Summary
Наночастицы индинавир, ритонавир, эфавиренц и атазанавир были изготовлены с использованием мокрого помола, гомогенизации и ультразвуком. Эти nanoformulations, общее название nanoformulated антиретровирусной терапии (nanoART), оценили макрофагов основе доставки лекарств. Моноцитарных макрофагов nanoART поглощения, удержания и замедленным высвобождением были определены. Эти предварительные исследования показывают потенциал nanoART для клинического использования.
Abstract
Nanoformulated препараты могут улучшить фармакодинамики и биодоступность во время службы и уменьшить токсичность препарата на антиретровирусные (АРВ) препаратов. С этой целью в нашей лаборатории применил принципы наномедицины для упрощения схемы АРТ и как таковой снижения токсичности при одновременном улучшении соблюдения и наркотиков фармакокинетики. Простые и надежные методы для производства nanoformulated АРТ (nanoART) показаны. Частицы чистого наркотического средства инкапсулируются тонким слоем поверхностно-активного вещества покрытия липидов и производится путем фракционирования крупных кристаллов препарата на более мелкие либо мокрого помола или высокого давления гомогенизации. В альтернативном способе свободного препарата приостановлены в капли полимера. При этом, препарат растворяется в полимере то взволнован ультразвуковой до отдельных наноразмерных капель формируются. Динамическое рассеяние света и микроскопического исследования характеризуют физические свойства частиц (размер частиц, заряд и формы). Их биологические свойства (поглощение клеткой и удержания, цитотоксичность и эффективности антиретровирусной) определяются с человеческими моноцитарных макрофагов (MDM). МДМ выводятся из человеческих моноцитов в периферической крови изолированы от leukopacks использованием центробежной отмучивания для очищения. Такая кровь макрофаги могут быть использованы в качестве сотовой транспортеры для nanoART распределения вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), инфицированных органов. Мы постулировать, что переупаковка клинически доступных антиретровирусных препаратов в наночастицы для ВИЧ-1, лечение может улучшить соблюдение и положительно влияет на заболевания результатов.
Protocol
NanoART производства
1. Влажные NanoART фрезерный по NETZSCH MicroCer методы
- Взвесьте наркотиков кристаллов и различных поверхностно-активных веществ, который будет использоваться, чтобы сделать nanoformulations использованием аналитических весов и смешайте их с 10 мМ Hepes буфере, рН 7,8 использованием Т-18 Ultraturrax миксером до полностью рассеялись. Процентов наркотиков в формулировке должна быть в пределах 1 - 2%.
- Для непрерывного фрезерования, убедитесь, что чиллер и компрессор включен. Давление на выходе должно быть около 100 PSI, прежде чем начать мельницу вашего образца.
- Включите блок управления и поворота шлифовального бак, так что мелющих тел могут быть загружены в бак.
- Добавьте 50 мл бисером камеры измельчения использованием воронки. Убедитесь в том, что Есть нет бусины темы или где-нибудь за пределами камеры измельчения, чтобы избежать утечки в механическое уплотнение.
- Убедитесь, что уплотнительное кольцо на его место на фрезерном камеры. Выберите подходящий размер сито и использовать соответствующую сборку крышки и безопасный крышками, затянув гайки. Размер экрана по сетке должно быть не менее половины размера бисера. Использование большого размера сито, чтобы избежать продукт от засорения фильтра в то время как непрерывный фрезерования.
- Нижние камеры измельчения, чтобы сделать его горизонтальным помощью ручки предоставляется на верхней части камеры и убедитесь, что продукт отводной трубки впадает в приемный сосуд.
- Добавить наркотиков подвеска с различными количествами поверхностно-активных веществ продукта на входе. Минимальный объем подвески должно быть 100 мл. Это позволит предотвратить фрезерные камеру от перегрева, а также избежать загрязнения бусину из-за меньшего износа на детали
- Начало насоса с помощью блока управления. Скорость потока можно изменять по мере необходимости для вашей формулировке (~ 50 - 150 мл / мин).
- Включите мешалку и настройте скорость на блоке управления. Скорость может быть увеличена с 620 оборотов в минуту до 4320 оборотов в минуту на MicroCer. Монитор температуры с помощью датчика температуры, который прилагается на первое место по камере измельчения и убедитесь, что нет перегрева.
