Summary
分子プローブPicoGreen色素とマイクロプレートリーダーアクセサリを装備した日立F - 7000蛍光分光光度計を使用してdsDNAの定量化のデモンストレーション。
Abstract
特に低濃度のDNAの定量化は、合成および精製DNAの、このようなDNA増幅産物の定量化などの診断アプリケーション、および薬剤のDNA分子の検出などの標準的な分子生物学的アッセイを含む生物学的用途の広い範囲で重要な課題である準備。このビデオの間に我々は、分子プローブクワント - それPicoGreen色素試薬キットを用いて二本鎖DNAの定量を行うためにマイクロプレートリーダーアクセサリを装備した日立F - 7000蛍光分光光度計の機能のデモンストレーションを行います。
F - 7000蛍光分光光度計は、高感度と高速測定を提供しています。それは、蛍光、発光、および燐光を測定することができる柔軟性の高いシステムです。いくつかの測定モードは波長スキャン、時間のスキャン、測光と3次元スキャン測定を含めて、利用可能です。分光光度計は、マイクロプレートに300μLサンプル量を使用する場合はフルオレセインの50ピコモルの範囲で感度を有し、および60,000 nm /分のスキャン速度を測定することができます。また、濃度の広い範囲で検量線の使用を可能にする5桁までの広いダイナミックレンジを持っています。光学系は、最大エネルギーと感度のすべての反射光学系を使用しています。標準的な波長範囲は200〜750nmのであり、そしてオプションの近赤外光電子増倍管のいずれかを使用するときに900nmのように拡張することができます。システムは、オプションの外部温度制御された液体循環装置を使用して摂氏5〜60度からプレートリーダー用のオプションの温度制御が可能になります。マイクロプレートリーダーは、96ウェルマイクロプレートの使用を可能にする、と動力学のモードを使用する場合は96ウェルの測定速度は60秒未満です。
F - 7000とマイクロプレートリーダーのためのソフトウェアのコントロールも非常に柔軟です。サンプルは、列または行の形式のいずれかで設定でき、井戸の任意の組み合わせは、サンプル測定用に選択される可能性があります。これは、マイクロプレートの最適な利用が可能になります。さらに、ソフトウェアはマイクロプレートのサンプル構成Excelで作成し、カンマで区切られた値に保存されている、または"CSV"形式をインポートできます。マイクロプレート測定の設定が保存され、利便性のためのソフトウェアと生産性の向上によって呼び出すことができます。データの結果は、標準レポートには、Excelに、または任意のレポート生成プログラムに出力することができます。
Protocol
1。楽器のセットアップ
- 蛍光分光光度計の電源を入れ、1時間ウォームアップ。
- Excelは、図1に示すように、標準およびサンプルデータを持つファイルを作成し、そのコンマで区切られた値"CSV"形式で保存する方法。
図1。スタンダードとサンプルデータ。 - 次のように蛍光光度計を設定します。
- をクリックしてください
ボタン、これは図2に示すように解析手法のウィンドウが、開きます。 
図2。分析法のウィンドウ、[全般]タブ。
次のように選択します。- "測定"フィールドで、プルダウンメニューから測光を選択します。
- "オペレータ"フィールドで、適切な演算子の名前を入力します。
- "インストゥルメント"フィールドに情報を入力する必要はありません。これは、ソフトウェアによって自動的に選択されます。
- マイクロプレートリーダーを使用する場合は"サンプリング"フィールドは非アクティブです。
- あなたが"コメント"フィールドに、レポートに含めることができる任意のコメントを入力してください。
- "アクセサリー"フィールドに、このテストのために使用されるアクセサリーに関連する情報を入力してください。
- ウィンドウの右側のボタンに注意してください。
- "読み込み"ボタンをクリックすると、以前に保存された分析メソッドをロードすることができます。
- "Save"ボタンは、同じ名前を使用して、以前に保存し、ロードテストパラメータや解析手法のセットを更新できます。
- ボタンは任意の名前の下に、テストパラメータや解析手法の新しいセットを保存できる"名前を付けて保存"。
図3。分析法の窓、定量タブ。- "定量のタイプ"フィールドでは、波長を選択します。これは、蛍光読み取りが選択された波長を使用して行われることを示します。
- "キャリブレーションのタイプ"フィールドで、1回目の順番を選択します。
- "波長の数"フィールドに、1を選択します。
- "濃度の単位"フィールドで、ng / mLを入力してください。
- "マニュアルキャリブレーション"と"ゼロを介してフォースカーブ"のチェックボックスを選択しないままにします。
- フィールド"小数点以下の桁"で、2を選択します。
- "低濃度の上限"フィールドで、0を入力します。
- "アッパー濃度限界のフィールドでは、10000を入力します。
今すぐ"インストゥルメント"タブをクリックし、次の選択を行います。
