Summary
Nanopartiklar av indinavir, ritonavir, efavirenz och atazanavir tillverkades med hjälp av våtmalning, homogenisering och ultraljud. Dessa nanoformulations, kollektivt benämnt nanoformulated antiretroviral behandling (nanoART), bedömde makrofager-baserade läkemedlet leverans. Monocyte-derived makrofager nanoART upptag, lagring och frisättningen fastställdes. Dessa preliminära studier tyder på potential nanoART för klinisk användning.
Abstract
Nanoformulated läkemedel kan förbättra farmakodynamik och biotillgänglighet medan han tjänstgjorde också till att minska läkemedelsförgiftningar för antiretroviral (ART) läkemedel. För detta ändamål har vårt laboratorium tillämpat principerna av nanomedicin att förenkla ART regimer och som sådan minskar toxicitet och samtidigt förbättra efterlevnaden och drog farmakokinetik. Enkla och tillförlitliga metoder för tillverkning nanoformulated ART (nanoART) visas. Partiklar av rent läkemedel är inkapslade i ett tunt lager av ytaktiva ämnen lipid beläggning och producerad av fraktionering större drog kristaller i mindre antingen våtmalning eller högt tryck homogenisering. I en alternativ metod, fritt läkemedel är upphängd i en droppe av en polymer. Häri är läkemedlet löst sig inom en polymer så upprörd av ultrasonication till enskilda nanostorlek droppar bildas. Dynamisk ljusspridning och mikroskopisk undersökning karakterisera de fysikaliska egenskaperna hos de partiklar (partikelstorlek, laddning och form). Deras biologiska egenskaper (cellens upptag och retention, cytotoxicitet och antiretrovirala effekt) bestäms med mänskliga monocyte-derived makrofager (MDM). MDM härrör från humant perifert blod monocyter isolerade från leukopacks använda centrifugal elutriation för rening. Sådana blodburna makrofager kan användas som cellulära transportörer för nanoART distribution till humant immunbristvirus (HIV) infekterade organ. Vi posit att ompaketeringen av kliniskt tillgängliga antiretrovirala läkemedel till nanopartiklar för HIV-1-behandlingar kan förbättra efterlevnaden och positivt påverka sjukdomen resultat.
Protocol
NanoART tillverkning
1. Våtmalning NanoART av NETZSCH MicroCer metoder
- Väg drogen kristaller och olika tensider som kommer att användas för att göra nanoformulations med en analytisk balans och blanda dem med 10 mM Hepes buffert, pH 7,8 med hjälp av en T-18 Ultraturrax mixer tills det är helt utspridda. I procent av läkemedlet i formuleringen bör vara mellan 1 - 2%.
- För kontinuerlig fräsning, se till att kylmaskinen och kompressorn är på. Utloppstrycket bör ligga runt 100 PSI innan du börjar kvarn ditt prov.
- Slå på kontrollenheten och rotera slipning tanken så att slipning media kan lastas i tanken.
- Tillsätt 50 ml av pärlor till slipning kammaren med hjälp av en tratt. Se till att det inte finns några pärlor i gängorna eller någonstans utanför slipning kammaren för att undvika läckor i den mekaniska tätningen.
- Se till att O-ringen är på sin plats på fräsning kammaren. Välj en lämplig storlek på skärmen mesh och använda lämpliga locket montering och säker locken genom att dra åt muttrarna. Skärmen maskstorleken bör vara minst hälften så stor pärlorna. Använd en stor storlek skärm maskor för att undvika att produkten från igensättning av filtret under kontinuerlig fräsning.
- Sänk slipning kammaren för att göra det horisontellt med ratten som finns på toppen av kammaren och se till att produkten utloppsröret mynnar ut i uppsamlingskärl.
- Lägg drogen fjädring med olika mängder av ytaktiva ämnen för att produkten inlopp. Den minsta av suspensionen bör vara 100 ml. Detta förhindrar att fräsning kammaren från överhettning och även undvika pärla förorening på grund av mindre slitage på delar
- Starta pumpen med styrenhet. Flödet kan varieras efter behov för din formulering (~ 50 till 150 ml / min).
- Sätt på omröraren på och justera hastigheten på kontrollenheten. Hastigheten kan ökas från 620 rpm till 4320 rpm på en MicroCer. Övervaka temperaturen med hjälp av temperaturmätare som sitter på toppen på slipning kammaren och se till att det inte finns någon överhettning.