- Милль образца при различных скоростях и скорость потока и доставать небольшие порции (~ 1 мл) препарата для размера и заряда измерений с помощью дифракционного рассеяния света Брукхейвенской Zetasizer (табл. 1).
- После нужного размера получается, остановитесь фрезерные использованием блока управления. С насосом еще включен, собирать пробы в колбе. Разрешить препарат полностью стечь в колбу отбора проб.
- Выключите насос. Для удаления бусы, место коллекции лоток под блок. Ослабить гайки на передней панели крышки сборки и собрать бусины в лоток. Снимите переднюю панель и использование деионизированной бутылку воды, чтобы смыть бисером в лоток.
- Передача фрезерованные суспензии в 50 мл трубы центрифуги и установить центрифуги до 10000 оборотов в минуту (10174 RCF) в течение 30 минут. После завершения цикла центрифуги, измерить количество надосадочной и заменить такое же количество свежего раствора ПАВ.
- После ресуспендирования завершения передачи подвески в камеру измельчения и мельница на 10 минут. Возьмите аликвоту (~ 1 мл) и измерить размер и заряд пример еще раз, используя Zetasizer (табл. 1).
- Выполните после использования очистки MicroCer использованием деионизированной воды и 70% этанола.
- Мера концентрации nanoART формулировки использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. В нашем случае, мы оценивали образцы с обращенной фазовой ВЭЖХ использованием трех экземплярах 20 мкл инъекции на колонке YMC Октил C8 (Waters Inc, Милфорд, штат Массачусетс) с C8 охранник картриджа. Подвижная фаза, состоящая из 48% ацетонитрила / 52% 25 мМ KH 2 PO 4, рН 4,15 перекачивается в 0,4 мл / мин с UV / Vis обнаружение при 272 нм. Для всех наркотиков измерения, количественный определяется путем сравнения со стандартной кривой каждого свободного препарата (0.025-100 мкг / мл), подготовленный в метаноле.
2. NanoART усреднении использованием Авестин EmulsiFlex C5
- Мера наркотиков кристаллов и различных поверхностно-активных веществ, который будет использоваться, чтобы сделать nanoformulations использованием аналитических весов и смешайте их с 10 мМ Hepes буфере, рН 7,8 использованием Т-18 Ultraturrax смесителя для получения полной дисперсии.
- Передача подвески гомогенизации судна и начать рециркуляции. Убедитесь, что чиллер на, прежде чем начать гомогенизации образца
- Увеличение давления постепенно, пока индикатор не покажет 20000 ± 2000 фунтов на квадратный дюйм и продолжают гомогенизации до размера частицы-мишени достигается. Это обычно занимает от 45 - 60 минут. Возьмите аликвоту (~ 1 мл) и периодически измерять размер и заряд образца с помощью Zetasizer (табл. 1).
- Передача гомогенизированный отстранение от гомогенизатор до 50 мл трубы центрифуги и установить центрифуги до 10000 оборотов в минуту (10174 RCF) в течение 30 минут. По завершениюЦентрифуга цикла, измерить количество надосадочной и заменить равным объемом свежего раствора ПАВ.
- После ресуспендирования, передача подвески C5 гомогенизатора. Перезагрузите обращения и возврата гомогенизации давления до 20000 ± 2000 фунтов на квадратный дюйм и гомогенизации в течение 30 минут. Измерьте размер и заряд формулировка использованием Zetasizer (табл. 1).
- Действия после очистки блока с деионизированной воды и этанола в качестве растворителя.
- Мера концентрации образцов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии.
3. Ультразвуком использованием Коул Пармер Ультразвуковая процессор
- Мера 50 мл дихлорметана в стеклянную мензурку. Мера 6 г поли (молочная-со-гликолевой кислоты) (PLGA), используя аналитические весы, добавить к дихлорметана и перемешивают до полного растворения наблюдается.
- Мера 1,25 г препарата кристаллов и добавить в дихлорметан / PLGA решение. Смешайте до получения полного растворения.
- Сделать 1% поливинилового спирта (ПВС), раствора ПАВ и прохладный его с помощью ледяной бане. Убедитесь, что поверхностно-активное вещество решение остыть перед добавлением органический раствор, который содержит растворенный препарат.
