nanoART قبل العلاج (B). بعد الخلايا اتخذوا nanoART ، فإنها تصبح أكثر قتامة ونوى بها تصبح أكثر وضوحا بسبب توزيع محيط بالنواة من nanoART ، إلا أنها لا تزال تحافظ على أجسامهم الخلايا المغزلية الشكل (C). مرة واحدة أصبحت مثقلة الخلايا مع nanoART ، وتصبح نواة تحجب ؛ وتصبح خلايا مدورة ، وخسرت بنيتها على شكل مغزلي وفصل محتملة من قاع البئر (D).
4 "/>
الشكل 4. تأكيد التأسيس الخلوي للnanoART إلى MDM. انتقال الإلكترون المجهري (التكبير ، 15000 س) يوضح امتصاص nanoART إلى MDM تتعرض لRTV - NP من التجانس (A) ، RTV - NP من الطحن الرطب (B) ، RTV - NP من صوتنة (C) ، والخلايا غير المعالجة (D ). داخل الخلايا ، يجب أن nanoART يمكن التعرف بسهولة من شكلها الهندسي. لاحظ عدم وجود هياكل هندسية واضحة في أي خلية السيطرة (D). وقد تم تحديد الخطوط العريضة مثال على كل الجسيمات : أحمر للتجانس (A) ، الزرقاء لطحن الرطب (B) ، والأخضر للصوتنة (C). وينبغي أن تشبه بنية الجسيمات التي كان ينظر به SEM. شريط قياس تساوي 5.0 ميكرون في جميع الأطر.
الشكل 5. رسم تخطيطي لطريقة لاختبار نجاعة المضادة للفيروسات القهقرية من nanoART. من أجل اختبار قدرة nanoART لكبح يجب الفيروسية MDM تكرار المعالجة الأولى مع nanoART ثم تتعرض لHIV - 1 ADA. مماثلة للدراسات الافراج ART ، يتم تحميل MDM مع nanoART ثم غسلها لإزالة أي الجزيئات التي لم استوعب. ثم يتم تربيتها NanoART MDM لادن تصل إلى 15 يوما مع صرف نصف المتوسط كل يوم. خلال هذا الوقت (عادة في أيام 1 و 5 و 10 و 15) وتحدى MDM مع HIV - 1 ADA. بعد كل مثقف الخلايا الفيروسية التعرض لمدة 10 أيام من أجل السماح للالعدوى إلى التقدم. في يوم 10 يتم جمع ما بعد الإصابة وسائل الاعلام عينات للتحليل RT والخلايا الثابتة والملون للمستضد P24. هي أيضا مثقف غير nanoART MDM المعالجة ، سواء المصابة وغير المصابة ، بالتوازي واختبارها لوجود المستضد P24 والنشاط RT.
الشكل 6. اختبار نجاعة nanoART في HIV - 1 MDM المصابين تلطيخ P24. الصور المعالجة الميدانية مشرق (20X الهدف) من RTV - NP MDM 10 يوما بعد ان تحدى مع HIV - 1 ADA. وكان لا عدوى الحالي عندما طعن في الخلايا مع virus1 العلاج بعد nanoART اليوم (A) ؛ لاحظ وجود NP داخل سيتوبلازم معظم الخلايا (A أقحم أشار إليه السهام). وكان حاضرا عند الإصابة تعرضت الخلايا لفيروس بعد 10 أيام من العلاج nanoART (B) ، على الرغم من اقل من ذلك بكثير من الخلايا لا تعامل مع nanoART (D) ؛ لاحظ وجود المحافظة من الحزب الوطني في بعض الخلايا (B أقحم أشار إليه السهام) ، ولكن أقل مما كانت عليه في يوم ما بعد العلاج nanoART 1 (ألف أقحم). صورة من الخلايا التي عولجت لا مع ولا nanoART المصابة (C) ، وعدم علما NP السيتوبلازم داخل الخلية (C أقحم). صورة من الخلايا التي لم تعالج nanoART ولكن تعرضت لفيروس نقص المناعة البشرية ADA - 1 (D).
الفيديو 1. الخلية الحية المجهرية مبائر امتصاص RTV - NP الفقراء MDM. المجهر الفلورسنت من MDM المسمى الأخضر مع حل Vybrant الخلية وضع العلامات ديو وتعامل مع الأحمر المسمى RTV - NP. لقد التقطت صورة واحدة كل 30 ثانية لمدة 4 ساعات في التكبير 60x. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو
2 الفيديو. الخلية الحية المجهرية مبائر امتصاص RTV - NP الناجحة التي قام بها MDM. المجهر الفلورسنت من MDM المسمى الأخضر مع حل Vybrant الخلية وضع العلامات ديو وتعامل مع الأحمر المسمى RTV - NP. لقد التقطت صورة واحدة كل 30 ثانية لمدة 4 ساعات في التكبير 60x. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو
Discussion
مصممة لتحسين NanoART HIV - 1 المداواة. لقد اقترحنا الوحيدات البلاعم تسليم المخدرات نظام يستند كخطوة أولى لتطوير مثل هذه التكنولوجيات للاستخدام السريري وكمختبر نظام اختبار لتطوير العقاقير nanoformulated. وقد أظهرت أعمال ماضينا أن النظام لا يصلح للتطبيق مثل هذا 5،6.