- Mill provet vid olika hastigheter och flöden och ta ut små alikvoter (~ 1 ml) i beredningen för storlek och ladda mätningar med en Diffraktion ljusspridning Brookhaven Zetasizer (tabell 1).
- Efter önskad storlek erhålls, stoppa fräsning med styrenheten. Med pumpen fortfarande på, samla in provet i en kolv. Låt läkemedel för att helt dränera i provsamlingen kolven.
- Stäng av pumpen. För att ta bort kulorna, placera en samling fack under enheten. Lossa muttrarna på den främre plattan av locket montering och samla pärlor i facket. Ta bort frontplåten och använda ett avjoniserat vatten flaska för att tvätta kulorna i facket.
- Överför frästa suspensionen i 50 rör mL centrifugrör och sätt centrifugen till 10.000 rpm (10.174 RCF) i 30 minuter. Efter avslutad centrifugen cykeln, mäta mängden supernatanten och ersätta med samma mängd färsk tensid lösning.
- När resuspension är klar överför suspensionen till fräsning kammaren och kvarnen i 10 minuter. Tag en alikvot (~ 1 mL) och mäta storlek och laddning av provet igen med Zetasizer (tabell 1).
- Gör en post-användning rengöring av MicroCer med avjoniserat vatten och 70% etanol.
- Mät koncentrationen av nanoART formuleringar med HPLC. I vårt fall bedömde vi proverna genom omvänd fas HPLC med tre exemplar 20 mikroliter injektioner på en YMC Octyl C8 kolonn (Waters Inc., Milford, MA) med en C8 vakt patron. Mobil fas bestående av 48% acetonitril / 52% 25mm KH 2 PO 4, pH 4,15 pumpas på 0,4 ml / min med UV / VIS detektion vid 272 nm. För alla läkemedel mätningar är kvantifiering bestäms genom jämförelse med en standardkurva varje fri drog (0,025 till 100 mikrogram / ml) beredd på metanol.
2. NanoART Homogenisering med Avestin EmulsiFlex C5
- Mät drogen kristaller och olika tensider som kommer att användas för att göra nanoformulations med en analytisk balans och blanda dem med 10 mM Hepes buffert, pH 7,8 med hjälp av en T-18 Ultraturrax mixer för att få fullständig spridning.
- Överför suspensionen till homogeniserande fartyget och börja recirkulation. Se till att aggregatet är på innan du börjar homogenisera provet
- Öka trycket successivt så att mätaren visar 20 tusen ± 2000 psi och fortsätter att homogenisera tills målet partikelstorlek uppnås. Det tar vanligtvis mellan 45 - 60 minuter. Tag en alikvot (~ 1 ml) med jämna mellanrum och mäter storlek och ansvarig för provet med en Zetasizer (tabell 1).
- Överför det homogeniserade avstängning från homogeniseringsblandare till 50 rör ml centrifugrör och sätt centrifugen till 10.000 rpm (10.174 RCF) i 30 minuter. Efter avslutadcentrifugen cykeln, mäta mängden supernatanten och ersätta med en lika stor volym färska tensid lösning.
- Efter resuspension, överför suspensionen till C5 homogeniseringsblandare. Starta om cirkulationen och tillbaka homogenisering trycket till 20.000 ± 2000 psi och homogenisera under 30 minuter. Mät storleken och ansvarar för formuleringen med Zetasizer (tabell 1).
- Utför inlägg rengöring av enheten med avjoniserat vatten och etanol som lösningsmedel.
- Mäta koncentrationen av proverna med hjälp av HPLC.
3. Sonication med Cole Parmer Ultrasonic Processor
- Mät upp 50 ml diklormetan i ett glas bägare. Åtgärd 6 g av poly (mjölksyra-co-glykolsyra) (PLGA) med hjälp av analytiska balansen, lägga till diklormetan, och blanda tills fullständig upplösning observeras.
- Mät 1,25 g av läkemedlet kristaller och lägga till diklormetan / PLGA lösning. Blanda för att få fullständig upplösning.
- Gör 1% polyvinylalkohol (PVA) tensid lösning och kyla den med ett isbad. Se till att det ytaktiva lösningen är kall innan tillsats av den organiska lösning som innehåller det upplösta läkemedlet.