- Налейте наркотиков раствор в 1% раствор поверхностно-активного вещества ПВА и начать ultrasonicator на 50% амплитуды. Убедитесь, что поверхностно-активное вещество раствора помещают в ледяную баню. Амплитуда sonicator может быть уменьшена до ~ 30% амплитуды для небольших партий образцов. Разрушать ультразвуком образца в течение 10 минут.
- Возьмите небольшую аликвоту (~ 1 мл) для анализа размера частиц (табл. 1). Если размер частиц больше, чем 1,5 мкм, разрушать ультразвуком образца в 2-минутным интервалом до максимум 16 минут всего. Обратите внимание на образцы под микроскопом на 20x и документ наблюдения (рис. 1А).
- Используйте мешалки для создания адекватной вихрь для остальных подвески и продолжают перемешивание в течение ночи при комнатной температуре.
- Взвесьте 8 г маннита в колбу и добавляют 80 мл воды RO. Смешайте до полного растворения наблюдается и хранить при комнатной температуре. Это будет использовано для ресуспендирования после центрифугирования, если образцы должны быть лиофилизируют.
- Сбор суспензии после 24 часов и вылить в 50 мл трубы центрифуги. Центрифуга образцов при скорости 8000 оборотов в минуту в течение 20 минут при температуре 5 ° C. Декантируйте супернатант и ресуспендируйте половины выборки в 75 мл с фильтром обратного осмоса (RO) воды, а другая половина в 75 мл 0,5% цетиловый бромид триметиламмония (СТАВ) ПАВ.
- Центрифуга образцы снова со скоростью 8000 оборотов в минуту в течение 20 минут при температуре 5 ° C и ресуспендируют каждую из гранул в общей сложности 20 мл маннитола решение.
- После второго ресуспендирования, измерять размеры частиц с помощью Zetasizer (табл. 1).
- Используйте подходящие флаконах перевести оставшуюся подвески и поместить их в лиофилизатор.
- Мера концентрации образцов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии.
4. NanoART Морфология
- Возьмите nanoART подвески и кратко разрушать ультразвуком при 20% амплитуды в течение 5 секунд с ультразвуком зонда. Передача 10 мкл суспензии в 1,5 мл воды RO в 1,7 мл трубки микроцентрифужных и вихревые течение 10 секунд.
- Возьмите 50 мкл образца воды nanoART решения и передачи фильтрации аппарат, состоящий из 13 Swinnex полипропилена держатель фильтра в сборе с 0,2 мкм поликарбоната мембранной фильтрации (Nuclepore трековых). Фильтрации аппарат загрунтовать 50 мкл 0,2 мкм фильтруется дистиллированной водой перед добавлением разбавленной суспензии препарата. Вакуумные затем применяется к аппарату, пока весь объем раствора была полностью вытянута прошлом мембранной фильтрации.
- Как только оболочка сухая, она прикреплена к алюминиевой заглушкой контактный помощью двойных палку проводящие ленты углерода и распыления покрытый палладием. Образце заглушка то отображаемого используя, в нашем случае, JEOL JSM6300F низкого напряжения, полевая эмиссия сканирующего электронного микроскопа (рис. 2).
5. NanoART Визуализация
- Возьмите подготовленный суспензий nanoART и разрушать ультразвуком их в течение 10 секунд при 20% амплитуды ультразвука зонда.
- Возьмите крышку стекло микроскопа скольжения и поместите его на инвертированный микроскоп. На обложке скольжения смесь 15 мкл nanoART подвеска с 100 мкл фосфатно-солевым буфером (PBS) и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Визуализация наночастиц использованием 20x цели (рис. 3).
Биология nanoART
6. Выделение и подготовка кровью Моноцитарный и моноцитарных Макрофаги (MDM)
- Получить человеческих моноцитов по лейкафереза от ВИЧ-1 и доноров гепатита серонегативных и очистить клетки против течения центробежные отмучивания. Оценка ячейки чистоту immunolabeling с анти-CD68 (клон КП-1) Из Райт-окрашенных cytospins 1.
- Культура очищенной моноцитов в DMEM с добавлением 10% тепла инактивированной объединенных человеческой сыворотки, 1% глютамина, 50 мкг / мл гентамицина, 10 мкг / мл ципрофлоксацина и 1000 Ед / мл рекомбинантного человеческого макрофаг колониестимулирующий фактор (MCSF) в концентрации 1x10 6 кл / мл при 37 ° C во влажной атмосфере с 5% CO 2. Пластина 2х10 6 клеток на лунку в 6-луночных планшетах и культуры клеток в течение 7 дней, чтобы позволить моноцитов дифференцироваться в макрофагах 1. (Рис. 3А)
7. Поглощение клеток и коллекции
- Смешать с nanoART медиакультуры (без MCSF) до конечной концентрации 100 мкМ и добавьте 1 мл лечение среду в каждую лунку.