في التقرير الحالي ، وقد بينت لنا الطرق لتوليف NP من الأدوية استخداما - 1 فيروس نقص المناعة البشرية (indinavir ، IDV ؛ ritonovir ، RTV ؛ ايفافيرنز ، وEFV atazanavir ، مركبة). وقد تحقق ذلك من خلال الطحن الرطب ، والتجانس وultrasonication. الأهم من ذلك ، يسمح نهجنا لإدخال تعديلات على الخصائص الفيزيائية nanoART مثل الحجم والشكل والمسؤول 5،6. بواسطة الاختيار الدقيق للتوتر السطحي ، يمكن للمرء أن السيطرة على المسؤول عن الجسيمات من سلبية للغاية لمحايدة لإيجابية للغاية. عن طريق تغيير وقت المعالجة وكثافة ، يمكن للمرء التحكم في حجم وتجعل جزيئات صغيرة مثل نانومتر 200 ≤ أو كبيرة مثل ميكرومتر 3 ≥. ويمكن أيضا شكل من الجسيمات يمكن السيطرة عليها ، ولكن بدرجة أقل من الخصائص المادية الأخرى. على سبيل المثال ، يمكن جعل جسيمات كروية عبر صوتنة مع البوليمرات في حين يمكن أن تنتج متعدد الجوانب من خلال الأشكال الهندسية الطحن الرطب أو التجانس. الطحن الرطب والتجانس تنتج جزيئات على شكل مختلف ، ولكن هذه العملية تعتمد على طريقة تجزيء ، ولا يمكن أن يتحكم فيها بصورة مباشرة ل. يمكن لهذه الخصائص لتمكين طرق التصنيع الأبحاث لإنتاج nanoART بسهولة وفقا لمواصفات التصميم الدقيق. وهذا هو المهم جدا منذ الخصائص الفيزيائية والكيميائية للnanoART يكون لها تأثير قوي على الاستقرار على حد سواء ، وكيف تتفاعل مع الخلايا. على سبيل المثال ، أظهرت لنا أن nanoART أن ما يقرب من 1 ميكرومتر في حجمها ، ولها شحنة إيجابية قوية ، ولها أكثر بسرعة اتخذت شكل متعددة الجوانب الهندسية بنسبة الضامة ، أكثر استقرارا مرة واحدة داخل الخلايا ، وأفرج عنه على مدى فترة أطول من الساعة 6.
وقد تم وضع طريقة لاختبار nanoART تسمح للفحص بسيط لقدرة الجزيئات التي سيتم تناولها ، المدورة ، وأطلق سراحه من قبل الضامة ، واحدة من الخلايا المستهدفة مبدأ HIV - 1 ، بالإضافة إلى قدرتها على كبح تكاثر الفيروس. هذا يسمح لأحد أن يفرق بسهولة nanoART على أساس الأداء وتحديد الدول التي لديها فرصة أفضل للنجاح في نموذج في الجسم الحي ، وبالتالي زيادة كل من الكفاءة والسرعة في تطوير nanoART للاستخدام البشري.
وقد تبين أن الفأر الضامة نخاع العظم عند تحميل فيفو السابقين مع nanoART ونقلها عن طريق الحقن في الوريد adoptively إلى أنسنة HIV - 1 2 أسابيع الفئران المصابة يمكن أن تنتقل العدوى إلى مواقع نشطة ، بما في ذلك النظام العصبي المركزي ، والإفراج عن المخدرات لمدة تصل إلى لمنع تكاثر الفيروس 2-4. بالإضافة إلى ذلك ، هذه الخلايا nanoART تحميل استطاعوا أيضا للحد من فعالية عدد الخلايا المصابة بالفيروسات في البلازما ، والعقد اللمفاوية والطحال والكبد والرئة فضلا عن حماية خلايا CD4 + 2. هذه الدراسات ، على الرغم الأولية ، تبين أن تسليم nanoART الخلية بوساطة يمكن للنظام توزيع كميات كبيرة من المخدرات سريريا على كل من الدم والأنسجة المصابة. بسبب النتائج الأولية مشجعة من HIV - 1 الدراسات الفأر المصاب ، ونحن حاليا على وضع نقص المناعة القردي فيروس النموذج المكاك المصابة إلى اختبار المزيد من فرص nanoART للاستخدام السريري.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد العمل من المنح 1P01DA028555 - 01A1 ، NS034239 2R01 ، 2R37 NS36126 ، P01 NS31492 ، P20RR 15635 ، P01MH64570 وP01 NS43985 (لحج) من المعاهد الوطنية للصحة. الكتاب أشكر السيدة روبن تايلور لقراءة نقدية للمخطوطة وغير المسددة دعم رسم والأدبية. نود أن نشكر ستيف Grzelak للخبرة الرطب طحن له. كما نود أن نشكر الدكتور هان تشين من جامعة نبراسكا لنكولن المجهر الإلكتروني مرفق الأساسية لتوريد والمسح الضوئي والصور انتقال المجهر الإلكتروني. أخيرا ، نود أن نشكر ميغان Marquart لخبرتها باستخدام المجهر مبائر حية.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| nanoART Manufacture | ||||
| Indinavir sulfate | Reagent | Longshem Co., Shanghai, China | Cas # 157810-81-6 | |
| Ritonavir | Reagent | China Shengda Pharmaceutical Company, China | Cas # 155213-67-5 | |
| Atazanavir sulfate | Reagent | Gyma Laboratories of America INC | Cas # 198904-31-3 | |
| Effavirenz | Reagent | Hetero Labs LTD, India | Cas # 154598-52-4 | |
| PVA | Reagent | Sigma-Aldrich | P 8136 | |
| SDS | Reagent | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Sucrose | Reagent | Fluka | 84097 | |