図4。分析法のウィンドウ、インストゥルメント]タブ- "データモード："フィールドで、蛍光を選択します。
- "チョッピング速度"フィールドはこの時点で非アクティブになって、それはリン光測定のためにのみ使用されます。
- "波長モード"フィールドでは、どちらのWLの固定]を選択します。
- "EX / WL1"フィールドに480nmと入力します。
- "EM / WL1"フィールドでは520nmを入力してください。
- 他のすべてのEXの下のフィールドとEMはこの時点で非アクティブです。
- "EXスリット"フィールドで、プルダウンメニューから5.0nm]を選択します。
- "EMスリット"フィールドで、プルダウンメニューから5.0nm]を選択します。
- "PMT電圧1 - 1000V"フィールドの前にあるボックスを選択しないままにします。
- "PMT電圧"フィールドで、プルダウンメニューから700Vを選択します。
- の"自動統計のcalc。番号"フィールドを選択します2。
- "レプリケート"フィールドで1を選択します。
- "積分時間"フィールドでは0.1秒を選択します。</ LI>
- "遅延"フィールドに入力するか、または0を選択します。
図5。分析法のウィンドウ、[モニタ]タブ。- フィールドを選択10000："Y軸"、"マックス"の
- "Y軸"で、"最小："フィールド、0を選択します。
- "データ収集後のオープンデータの処理"の左側にあるボックスを選択します。
- もし測定値が完了した後に自動的に印刷するレポートを必要とする場合を除き、"データ取得後のレポート印刷"の左にあるボックスを選択しないままにします。
図6。分析法のウィンドウ、レポートタブ。- "出力"フィールドで、プルダウンメニューからレポートの印刷]を選択します。また、カスタムメイドのレポートを生成できるようにするプログラムのレポート生成プログラムで、オプションのアドインを使用する場合は、"印刷ジェネレータシートを使用して、"Excelにエクスポートされたデータが必要な場合は、"Microsoft Excelを使用する"、または選択することもできます。
- レポートに含まれるようにしたい項目のチェックボックスをクリックしてください。
- "分析方法"ウィンドウの別のタブで選択されたすべてのパラメータを保存するには、""全般"タブを再度クリックし、ファイル名の下にし、将来の使用のためにそれらを見つけるような場所に保存し、クリックします。 OK"このウィンドウを閉じるためのボタン。
- これにより、機器の試験パラメータの設定は完了です。
- 今我々はマイクロプレートリーダーを設定します。
- をクリックしてください
![アイコン[2]](//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/2465/2465icon2.jpg)
上にMPR Setupウィンドウをもたらすボタン、。
図7。 MPR Setupウィンドウ、プレートタブ。- A1の位置をクリックして、E1にマウスをドラッグし、次にをクリックしてください
ボタン。これは、標準に使用される位置を選択します。それらの位置は、緑の色で強調表示されます。 - 今、私たちは、サンプルのH3にF1の位置を選択する必要があります。をクリックしてクリックし、位置のF1で起動するマウスをドラッグして、H3の位置をすると
ボタン、これは黄色の色でそれらの位置が強調表示されます。 - その後、サンプルの測定のためのそれらの位置を選択するには、E3にA2の位置に対して同じ操作を繰り返します。
- 今、標準とサンプルの情報と予め用意された変数（CSV）ファイル区切りファイルのカンマをロードしてみましょう。
図8。 MPR Setupウィンドウ、きちんとした情報]タブ。- 次にをクリックしてください
ボタン。 Windowsエクスプローラのウィンドウには、"まあinformation.csv"ファイルを探し、それをロードできるようになりますれ、図9に示すように、どのように表示されます。 
図9。サンプルウェルの情報をロード。
"まあ情報"ファイルをロードした後、"まあ情報は、"図10に示すようになります
図10。サンプルも情報をロードしました。
- をクリックしてください
ボタン、これは図2に示すように解析手法のウィンドウが、開きます。 
![アイコン[2]](http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/2465/2465icon2.jpg)
上にMPR Setupウィンドウをもたらすボタン、。 
ボタン。これは、標準に使用される位置を選択します。それらの位置は、緑の色で強調表示されます。 
ボタン、これは黄色の色でそれらの位置が強調表示されます。 
ボタン。 Windowsエクスプローラのウィンドウには、"まあinformation.csv"ファイルを探し、それをロードできるようになりますれ、図9に示すように、どのように表示されます。 
2。 Picogreenアッセイサンプルの準備