- Häll drogen lösningen i 1% PVA tensid lösning och börja ultrasonicator vid 50% amplitud. Se till att det ytaktiva lösningen placeras i ett isbad. Amplituden på sonicator kan reduceras till ~ 30% amplitud för mindre partier av prover. Sonikera provet i 10 minuter.
- Ta ut ett litet delprov (~ 1 ml) för partikelstorlek analys (tabell 1). Om storleken av partiklarna är större än 1,5 ìm, Sonikera provet vid 2-minuters intervall upp till max 16 minuter totalt. Observera prover under mikroskop vid 20x och observationer dokument (Figur 1A).
- Använd ett rör platta för att skapa en tillräcklig virvel för resterande upphängning och fortsätta blanda över natten i rumstemperatur.
- Väg 8 g mannitol i en kolv och tillsätt 80 ml vatten RO. Blanda tills fullständig upplösning har observerats och förvara i rumstemperatur. Detta kommer att användas för återsuspension efter centrifugering vid prov kan frystorkat.
- Samla suspensionen efter 24 timmar och häll i 50 ml tuber centrifugen. Centrifugera proverna med en hastighet av 8000 rpm under 20 minuter vid 5 ° C. Dekantera supernatanten och suspendera en halv provet i 75 ml filtrerad omvänd osmos (RO) vatten och den andra hälften i 75 ml 0,5% cetylalkohol trimetylammonium bromid (CTAB) tensid.
- Centrifugera proverna igen med en hastighet av 8000 rpm i 20 minuter vid 5 ° C och resuspendera var och en av pellets med totalt 20 ml mannitol-lösning.
- Efter den andra resuspension mäta partiklarnas storlek med Zetasizer (tabell 1).
- Använd lämpliga flaskor för att överföra resterande fjädring och placera dem i frystorkning.
- Mäta koncentrationen av proverna med hjälp av HPLC.
4. NanoART Morfologi
- Ta nanoART fjädring och kort Sonikera på 20% amplitud under 5 sekunder med en sonication sond. Överför 10 mikroliter av suspensionen till 1,5 ml av RO vatten inom ett 1,7 ml mikrocentrifugrör och vortexa i 10 sekunder.
- Ta en 50 mikroliter prov av vatten-nanoART lösning och överför till en filtreringsapparaten bestående av en Swinnex 13 polypropylen filterhållare monteras med en 0,2 ìm polykarbonat filtrering membran (Nuclepore Track-etsade). Filtreringsapparaten är laddad med 50 mikroliter 0.2μm filtrerat destillerat vatten före tillägg av den utspädda läkemedlet suspension. Vakuum tillämpas sedan på apparaten tills hela lösningen volymen har helt dragit förbi filtrering membranet.
- När membranet är torr, det är fäst på en aluminium stift stöta med dubbla stick ledande kol tejp och spotta belagda med palladium. Provet stub sedan avbildas med, i vårt fall, en JEOL JSM6300F låg spänning, fältemission svepelektronmikroskop (Figur 2).
5. NanoART Visualisering
- Ta förberedda nanoART upphängningar och Sonikera dem i 10 sekunder vid 20% amplitud med en sonication sond.
- Ta en cover objektsglas halka och placera den på ett inverterat mikroskop. På omslaget slip blandas 15 mikroliter av nanoART fjädring med 100 mikroliter av fosfat saltlösning (PBS) och blanda genom att pipettera upp och ned flera gånger. Visualisera nanopartiklar med en 20x mål (Figur 3).
Biologi nanoART
6. Isolering och Beredning av blodburna monocyter och monocyt-derived makrofager (MDM)
- Skaffa humana monocyter genom leukaferes från HIV-1 och hepatit givare seronegativa och rena cellerna genom motströms centrifugal elutriation. Bedöm cell renhetsgrad av immunolabeling med anti-CD68 (klon KP-1) Från Wright-färgade cytospins 1.
- Kultur renas monocyter i DMEM kompletterad med 10% värmeinaktiveras poolade humanserum, 1% glutamin, 50 mikrogram / ml gentamicin, 10 mikrogram / ml ciprofloxacin och 1000 U / ml rekombinant humant makrofag kolonistimulerande faktor (MCSF) vid en koncentration av 1x10 6 celler / ml vid 37 ° C i en fuktig atmosfär med 5% CO 2. Tavla 2x10 6 celler per väl i 6-brunnars plattor och celler kultur i 7 dagar för att möjliggöra monocyter att differentieras till makrofager 1. (Figur 3A)
7. Cell Upptag och Insamling
- Blanda nanoART med kultur media (utan MCSF) till en slutlig koncentration av 100 mikroM och tillsätt 1 ml av behandlingen i varje brunn.
