Summary
Demonstração de quantificação de dsDNA usando Molecular Probes PicoGreen corante e Hitachi Espectrofotômetro de Fluorescência F-7000 equipado com um acessório de leitor de microplacas.
Abstract
Quantificação de DNA, especialmente em pequenas concentrações, é uma tarefa importante, com uma ampla gama de aplicações biológicas, incluindo padrão ensaios de biologia molecular, tais como síntese e purificação do DNA, aplicações de diagnóstico, tais como a quantificação de produtos de amplificação de DNA, e detecção de moléculas de DNA em drogas preparações. Durante este vídeo vamos demonstrar a capacidade do espectrofotômetro Hitachi F-7000 de fluorescência equipado com um acessório Placa Micro Reader para realizar dsDNA quantificação usando Molecular Probes Quant-it PicoGreen kit reagente corante.
O Espectrofotômetro de Fluorescência F-7000 oferece alta sensibilidade e medições em alta velocidade. É um sistema altamente flexível, capaz de medir a fluorescência, luminescência, e fosforescência. Vários modos de medição estão disponíveis, incluindo comprimento de onda de digitalização, digitalizar tempo, fotometria e 3-D de medição de varredura. O espectrofotômetro tem sensibilidade na faixa de 50 picomoles de fluoresceína quando se utiliza um volume de amostra 300 mL na microplaca, e é capaz de medir velocidades de digitalização de 60.000 nm / minuto. Ele também tem uma ampla faixa dinâmica de até 5 ordens de magnitude, que permite o uso de curvas de calibração em uma ampla faixa de concentrações. O sistema óptico utiliza todos óptica reflexiva para o máximo de energia e sensibilidade. A faixa de comprimento de onda padrão é de 200 a 750 nm, e pode ser estendido a 900 nm quando se usa um dos opcionais perto fotomultiplicadores infravermelho. O sistema permite o controle de temperatura opcional para o leitor de placas 5-60 graus Celsius usando um externo opcional de temperatura controlada circulador de líquido. O leitor de microplaca permite o uso de 96 microplacas bem, ea velocidade de medição para 96 poços é menos de 60 segundos ao usar o modo cinética.
Controles de software para a F-7000 e Leitor de Microplacas também são altamente flexíveis. As amostras podem ser definidos em formatos uma coluna ou linha, e qualquer combinação de poços podem ser escolhidas para medições da amostra. Isto permite uma utilização óptima da microplaca. Além disso, o software permite importar as configurações da placa micro amostra criados no Excel e salvas em valores separados por vírgula, ou "csv" formato. Configurações microplaca de medição podem ser salvas e recuperadas pelo software para a conveniência e aumento da produtividade. Resultados dos dados pode ser saída para um relatório padrão, para o Excel, ou para um programa opcional Report Generator.
Protocol
1. Configuração do Instrumento
- Ligue o espectrofluorímetro e deixe aquecer por 1 hora.
- Usando o Excel cria um arquivo com as Normas e os dados da amostra, como mostrado na Figura 1 e salve-o em comma separated values "csv" formato.
Figura 1. Padrões e dados de amostras. - Configurar fluorímetro da seguinte forma:
- Clique na
botão, isto irá abrir a janela de Método de Análise, mostrado na Figura 2. 
Figura 2. Janela Método de Análise, na guia Geral.
Faça as seguintes seleções:- Na "medição" de campo, selecione Fotometria do menu suspenso.
- Em "Operador", digite o nome do operador apropriado.
- Não há necessidade de inserir informações no "Instrumento" campo. Esta é selecionado automaticamente pelo software.
- A "amostragem" de campo é inativa quando se utiliza o leitor de microplacas.
- Digite comentários que você pode querer incluir no relatório no campo "Comentários".
- No "acessório" de campo, insira as informações relacionadas com os acessórios utilizados para este teste.
- Nota os botões do lado direito da janela.
- O botão "Load" permite carregar Métodos de Análise salvo anteriormente.
- O botão "Salvar" permite a atualização de um conjunto de parâmetros de teste ou método de análise anteriormente salvo e carregado, usando o mesmo nome.
- O "Salvar como" botão permite salvar um novo conjunto de parâmetros de teste ou Método de Análise com um nome desejado.
Figura 3. Janela Método de Análise, guia quantitativa.- No "A determinação quantitativa do tipo" campo, selecione Wavelength. Isto indica a leitura de fluorescência será feita utilizando o comprimento de onda selecionado.