- 20 × TEバッファー1mlを加えることによって1 × TEバッファー（10mMトリス- HCl、1mMのEDTA）を準備〜19 mLののdI H 2 O
- 9.95 mLの1 × TEバッファーに50μlの200 X PicoGreen試薬を添加することによりPicoGreen試薬溶液を準備します。
- 株式鎖DNA（100μg/ mLの）の段階希釈を行うことによって基準（ラムダdsDNAを）準備する。最初の株式のdsDNA（100μg/ mL）を、25μLの1 × TEバッファー25μLを加えることによって50μg/ mlのdsDNAの溶液を調製。次に、以下の表に示すように二本鎖DNAとバッファの指定されたボリュームを追加することによって、標準溶液を調製。
dsDNAの濃度 dsDNAの体積 Bufferの量 1μg/ mlの 50μg/ mlのdsDNAの20μL 980μLの1 × TEバッファー は0.1μg/ mLの 1μg/ mlのdsDNAの100μL 900μL1 X TEバッファー 0.01μg/ mLの は0.1μg/ mLのdsDNAの100μL 900μL1 X TEバッファー 0.001μg/ mLの 0.01μg/ mLのdsDNAの100μL 900μL1 X TEバッファー
3。スタンダードとサンプルの蛍光の測定
- ピペット150 96ウェルプレートのウェルA1 - E1にそれぞれ標準のμL、図7に当たり、および次の表によると：
も 標準的な A1 1μg/ mlの B1 は0.1μg/ mLの C1 0.01μg/ mLの D1 0.001μg/ mLの E1 1 X TEバッファー - 図7に示すように、H3に井戸F1ピペット150μLの未知試料、
- マルチチャンネルピペットを使用するように設計された溝にステップ1.2で作成したPicoGreenソリューションを注ぐ。井戸A1 - H3〜150μLPicoGreenソリューションを提供するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。静かにピペットで混合液と標準。
- 場所は、暗い領域でプレートと開発するために反応のために2〜5分待ちます。
4。代表的な結果
良好な検量線は、ソフトウェアによる検量線の基準と計算の測定時にF - 7000のソフトウェアが提供する様々なパラメータを用いて評価されます。
決定係数は、測定基準の適合度と計算された検量線を示します。近いこの値は測定値と検量線のフィットより、"1"になります。
値が"1"から離れている場合、基準は、再測定を再度準備、または検量線のフィットネスは、変更する必要があります。
図11は、PicoGreen色素を使用してdsDNAの定量化のために得られる計算された決定係数= 0.99993、と検量線の例を示しています。
図11。本鎖DNAの検量線の例。
Discussion
慎重な試料調製時のピペッティングだけでなく、安定かつ高感度蛍光分光光度計を使用しては良いと再現性のある結果を得るために不可欠です。
このテストで使用される蛍光分光光度計の場合には、それをマイクロプレートリーダーで300μL最終的なサンプル量を使用して提案されている。下のボリュームは感度を低下させ、より大きなボリュームでは、ウェル間のクロスコンタミネーションを引き起こす可能性があります。
Disclosures
ルイスA.モレノとケンドラL.コックスは、この記事で使用する機器を生産する（株）日立ハイテクノロジーズアメリカで採用されています。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled H2O | Reagent | |||
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen | Reagent | P7589 | ||
| Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108 | Supply | 237108 | ||
| 12 Channel Eppendorf Micropipette | Supply | 3516677 | ||
| 1000 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 200 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 10 mL serological pipet | Supply | |||
| Aluminum foil | Supply | |||
| Pipette tips | Supply | |||
| Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1 | Equipment | 5J1-0003 | ||
| Microplate Reader Accessory for F-7000 | Equipment | 5J0-0139 |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).