- Vid önskad tidpunkt, eller när cellerna är fullastade med nanoART (figur 2), ta bort all behandling medelstora och tvätta cellerna tre gånger med 1 mL PBS att ta bort eventuella partiklar som inte har tagits in av cellerna. I 1 ml PBS, ta bort fastsittande celler från botten av brunnen med hjälp av en cell lyftare och placera dem i ett 1,7 ml mikrocentrifugrör 2-4.
- Centrifugera cellerna vid 1000 RCF vid 4 ° C i 10 minuter. Avlägsna supernatanten och tillsätt 200 mikroliter av 100% metanol. Lyse cellerna och lös nanoART genom att kort (2-5 sekunder) sonicating pelleten med en sonicating sond vid 20% amplitud. Förvara proverna i -80 ° C tills den ska analysera narkotikaanvändningen innehåll.
8. Intracellulär Bevarande av NanoART
- Behandla MDM som beskrivs i 7.1.
- Vid önskad tidpunkt, tvätta cellerna som beskrivs i 7,2, men istället för att genast skrapa upp celler, fixa celler för 15 minuter i rumstemperatur i en lösning av 3% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4) och ytterligare fäst dem för 10 minuter med 1% osmium Tetroxide i 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4).
- Ta bort fixativ och celler skrapa i 1 mL PBS som beskrivs i 7.2. Dessutom samlar in och centrifugera celler som beskriver i 7,2, men i stället för att lägga till metanol till pellets, tillsätt 200 ìl av glutaraldehyd Fixeringslösning.
- Skär cellpelleten i tunna (80 nm) sektioner med ett mikrotomen. Fläck avsnitten med AUC acetat och bly citrat. Observera färgade snitt med hjälp av mikroskopi transmissionselektronmikroskop (Figur 4).
9. KONST Släpp
- Behandla celler som beskrivs i 7,1-7,2, men istället för att samla in celler efter tvättning, ersätta PBS med 2 ml cellkulturmedium utan MCSF och utan nanoART.
- På angivna dagar, eller enligt cellkulturmedium vrida gult, utbyte hälften av mediet.
- Vid önskad dag, samla in 1 ml i cellen mediet tillsammans med replikera celler som beskrivs i 7,2-7,3.
- Process celler som beskrivs i 7.3. Värmebärare genom att tillsätta 150 mikroliter av medelstora provet till 1 ml 100% metanol och vortexa i full fart i 10 sekunder. Sedan Centrifugera proverna vid 21 tusen RCF i 10 minuter. Avlägsna supernatanten och överför den till ett nytt rör. Indunsta metanol med ett vakuum centrifug, detta kan ta allt från 1 till 4 timmar beroende på provet. Förvara proverna i -80 ° C tills för läkemedelsutveckling analys.
10. Real-time Upptag av NanoART av konfokalmikroskopi
- Ta mogna MDM från steg 6,2 och märka cellerna med hjälp av en lösning cell märkning som Vybrant Cell Märkning lösning efter tillverkningen instruktion. Skölj cellerna tre gånger med 1 ml odlingsmedium för att eventuell överskottsfärg skall försvinna.
- Blanda nanoART med odlingsmedium som i steg 7,1 med hjälp av fluorescerande nanoART.
- Lägg till behandling medium med märkta nanoART omedelbart före avbildning med en konfokalmikroskop. Ta en bild var 30 sekund i 4 timmar med ett 60x objektiv 5 (Videos 1 & 2).
HIV-1 infektion och analyser Smittsamhet
11. HIV-1 ADA infektion
- Behandla celler som beskrivs i 9,1-9,3.
- På önskad dagar, ta bort alla medium och ersätta med medium, utan MCSF, som innehåller HIV-1 ADA vid en mångfald av infektion på 0,01 viruspartiklar / cell och inkubera i 24 timmar 1. Ta bort virus medium och ersätta med färsk, virus-fria medier. Kultur celler för 10 dagar utbyte halv medellång varannan dag eller som behövs för att hålla cellerna vid liv (Figur 5) 6.