- В нужное время пункта, или когда клетки полностью загружены nanoART (рис. 2), удалите все лечение средних и мыть клетки 3 раза с 1 мл PBS для удаления частиц, которые не были приняты в клетками. В 1 мл ФСБ, удалить прилипшие клетки со дна и с помощью ячейки ручка и поместить их в 1,7 мл микроцентрифужную пробирку 2-4.
- Центрифуга клеток на 1000 RCF при 4 ° С в течение 10 минут. Удалить супернатант и добавить 200 мкл 100% метанола. Lyse клетки и растворяет nanoART кратковременным (2-5 секунды) sonicating гранулу sonicating зонд на уровне 20% амплитуды. Магазин образцов в -80 ° С до готовности для анализа наркотиков содержания.
8. Внутриклеточное Сохранение NanoART
- Лечить МДМ, как описано в 7.1.
- В нужное время точки, мыть клетки, как описано в 7.2, но вместо того чтобы немедленно очищая клетки, исправить клетки в течение 15 мин при комнатной температуре в растворе 3% глутарового альдегида в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4) и в дальнейшем исправить их в течение 10 минут с 1% осмия в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4).
- Удалить фиксатор и скрести клеток в 1 мл PBS, как описано в п. 7.2. Кроме того, сбор и центрифуги клетки, как описано в 7.2, но вместо добавления метанола в гранулах, добавить 200 мкл раствора глутаральдегида фиксатором.
- Вырезать осадок клеток в тонкие (80 нм) секций с микротоме. Пятно секций с уранилацетатом и цитратом свинца. Соблюдайте окрашенные срезы использованием просвечивающей электронной микроскопии (рис. 4).
9. АРТ выпуска
- Лечить клетки, как описано в 7.1-7.2, однако вместо сбора клеток после мытья, заменить PBS с 2 мл клеточной культуры носителе без MCSF и без nanoART.
- В указанные дни, или, как указано по мобильному культуральной среде желтеют, обмен половине среды.
- В нужный день, собирают 1 мл клеточной среде, а также копировать клетки, как описано в 7.2-7.3.
- Процесс клетки, как описано в 7.3. Рабочей среды путем добавления 150 мкл среднего образца до 1 мл на 100% метанола и вихря на полной скорости в течение 10 секунд. Затем центрифугу образцов при 21000 RCF течение 10 минут. Удалить супернатант и перенести его на новую трубу. Evaporate метанола с вакуумной центрифуге, что может занять от 1 до 4 часов в зависимости от образца. Магазин образцов в -80 ° С до готовности для анализа наркотиков.
10. В режиме реального времени Поглощение NanoART по конфокальной микроскопии
- Возьмите зрелые МДМ с шагом 6,2 и этикетки клетки, используя решение ячейки маркировки таких как Vybrant Решение маркировки сотовых следующие инструкции производителя. Промойте клетки 3 раза с использованием 1 мл питательной среды, чтобы удалить лишнюю краску.
- Смешайте nanoART культуральной средой, как в шаге 7,1 использованием флуоресцентно меченных nanoART.
- Добавить лечения среду с мечеными nanoART непосредственно перед началом съемки с конфокальной микроскопии. Захват изображения каждые 30 секунд в течение 4 часов при использовании 60x цель 5 (Видео 1 и 2).
ВИЧ-1 инфекции и Инфекционность Анализы
11. ВИЧ-1 инфекции ADA
- Лечить клетки, как описано в 9.1-9.3.
- На желаемого дней, удалить все средние и заменить среды, без MCSF, содержащий ВИЧ-1 ADA при множественности заражения вирусные частицы 0,01 / элемент и инкубировать в течение 24 часов 1. Удалить вирусное средних и заменить свежей, вирусов СМИ. Культуры клеток для 10 дней обмен половину среды через день или по мере необходимости сохранить клетки живыми (рис. 5) 6.