- Na "calibragem" tipo de campo, selecione 1 ª ordem.
- No "Número de comprimentos de onda" de campo, selecione 1.
- Na "Concentração unidade" de campo, entrar ng / mL.
- Deixe desmarcado as caixas para "Manual de Calibração" e "Força através da curva de zero".
- No "Digit após ponto decimal" campo, selecione 2.
- Na "Baixa-limite de concentração", digite 0.
- No campo limite "superior de concentração, digite 10000.
Agora clique em "Instrumento" guia e faça as seguintes seleções.
Figura 4. Janela de análise do método, guia Instrumento- No "modo de dados:" campo, selecione Fluorescência.
- O "Chopping velocidade" campo está inativo no momento, ele é usado somente para medições de fosforescência.
- No "modo de comprimento de onda" de campo, selecione Ambos fixo WL.
- Na "EX / WL1" field entrar 480nm.
- No "EM / WL1" field entrar 520nm.
- Todos os outros campos sob EX e EM estão inativos no momento.
- Na "EX fenda" campo selecione 5.0nm do menu suspenso.
- No "EM fenda" campo selecione 5.0nm do menu suspenso.
- Deixe desmarcada a caixa na frente da "Tensão PMT 1-1000V" campo.
- No "PMT Voltage" campo, selecione 700V do menu suspenso.
- No "Auto calc estatística. Número" campo selecione 2.
- No "Replica" campo selecione 1.
- No "tempo de integração" campo selecionar 0.1s. </ Li>
- No "Delay" campo de digitar ou selecionar 0s.
Figura 5. Janela de análise do método, guia Monitor.- No "eixo Y", "Max:" campo, selecione 10000
- No "eixo Y", "Min:" campo, selecione 0.
- Selecione a caixa à esquerda do "Aberto de processamento de dados após a aquisição de dados".
- Deixe desmarcada a caixa à esquerda do "relatório de impressão depois de aquisição de dados", a menos que você queira um relatório a ser impresso automaticamente após as leituras sejam concluídas.
Figura 6. Janela de análise do método, guia do relatório.- Na "saída" de campo, selecionar Imprimir relatório do menu suspenso. Você também pode selecionar "Use Microsoft Excel" se você deseja que os dados exportados para o Excel, ou "Use Folha Generator Imprimir" se estiver usando o suplemento opcional no Gerador de Relatórios programa que permitirá gerar relatórios personalizados feitos.
- Clique nas caixas para os itens que você quer ser incluído no relatório.
- Para salvar todos os parâmetros selecionados nas diferentes guias do "Método de Análise" janela, clique novamente na guia "Geral" e salvá-las sob um nome de arquivo e em um local onde você pode encontrá-los para uso futuro, e clique no botão " OK "para fechar esta janela.
- Isso completa a criação de parâmetros de teste do instrumento.
- Agora vamos configurar o leitor de microplaca.
- Clique na
botão, que trará a janela de configuração do MPR em cima.
Figura 7. MPR janela de instalação, guia Plate.- Clique na posição A1 e arraste o mouse para E1, em seguida, clique na
botão. Isso irá selecionar as posições a serem utilizados para os padrões. Essas posições será destaque na cor verde. - Agora, precisamos selecionar as posições a F1 H3 para as amostras. Clique e arraste o mouse a partir de F1 posição, a posição H3 e depois clique no
botão, isto irá destacar as posições na cor amarela. - Em seguida, repita a mesma operação para os cargos de A2 E3, para selecionar as posições para medições da amostra.
- Agora, vamos carregar o arquivo Comma Separated arquivo (csv) Variável preparado com antecedência com as Normas e informação de amostra.
Figura 8. MPR janela de instalação, guia de informação bem.- Em seguida, clique na
botão. Uma janela do Windows Explorer será aberto que, como mostrado na Figura 9, o que permitirá localizar o "Bem information.csv" arquivo e carregá-lo. 
Figura 9. Carregando informações de amostra bem.
Depois de carregar o "Bem informações" arquivo, a "informação Bem" vai olhar como mostrado na Figura 10
Figura 10. Carregado de informações de amostra bem.