- Tio dagar efter infektion samlar 10 mikroliter av medel från varje brunn, plats i en 96-brunnar, och förvara vid -80 ° C tills den ska utföra retrovirus (back) transkriptas analys.
12. Omvänt transkriptas (RT) analys
- Med varje 10 mikroliter prov från steg 11,3, blanda 10 mikroliter av lösning som innehåller 100 mM Tris-HCl (pH 7,9), 300 mm KCl, 10 mm DTT, 0,1% phenoxylpolyethoxylethanol-40 (NP-40) nonylfenol, och vatten. Inkubera denna blandning i 15 minuter vid 37 ° C 7.
- Efter inkubationen, tillsätt 50 mikroliter av iskall 10% triklorättiksyra (TCA) i varje brunn. Harvest brunnarna på filter glasfiber, och bedöma filter för 3 H-TTP införlivande genom β-scintillation spektroskopi 7.
13. HIV-1p24 detektion
- Tvätta replikera celler som retroviral transkriptas medelstora prov togs bort i steg 11,3 genom att skölja med 1 mL PBS 3 gånger.
- Fix celler med 4% paraformaldehyd över natten vid 4 ° C. Följande morgon skölja celler 3 gånger med PBS.
- Använd musen monoklonala antikroppar mot HIV-1 p24 (1:10, Dako, Carpinteria, CA) för att visualisera HIV-infektion. Bild celler under ljusa fält med en 40x mål (Figur 6).
14. Representativa resultat:
| Drog | Storlek (Nm) | PDI | Charge (Mv) | Surfactants |
| IDV | 1052 | 0,286 | -24,58 | 0,5% P188, 5,0% SDS, 9,25% sackaros |
| RTV | 233 | 0,273 | -7,47 | 0,5% P188, 9,25% sackaros |
| ATZ | 840 | 0,192 | 25,47 | 0,5% P188, 0,1% MPEG 2000-DSPE, 1,0% DOTAP, 9,25% sackaros |
| EFV | 347 | 0,235 | -13,52 | 1,0% PVA |
Tabell 1. Fysikaliska egenskaper nanoART
Tabell visar potentialen representativa värden för de fysiska egenskaperna hos nanoART formuleringar tillverkas med de angivna tensider. Värden är medeldiametern baserad på intensiteten av spridda ljuset, polydispertion index (PDI, en uppskattning av fördelningen av partikelstorlek) och Zeta värden potential som erhålls för olika nanoformulation prover. Förkortningar i tabellen: IDV: indinavir, RTV: ritonavir, ATV: atazanavir; EFV: effavirenz; PVA: polyvinylalcohol; SDS natriumdodecylsulfat, P188: poloxamer 188 (även kallad Pluronic F68), MPEG 2000-DSPE: metyl-poly (etylen-glykol) 1,2-distearoyl-fosfatidyl-etanolamin, DOTAP: (1-oleoyl-2-[6 - [(7-nitro-2-1 ,3-benzoxadiazol-4-yl) amino] Hexanoyl] - 3-trimetylammonium propan.
FIGUR 1. Flödesschema sammanfatta olika metoder används för att tillverka nanoART.
Figur 1 sammanfattar de olika metoder som används för att tillverka nanoART. Flödesschemat inkluderar en förväntad tid tilldelning för var och en av de kritiska faserna av respektive metoder.
FIGUR 2. Representant bilder av önskade och oönskade NanoART morfologi. Svepelektronmikroskop analys (förstoring, 15.000 X) av RTV nanoART produceras av homogenisering, våtmalning och ultraljudsbehandling på toppen av en 0,2 ìm polykarbonat filtrering membran. Mät bar lika med 2,0 mikrometer i alla ramar. Önskvärt nanoART består i genomsnitt av små (≤ 2 mikrometer) sluten partiklar med jämna kanter som tenderar att ha samma eller liknande form. Oönskade nanoART varierar mycket i både storlek och form och kan säkring och / eller hålla sig till varandra.