| P188 | Reagent | Sigma-Aldrich | P 1300 | |
| mPEG 2000-DSPE | Reagent | Genzyme | LP-R4-039 | |
| Dotap | Reagent | Avanti Polar Lipid, Inc | 890890 P | |
| Hepes | Reagent | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| PLGA 75:25 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1941 | |
| Dichloromethane | Reagent | Acros Organics | 75-09-2 | |
| Mannitol | Reagent | Sigma-Aldrich | M9546 | |
| CTAB | Reagent | Sigma-Aldrich | H 9151 | |
| Analytical Balance | Tool | Denver Instrument | ||
| T-18 Mixer | Tool | IKA | ||
| Ultra Sonicator | Tool | Cole-Parmer | ||
| Wet milling, MicroCer | Tool | Netzsch Fine Particle Technology, LLC | ||
| Homogenizer, EmulsiFlex-C5 | Tool | Avestin, Inc. | ||
| Zetapotentiometer | Tool | Malvern Instruments | ||
| Gas Manifold System | Tool | Victor Technologies | ||
| In Vitro Testing | ||||
| DMEM | Reagent | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15710-064 | |
| Ciprofloxin | Reagent | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| Human MCSF | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-093-964 | |
| Pooled normal human serum | Reagent | Cole-Parmer | WU-88061-68 | |
| 6-well tissue culture plates | Tool | Corning | 3524 | |
| Methanol (HPLC Grade) | Reagent | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Tool | National Scientific Company | CN1700GT | |
| Glutaraldehyde solution | Reagent | Sigma-Aldrich | 49632 | |
| Osmium tetroxide solution | Reagent | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Centrifuge 5417R | Tool | Eppendorf | 022621807 | |
| F-45-30-11 fixed angle rotor | Tool | Eppendorf | 022636006 | |
| HIV-1ADA | Reagent | |||
| HIV-1 p24 mouse monoclonal antibody | Reagent | Dako | M0857 | |
| Microscope slide cover slips | Tool | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
Abbreviations used in the table: IDV: indinavir; RTV: ritonavir; ATV: atazanavir; EFV: effavirenz; PVA: polyvinylalcohol; SDS sodium dodecyl sulfate; P188: poloxamer 188 (also termed Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: methyl-poly(ethylene-glycol)1,2-distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine; DOTAP: (1-oleoyl-2-[6-[(7-nitro-2–1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]hexanoyl]-3-trimethylammonium propane); PLGA: poly(lactic-co-glycolic acid); CTAB: cetyltrimethyl ammonium bromide; DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium; MCSF: Macrophage Colony-Stimulating Factor; HPLC: high-pressure liquid chromatography; HIV-1: Human Immunodeficiency Virus-1 |
||||
References
- Gendelman, H. E. Efficient isolation and propagation of human immunodeficiency virus on recombinant colony-stimulating factor 1-treated monocytes. J Exp Med. 167 (4), 1428-1441 (1988).
- Dou, H. Development of a macrophage-based nanoparticle platform for antiretroviral drug delivery. Blood. 108 (8), 2827-2835 (2006).
- Dou, H. Laboratory investigations for the morphologic, pharmacokinetic, and anti-retroviral properties of indinavir nanoparticles in human monocyte-derived macrophages. Virology. 358, 148-158 (2007).
- Dou, H. Macrophage delivery of nanoformulated antiretroviral drug to the brain in a murine model of neuroAIDS. J Immunol. 183 (1), 661-669 (2009).
- Nowacek, A. S. Nanoformulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV-1-Infected Macrophages: Implications for NeuroAIDS Therapeutics. J Neuroimmune Pharmacol. , (2010).
- Nowacek, A. S. NanoART synthesis, characterization, uptake, release and toxicology for human monocyte-macrophage drug delivery. Nanomed. 4 (8), 903-917 (2009).
- Kalter, D. C. Enhanced HIV replication in macrophage colony-stimulating factor-treated monocytes. J Immunol. 146 (1), 298-306 (1991).