- Через десять дней после заражения собрать 10 мкл среды из каждой лунки, место в 96-луночного планшета, и хранить при температуре -80 ° С до готовности выполнять ретровирусной (реверс) транскриптазы анализа.
12. Обратной транскриптазы (RT) Пробирной
- С каждым 10 мкл образца, начиная с шага 11,3, смешайте 10 мкл раствора, содержащего 100 мМ Трис-HCl (рН 7,9), 300 мМ KCl, 10 мМ ДТТ, 0,1% нонил phenoxylpolyethoxylethanol-40 (NP-40), и воды. Выдержите эту смесь в течение 15 минут при температуре 37 ° C 7.
- После инкубации, добавить 50 мкл ледяной 10% трихлоруксусной кислоты (ТСА) в каждую лунку. Урожай скважин на фильтры из стекловолокна, а также оценить фильтры для 3 Н-TTP включение путем β-сцинтилляционных спектроскопии 7.
13. ВИЧ-1p24 обнаружений
- Вымойте повторить клетки, из которых ретровирусных образец среда транскриптазы был удален в шаге 11,3 промыванием 1 мл PBS 3 раза.
- Fix клетки с 4% параформальдегида течение ночи при 4 ° C. На следующее утро промыть клетки 3 раза PBS.
- Используйте мышь, моноклональные антитела к ВИЧ-1 р24 (1:10, Dako, Carpinteria, CA) для визуализации ВИЧ-инфекции. Изображение клетки при ярком поле с помощью 40x цели (рис. 6).
14. Представитель Результаты:
| Наркотик | Размер (Нм) | PDI | Заряд (Мв) | Поверхностно-активные вещества |
| IDV | 1052 | 0,286 | -24,58 | 0,5% P188, 5,0% SDS, 9,25% сахарозы |
| RTV | 233 | 0,273 | -7,47 | 0,5% P188, 9,25% сахарозы |
| ATZ | 840 | 0,192 | 25,47 | 0,5% P188, 0,1% MPEG 2000-DSPE, 1,0% DOTAP, 9,25% сахарозы |
| EFV | 347 | 0,235 | -13,52 | 1,0% ПВА |
Таблица 1. Физические характеристики nanoART
Таблица показывает возможные значения представитель физические характеристики nanoART составы производятся с использованием указанных поверхностно-активных веществ. Значения включают среднего диаметра основан на интенсивность рассеянного света, полидисперсности (PDI, оценки распределения частиц по размерам), а также потенциальные дзета значения, полученные для различных образцов nanoformulation. Сокращения, используемые в таблице: IDV: индинавир; РТВ: ритонавир, ATV: атазанавир; EFV: effavirenz; PVA: поливинилового спирта; SDS додецилсульфата натрия; P188: полоксамер 188 (также называется Pluronic F68); MPEG 2000-DSPE: метил-поли (этилен-гликоль) 1,2-distearoyl-фосфатидил-этаноламин; DOTAP: (1-олеоил-2-[6 - [(7-нитро-2-1 ,3-benzoxadiazol-4-ил) амино] гексаноил] - 3-триметиламмония пропана.
Рисунок 1. Схема обобщения различных методов, используемых для производства nanoART.
На рисунке 1 приведены различные методы, используемые для производства nanoART. Схема включает в себя предполагаемое время перераспределения для каждого из критических фаз соответствующих методов.
Рисунок 2. Представителю образы желательных и нежелательных NanoART морфологии. Сканирующей электронной микроскопии анализа (увеличение, 15000 Х) RTV nanoART производства гомогенизации, мокрого помола и обработки ультразвуком в верхней части 0,2 мкм мембранной фильтрации поликарбоната. Мера бар равна 2,0 мкм во всех кадрах. Желательно nanoART состоят, в среднем, малых (≤ 2 мкм) автономный частиц с гладкими краями, которые, как правило, имеют такие же или аналогичные формы. Нежелательные nanoART сильно различаются по размерам и форме и могут сливаться и / или прилипают друг к другу.