FIGUR 3. Bilder på önskvärt nanoART lösning och av MDM ta upp nanoART. Ljusa fält mikroskopi-bilder (samtliga förvärvade med en 20x mål) av homogeniserade RTV-NP och MDM tar upp nanoART. Efter att kombinera 10 mikroliter av RTV-NP lösning med 100 mikroliter PBS på toppen av en glaskupa slip, partiklarna är synliga och liknar sand med endast ett fåtal av de större partiklarna som identifieras individuellt (A). Bild av helt differentierade och spindel formade MDM innan nanoART behandling (B). Efter att cellerna tagit upp nanoART, blir de mörkare och deras kärnor att bli tydligare på grund av perinukleära distribution av nanoART, men de behåller sina spindel formade cellkroppen (C). När celler blir överbelastad med nanoART, kärnan blir skymd, och cellerna blir rundade, förlorar sin spindel formad struktur och eventuellt lossnar från botten av brunnen (D).
4 "/>
FIGUR 4. Bekräftelse av cellulära inkorporering av nanoART i MDM. Transmissionselektronmikroskopi (förstoring, 15.000 x) visar upptag av nanoART i MDM utsätts för RTV-NP från homogenisering (A), RTV-NP från våtmalning (B), RTV-NP från ultraljudsbehandling (C), och obehandlade celler (D ). I cellerna bör nanoART vara lätta att identifiera genom deras geometriska form. Notera avsaknaden av tydliga geometriska strukturer i kontrollen cell (D). Ett exempel på varje partikel har skisserats: röd för homogenisering (A), blå för våtmalning (B), grönt för ultraljudsbehandling (C). Partikel struktur bör likna det som sågs med hjälp av SEM. Mät bar lika med 5,0 mikrometer i alla ramar.
Figur 5. Schema över metod för att testa antiretrovirala effekt nanoART. För att testa möjligheterna för nanoART att hämma virusreplikationen MDM först måste behandlas med nanoART och sedan utsättas för HIV-1-ADA. I likhet med ART släppa studierna, är MDM laddade med nanoART och sedan tvättas för att avlägsna partiklar som inte har internaliserat. NanoART lastade MDM sedan odlas upp till 15 dagar med en halv medelstora byta varannan dag. Under denna tid (i allmänhet på dag 1, 5, 10 och 15) MDM utmanas med HIV-1 ADA. Efter varje virus exponering celler odlas i ytterligare 10 dagar för att låta infektionen till framsteg. På dag 10 efter infektion medier prover samlas in för RT analys och celler fasta och färgas för p24-antigen. Icke-nanoART behandlas MDM, både infekterade och oinfekterade, är också odlas parallellt och testas för förekomst av p24-antigen och RT aktivitet.
Figur 6. Testning av nanoART effekt hos HIV-1 infekterade MDM av p24-färgning. Ljusa fält bilder (20x mål) av RTV-NP behandlas MDM 10 dagar efter att utmanas med HIV-1 ADA. Ingen infektion var närvarande när celler utmanas med virus1 dag efter nanoART behandling (A), notera förekomsten av nonylfenol i cytoplasman hos de flesta celler (en infälld indikeras med pilar). Infektion var närvarande när cellerna utsattes för viruset 10 dagar efter nanoART behandling (B), även om mycket mindre än celler som inte behandlas med nanoART (D), notera underhållas förekomsten av nonylfenol i vissa celler (B infällda indikeras med pilar), men färre än vid dag 1 efter nanoART behandling (A infälld). Bild av celler som varken behandlades med nanoART eller smittad (C), notera avsaknaden av nonylfenol i cellens cytoplasma (C infälld). Bild av celler som inte behandlades med nanoART men utsätts för HIV-1-ADA (D).
VIDEO 1. Levande cell konfokalmikroskopi av dålig RTV-NP upptag av MDM. Fluorescerande mikroskopi av MDM märkt grönt med Vybrant DIO cell-märkning lösning och behandlas med röda märkt RTV-NP. En bild togs var 30 sekund för 4 timme vid 60x förstoring. Klicka här för att se på video
VIDEO 2. Levande cell konfokalmikroskopi framgångsrika RTV-NP upptag av MDM. Fluorescerande mikroskopi av MDM märkt grönt med Vybrant DIO cell-märkning lösning och behandlas med röda märkt RTV-NP. En bild togs var 30 sekund för 4 timme vid 60x förstoring. Klicka här för att se på video
Discussion
NanoART är utformade för att förbättra hiv-1 läkemedel. Vi har föreslagit en monocyt-makrofagcellinjer baserade Drug Delivery System som ett första steg för att utveckla sådan teknik för klinisk användning och som ett laboratorium testa system för nanoformulated läkemedelsutveckling. Våra tidigare arbeten har visat att systemet är lönsamt för en sådan ansökan 5,6.