- Clique na
botão, isto irá abrir a janela de Método de Análise, mostrado na Figura 2. 
botão, que trará a janela de configuração do MPR em cima. 
botão. Isso irá selecionar as posições a serem utilizados para os padrões. Essas posições será destaque na cor verde. 
botão, isto irá destacar as posições na cor amarela. 
botão. Uma janela do Windows Explorer será aberto que, como mostrado na Figura 9, o que permitirá localizar o "Bem information.csv" arquivo e carregá-lo. 
2. Picogreen Preparação de amostras de Ensaio
- Prepare 1X tampão TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA), adicionando 1 mL de 20 X tampão TEa 19 mL dI H 2 O.
- Prepare PicoGreen Solução Reagente pela adição de 50 mL 200 X Reagente PicoGreen para 9,95 1 X mL tampão TE.
- Elaborar normas (Lambda dsDNA) fazendo diluições em série de ações dsDNA (100 mcg / mL). Primeiro preparar uma solução de 50 mg / mL dsDNA adicionando 25 mL de estoque dsDNA (100 mcg / mL) e 25 mL 1 x tampão TE. Em seguida, preparar as soluções padrão, adicionando os volumes indicados de dsDNA e buffer como listadas na tabela abaixo:
Concentração de dsDNA Volume de dsDNA Volume de Tampão 1 mg / mL 20 mL de 50 mcg / mL dsDNA 980 mL 1 X tampão TE 0,1 g / mL 100 L de 1 mg / mL dsDNA 900 mL 1 X tampão TE 0,01 mcg / mL 100 L de 0,1 mcg / mL dsDNA 900 mL 1 X tampão TE 0,001 mg / mL 100 L de 0,01 mcg / mL dsDNA 900 mL 1 X tampão TE
3. Medição de Padrões e fluorescência da amostra
- Pipetar 150 mL de cada padrão em poços A1-E1 de uma placa de 96 poços, por Figura 7, e de acordo com a tabela a seguir:
Bem Padrão A1 1 mg / mL B1 0,1 g / mL C1 0,01 mcg / mL D1 0,001 mg / mL E1 1 X tampão TE - Pipetar 150 mL amostras desconhecidas em poços de F1 H3, mostrado na Figura 7
- Despeje PicoGreen solução preparada na etapa 1,2 em uma calha projetado para multi-canal de uso da pipeta. Use uma pipeta multi-canal para fornecer solução de 150 mL PicoGreen aos poços A1-H3. Solução de misturar e padrões cuidadosamente com pipeta.
- Colocar a placa na área escura e esperar 2-5 minutos para a reação para se desenvolver.
4. Resultados representante
A curva de calibração bom é avaliado utilizando os diferentes parâmetros fornecidos pelo software F-7000 em cima da medida das normas e cálculo da curva de calibração pelo software.
O coeficiente de determinação indica a qualidade do ajuste dos padrões de medida e calculada a curva de calibração. Quanto mais próximo este valor é "1", melhor o ajuste do valor medido e curva de calibração.
Se o valor está longe de "1", as normas devem ser reavaliados, preparado novamente, ou a adequação da curva de calibração mudou.
A Figura 11 mostra um exemplo de uma curva de calibração com um coeficiente de determinação calculado = 0,99993, obtidos para a quantificação de dsDNA usando PicoGreen corante.
Figura 11. Exemplo de dsDNA curva de calibração.
Discussion
Pipetagem cuidadosa durante a preparação da amostra, bem como a utilização de um espectrofotômetro de fluorescência estável e sensível é essencial para obter bons resultados e reprodutíveis.
No caso do espectrofotômetro de fluorescência utilizado para este teste, sugere-se com 300 mL de amostra de volume final no leitor de microplacas. Menor volume diminui a sensibilidade, e um volume maior pode causar contaminação cruzada entre os poços.
Disclosures
Luis A. Moreno e Kendra L. Cox são empregados por Hitachi High Technologies Latina que produz o instrumento utilizado neste artigo.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled H2O | Reagent | |||
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen | Reagent | P7589 | ||
| Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108 | Supply | 237108 | ||
| 12 Channel Eppendorf Micropipette | Supply | 3516677 | ||
| 1000 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 200 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 10 mL serological pipet | Supply | |||
| Aluminum foil | Supply | |||
| Pipette tips | Supply | |||
| Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1 | Equipment | 5J1-0003 | ||
| Microplate Reader Accessory for F-7000 | Equipment | 5J0-0139 |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).