Рисунок 3. Изображения желательное решение nanoART и МДМ занимая nanoART. Яркий микроскопии изображений (все, приобретенный с помощью 20x цель) гомогенизированных РТВ-NP и МДМ занимая nanoART. После объединения 10 мкл РТВ-NP решение с 100 мкл PBS в верхней части скольжения покровного стекла, частицы видны и напоминают песок и только немногие из более крупных частиц их индивидуальной идентификации (A). Изображение полностью дифференцирована и веретенообразную форму МДМ перед nanoART лечения (B). После клетки заняли nanoART, они становятся темнее и их ядра становятся все более очевидными в связи с перинуклеарные распределение nanoART, однако они все еще сохраняют свою веретенообразную форму тела клетки (С). Как только клетки становятся перегруженными nanoART, ядра становятся затемняется, и клетки становятся округлыми, теряя свои шпинделя образной структуры и, возможно, отходящие от дна колодца (D).
4 "/>
Рисунок 4. Подтверждение сотовой включение nanoART в МДМ. Просвечивающей электронной микроскопии (увеличение, 15000 х) демонстрирует поглощение nanoART в МДМ подвергается RTV-НП от гомогенизации (), RTV-НП от мокрого помола (B), RTV-NP с ультразвуком (С), и необработанных клеток (D ). В клетках, nanoART должны быть легко распознать по их геометрической формы. Обратите внимание на отсутствие каких-либо очевидных геометрических структур в контрольной ячейке (D). Например каждой частицы наметилась: красный для гомогенизации (A), синий для мокрого помола (B), зеленый для обработки ультразвуком (С). Частица структура должна напоминать то, что было замечено использование SEM. Мера бар равна 5,0 мкм во всех кадрах.
Рисунок 5. Схема метода для тестирования эффективности антиретровирусной nanoART. Для того чтобы проверить способность nanoART подавлять вирусную репликацию МДМ должен быть первым получавших nanoART а затем контакт с ВИЧ-1 ADA. Как и в исследованиях АРТ релиз, МДМ загружаются с nanoART, а затем промывают, чтобы удалить все частицы, которые не были внутренним. NanoART груженый МДМ которые затем культивировали до 15 дней с одним средства обмена наполовину каждые два дня. За это время (как правило, в дни 1, 5, 10 и 15) МДМ сталкиваются с проблемой ВИЧ-1 ADA. После каждого вирусные клетки экспозиция культивировали в течение еще 10 дней для того, чтобы позволить инфекции прогресса. На 10-й день после заражения СМИ образцы собираются в РТ анализа и клетки фиксировали и окрашивали для антигена р24. Номера для nanoART лечение МДМ, инфицированных и неинфицированных, также культивируют в параллельном и проверены на наличие антигена р24 и РТ деятельности.
Рисунок 6. Тестирование nanoART эффективность у ВИЧ-1-инфицированных МДМ по p24 окрашивания. Яркие образы поле (20x цель) RTV-NP лечение МДМ 10 дней после того, как сталкиваются с проблемой ВИЧ-1 ADA. Нет инфекции присутствовал, когда клетки были оспорены с virus1 день после nanoART лечение (); обратить внимание на наличие НП в цитоплазме большинства клеток (вставка указаны стрелками). Инфекция присутствовала, когда клетки подвергались воздействию вируса через 10 дней после nanoART лечения (B), хотя в гораздо меньшей степени, чем клетки, не обработанных с nanoART (D), записка поддерживается наличием НП в некоторых клетках (Б вставке показаны стрелками), но меньше, чем в 1-й день после nanoART лечения (вставка). Изображение клеток, которые не были ни лечения, ни с nanoART инфицированных (С); отметить отсутствие НП в цитоплазме клеток (C вставка). Изображение клеток, которые не обращались с nanoART но контакт с ВИЧ-1 ADA (D).
VIDEO 1. Живая клетка конфокальной микроскопии бедных РТВ-NP поглощение МДМ. Флуоресцентная микроскопия МДМ помечены зеленым с Vybrant Дио клеточной маркировке решение и обрабатывают красный меченных RTV-NP. Один снимок был сделан через каждые 30 секунд в течение 4 час при 60x увеличением. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео
VIDEO 2. Живая клетка конфокальной микроскопии успешного RTV-NP поглощение МДМ. Флуоресцентная микроскопия МДМ помечены зеленым с Vybrant Дио клеточной маркировке решение и обрабатывают красный меченных RTV-NP. Один снимок был сделан через каждые 30 секунд в течение 4 час при 60x увеличением. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео
Discussion
NanoART предназначены для повышения ВИЧ-1 терапии. Мы предложили моноцитарно-макрофагальной системы, основанной доставки лекарственных средств в качестве первого шага на пути разработки таких технологий для клинического использования, и как система лабораторного тестирования на nanoformulated разработки лекарств. Наши прошлые работы показали, что система жизнеспособна для таких приложений 5,6.