I den aktuella rapporten har vi illustrerat metoder för att syntetisera NP i vanliga HIV-1 läkemedel (indinavir, IDV, ritonovir, RTV, efavirenz, EFV och atazanavir, ATV). Detta uppnåddes genom våtmalning, homogenisering och ultraljud. Viktigt möjliggör vår strategi för ändringar av nanoART fysiska egenskaper såsom storlek, form och ladda 5,6. Genom noggrant urval av ytaktiva ämnen, kan man styra hand om partiklar från mycket negativ till neutral till mycket positiv. Genom att ändra handläggningstiden och intensitet, kan man styra storleken och göra så små partiklar som ≤ 200 nm eller lika stor som ≥ 3 mikrometer. Formen på partikeln kan också kontrolleras, men i mindre utsträckning än övriga fysiska egenskaper. Till exempel kan sfäriska partiklar göras via ultraljudsbehandling med polymerer medan mångsidig geometriska former kan framställas genom våtmalning eller homogenisering. Våtmalning och homogenisering producera olika formade partiklar, men denna process är beroende av fraktionering metoden och kan inte direkt kontrolleras för. Dessa egenskaper av tillverkningsmetoderna kan göra det möjligt forskningar att enkelt producera nanoART till exakta specifikationer för konstruktionen. Detta är oerhört viktigt eftersom fysikalisk-kemiska egenskaper nanoART ha en kraftfull effekt på både stabilitet och hur de interagerar med celler. Till exempel har vi visat att nanoART som är ca 1 mikrometer i storlek, har en stark positiv laddning, och har en multisided geometrisk form är snabbare tas upp av makrofager, stabilare gång inne i cellerna, och släppte över en längre period av tiden 6.
En metod för att testa nanoART har utvecklats som möjliggör enkel screening av partiklarnas förmåga att tas upp, bevaras och släpptes av makrofager, en av cellerna principen mål av HIV-1, utöver deras förmåga att hämma virusreplikation. Detta gör att man lätt skilja nanoART baserat på prestation och identifiera de som har bäst chans att lyckas i en in vivo-modell, vilket ökar både effektivitet och snabbhet för att utveckla nanoART för humant bruk.
Det har visat att benmärg från mus makrofager när den är lastad ex vivo med nanoART och adoptively överförs genom intravenös injektion i humaniserad HIV-1 infekterade möss kan resa till ställen där aktiv infektion, inklusive det centrala nervsystemet, och droger övergå till upp till 2 veckor att hämma virusreplikation 2-4. Dessutom var dessa nanoART laddade celler också möjlighet att effektivt minska antalet virusinfekterade celler i plasma, lymfkörtlar, mjälte, lever och lungor samt skyddar CD4 + celler 2. Dessa studier, även om preliminära, visar att en cellmedierad nanoART leveranssystem kan distribuera kliniskt signifikanta mängder av drogen för att både blod och infekterade vävnader. På grund av de uppmuntrande preliminära resultat från HIV-1 infekterade möss studier, utvecklar vi nu ett Simian immuno deficiency virusinfekterade makak-modellen för att ytterligare testa potentialen av nanoART för klinisk användning.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Arbetet har finansierats med bidrag 1P01DA028555-01A1, 2R01 NS034239, 2R37 NS36126, P01 NS31492, P20RR 15.635, P01MH64570 och P01 NS43985 (till HEG) från National Institutes of Health. Författarna tackar Ms Robin Taylor för kritisk läsning av manuskriptet och enastående grafik och litterära stöd. Vi vill tacka Steve Grzelak för hans våta-fräsning expertis. Vi vill också tacka Dr Han Chen vid University of Nebraska-Lincoln elektronmikroskopi core facilitet för att leverera de skanning och transmissionselektronmikroskopi bilder mikroskopi. Slutligen vill vi tacka Megan Marquart för hennes expertis använder levande konfokalmikroskopi.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| nanoART Manufacture | ||||
| Indinavir sulfate | Reagent | Longshem Co., Shanghai, China | Cas # 157810-81-6 | |
| Ritonavir | Reagent | China Shengda Pharmaceutical Company, China | Cas # 155213-67-5 | |