В настоящем докладе, мы проиллюстрировали методы синтеза НП наиболее часто используемых ВИЧ-1, лекарственными препаратами (индинавир, IDV; ritonovir, RTV, эфавиренц, EFV и атазанавир, ATV). Это было достигнуто путем мокрого измельчения, гомогенизации и ультразвуком. Важно отметить, что наш подход позволяет модификаций nanoART физические характеристики, такие как размер, форма и заряд 5,6. По тщательном подборе поверхностно-активных веществ, можно контролировать заряд частицы от крайне негативных до нейтрального до сильно положительным. Путем изменения времени обработки и интенсивности, можно управлять размером и оказывать частиц размером до ≤ 200 нм или такого размера, как ≥ 3 мкм. Форма частиц также может быть под контролем, но в меньшей степени, чем другие физические характеристики. Например, сферические частицы могут быть сделаны с помощью ультразвука с полимерами в то время как многосторонней геометрические фигуры могут быть произведены с помощью мокрого помола или гомогенизации. Мокрого помола и гомогенизации производят разной формы частиц, но этот процесс зависит от метода фракционирования и не могут быть непосредственно контролировали. Эти свойства производственные методы исследования могут позволить, чтобы легко производить nanoART в точном соответствии с дизайном. Это жизненно важно, так как физико-химические свойства nanoART иметь сильный эффект на обе стабильности их и как они взаимодействуют с клетками. Например, мы показали, что nanoART, что примерно 1 мкм, имеют сильный положительный заряд, и многосторонние геометрической формы более быстро подхвачена макрофагов, более стабильной оказавшись внутри клетки, и выпустили в течение более длительного периода время 6.
Метод тестирования был разработан nanoART, что обеспечивает простой проверки способности частиц, подлежащих обсуждению, сохранялись, и выпущен макрофагов, одной из основных клеток-мишеней ВИЧ-1, в дополнение к их способности подавлять репликацию вируса. Это позволяет легко отличить nanoART зависимости от достигнутых результатов и определить те, которые имеют наилучшие шансы на успех в естественных условиях в модели, тем самым, увеличивая эффективность и скорость разработки nanoART для использования человеком.
Было показано, что мыши макрофагах костного мозга при загрузке исключая виво с nanoART и восприимчиво передается путем внутривенной инъекции в гуманизированные ВИЧ-1 инфицированных мышей могут путешествовать на сайты активного заражения, в том числе центральной нервной системы, и выпуск препаратов в течение 2 недель для ингибирования репликации вируса 2-4. Кроме того, эти клетки nanoART загружены также были в состоянии эффективно уменьшить количество инфицированных вирусом клеток в плазме крови, лимфатических узлах, селезенке, печени и легких, а также защиту клеток CD4 + 2. Эти исследования, хотя и предварительные, показали, что клеточный nanoART система доставки может распространять клинически значимых количествах препарат крови и пораженных тканях. Из-за обнадеживающие предварительные результаты от ВИЧ-1-инфицированных исследования мыши, мы в настоящее время развивается дефицит обезьяньим иммуно инфицированных вирусом макаки модель для дальнейшего тестирования потенциал nanoART для клинического использования.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке грантов 1P01DA028555-01A1, 2R01 NS034239, 2R37 NS36126, P01 NS31492, P20RR 15635, P01MH64570 и P01 NS43985 (для HEG) из Национального института здоровья. Авторы выражают благодарность г-жа Робин Тейлора критическое прочтение рукописи и выдающиеся графические и литературные поддержки. Мы хотели бы поблагодарить Стива Гжелак за его мокрый помол экспертизы. Мы также хотели бы поблагодарить д-р Хан Чен из Университета штата Небраска в Линкольне электронного объекта основных микроскопии для питания сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии изображений. Наконец, мы хотели бы поблагодарить Меган Маркварт для ее экспертизы с использованием живых конфокальной микроскопии.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| nanoART Manufacture | ||||
| Indinavir sulfate | Reagent | Longshem Co., Shanghai, China | Cas # 157810-81-6 | |