| Atazanavir sulfate | Reagent | Gyma Laboratories of America INC | Cas # 198904-31-3 | |
| Effavirenz | Reagent | Hetero Labs LTD, India | Cas # 154598-52-4 | |
| PVA | Reagent | Sigma-Aldrich | P 8136 | |
| SDS | Reagent | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Sucrose | Reagent | Fluka | 84097 | |
| P188 | Reagent | Sigma-Aldrich | P 1300 | |
| mPEG 2000-DSPE | Reagent | Genzyme | LP-R4-039 | |
| Dotap | Reagent | Avanti Polar Lipid, Inc | 890890 P | |
| Hepes | Reagent | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| PLGA 75:25 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1941 | |
| Dichloromethane | Reagent | Acros Organics | 75-09-2 | |
| Mannitol | Reagent | Sigma-Aldrich | M9546 | |
| CTAB | Reagent | Sigma-Aldrich | H 9151 | |
| Analytical Balance | Tool | Denver Instrument | ||
| T-18 Mixer | Tool | IKA | ||
| Ultra Sonicator | Tool | Cole-Parmer | ||
| Wet milling, MicroCer | Tool | Netzsch Fine Particle Technology, LLC | ||
| Homogenizer, EmulsiFlex-C5 | Tool | Avestin, Inc. | ||
| Zetapotentiometer | Tool | Malvern Instruments | ||
| Gas Manifold System | Tool | Victor Technologies | ||
| In Vitro Testing | ||||
| DMEM | Reagent | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15710-064 | |
| Ciprofloxin | Reagent | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| Human MCSF | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-093-964 | |
| Pooled normal human serum | Reagent | Cole-Parmer | WU-88061-68 | |
| 6-well tissue culture plates | Tool | Corning | 3524 | |
| Methanol (HPLC Grade) | Reagent | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Tool | National Scientific Company | CN1700GT | |
| Glutaraldehyde solution | Reagent | Sigma-Aldrich | 49632 | |
| Osmium tetroxide solution | Reagent | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Centrifuge 5417R | Tool | Eppendorf | 022621807 | |
| F-45-30-11 fixed angle rotor | Tool | Eppendorf | 022636006 | |
| HIV-1ADA | Reagent | |||
| HIV-1 p24 mouse monoclonal antibody | Reagent | Dako | M0857 | |
| Microscope slide cover slips | Tool | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
Abbreviations used in the table: IDV: indinavir; RTV: ritonavir; ATV: atazanavir; EFV: effavirenz; PVA: polyvinylalcohol; SDS sodium dodecyl sulfate; P188: poloxamer 188 (also termed Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: methyl-poly(ethylene-glycol)1,2-distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine; DOTAP: (1-oleoyl-2-[6-[(7-nitro-2–1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]hexanoyl]-3-trimethylammonium propane); PLGA: poly(lactic-co-glycolic acid); CTAB: cetyltrimethyl ammonium bromide; DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium; MCSF: Macrophage Colony-Stimulating Factor; HPLC: high-pressure liquid chromatography; HIV-1: Human Immunodeficiency Virus-1 |
||||
References
- Gendelman, H. E. Efficient isolation and propagation of human immunodeficiency virus on recombinant colony-stimulating factor 1-treated monocytes. J Exp Med. 167 (4), 1428-1441 (1988).
- Dou, H. Development of a macrophage-based nanoparticle platform for antiretroviral drug delivery. Blood. 108 (8), 2827-2835 (2006).
- Dou, H. Laboratory investigations for the morphologic, pharmacokinetic, and anti-retroviral properties of indinavir nanoparticles in human monocyte-derived macrophages. Virology. 358, 148-158 (2007).
- Dou, H. Macrophage delivery of nanoformulated antiretroviral drug to the brain in a murine model of neuroAIDS. J Immunol. 183 (1), 661-669 (2009).
- Nowacek, A. S. Nanoformulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV-1-Infected Macrophages: Implications for NeuroAIDS Therapeutics. J Neuroimmune Pharmacol. , (2010).
- Nowacek, A. S. NanoART synthesis, characterization, uptake, release and toxicology for human monocyte-macrophage drug delivery. Nanomed. 4 (8), 903-917 (2009).
- Kalter, D. C. Enhanced HIV replication in macrophage colony-stimulating factor-treated monocytes. J Immunol. 146 (1), 298-306 (1991).