| Ritonavir | Reagent | China Shengda Pharmaceutical Company, China | Cas # 155213-67-5 | |
| Atazanavir sulfate | Reagent | Gyma Laboratories of America INC | Cas # 198904-31-3 | |
| Effavirenz | Reagent | Hetero Labs LTD, India | Cas # 154598-52-4 | |
| PVA | Reagent | Sigma-Aldrich | P 8136 | |
| SDS | Reagent | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Sucrose | Reagent | Fluka | 84097 | |
| P188 | Reagent | Sigma-Aldrich | P 1300 | |
| mPEG 2000-DSPE | Reagent | Genzyme | LP-R4-039 | |
| Dotap | Reagent | Avanti Polar Lipid, Inc | 890890 P | |
| Hepes | Reagent | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| PLGA 75:25 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1941 | |
| Dichloromethane | Reagent | Acros Organics | 75-09-2 | |
| Mannitol | Reagent | Sigma-Aldrich | M9546 | |
| CTAB | Reagent | Sigma-Aldrich | H 9151 | |
| Analytical Balance | Tool | Denver Instrument | ||
| T-18 Mixer | Tool | IKA | ||
| Ultra Sonicator | Tool | Cole-Parmer | ||
| Wet milling, MicroCer | Tool | Netzsch Fine Particle Technology, LLC | ||
| Homogenizer, EmulsiFlex-C5 | Tool | Avestin, Inc. | ||
| Zetapotentiometer | Tool | Malvern Instruments | ||
| Gas Manifold System | Tool | Victor Technologies | ||
| In Vitro Testing | ||||
| DMEM | Reagent | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15710-064 | |
| Ciprofloxin | Reagent | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| Human MCSF | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-093-964 | |
| Pooled normal human serum | Reagent | Cole-Parmer | WU-88061-68 | |
| 6-well tissue culture plates | Tool | Corning | 3524 | |
| Methanol (HPLC Grade) | Reagent | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Tool | National Scientific Company | CN1700GT | |
| Glutaraldehyde solution | Reagent | Sigma-Aldrich | 49632 | |
| Osmium tetroxide solution | Reagent | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Centrifuge 5417R | Tool | Eppendorf | 022621807 | |
| F-45-30-11 fixed angle rotor | Tool | Eppendorf | 022636006 | |
| HIV-1ADA | Reagent | |||
| HIV-1 p24 mouse monoclonal antibody | Reagent | Dako | M0857 | |
| Microscope slide cover slips | Tool | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
Abbreviations used in the table: IDV: indinavir; RTV: ritonavir; ATV: atazanavir; EFV: effavirenz; PVA: polyvinylalcohol; SDS sodium dodecyl sulfate; P188: poloxamer 188 (also termed Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: methyl-poly(ethylene-glycol)1,2-distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine; DOTAP: (1-oleoyl-2-[6-[(7-nitro-2–1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]hexanoyl]-3-trimethylammonium propane); PLGA: poly(lactic-co-glycolic acid); CTAB: cetyltrimethyl ammonium bromide; DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium; MCSF: Macrophage Colony-Stimulating Factor; HPLC: high-pressure liquid chromatography; HIV-1: Human Immunodeficiency Virus-1 |
||||
References
- Gendelman, H. E. Efficient isolation and propagation of human immunodeficiency virus on recombinant colony-stimulating factor 1-treated monocytes. J Exp Med. 167 (4), 1428-1441 (1988).
- Dou, H. Development of a macrophage-based nanoparticle platform for antiretroviral drug delivery. Blood. 108 (8), 2827-2835 (2006).
- Dou, H. Laboratory investigations for the morphologic, pharmacokinetic, and anti-retroviral properties of indinavir nanoparticles in human monocyte-derived macrophages. Virology. 358, 148-158 (2007).
- Dou, H. Macrophage delivery of nanoformulated antiretroviral drug to the brain in a murine model of neuroAIDS. J Immunol. 183 (1), 661-669 (2009).
- Nowacek, A. S. Nanoformulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV-1-Infected Macrophages: Implications for NeuroAIDS Therapeutics. J Neuroimmune Pharmacol. , (2010).
- Nowacek, A. S. NanoART synthesis, characterization, uptake, release and toxicology for human monocyte-macrophage drug delivery. Nanomed. 4 (8), 903-917 (2009).
- Kalter, D. C. Enhanced HIV replication in macrophage colony-stimulating factor-treated monocytes. J Immunol. 146 (1), 298-306 (1991).
