Summary
DsDNA ölçümü Moleküler Problar PicoGreen boya ve bir mikroplak okuyucu aksesuar ile donatılmış Hitachi F-7000 Floresans Spektrofotometre kullanılarak gösterilmesi.
Abstract
Niceleme özellikle küçük konsantrasyonlarda DNA, DNA sentezi ve saflaştırılması, DNA amplifikasyon ürünlerinin ölçümü gibi tanı uygulamaları ve ilaç DNA molekülleri algılama gibi standart moleküler biyoloji testleri de dahil olmak üzere biyolojik uygulamaların geniş bir yelpazede önemli bir görevdir preparatlar. Bu video sırasında dsDNA kantifikasyon Molecular Probes Quant-PicoGreen boya Reaktif kitini kullanarak gerçekleştirmek için Mikro Plaka Okuyucu aksesuar ile donatılmış F-7000 Hitachi Floresans Spektrofotometre yeteneğini gözler önüne serecektir.
F-7000 Floresans Spektrofotometre, yüksek hassasiyette ve yüksek hızda ölçümler sunmaktadır. Bu ölçüm floresan, lüminesans ve fosforesans kapasitesine sahip son derece esnek bir sistem. Dalga boyu tarama, zamanlı tarama, fotometri ve 3-D tarama ölçümü de dahil olmak üzere, çeşitli ölçüm modları mevcuttur. Spektrofotometre mikroplak 300 mcL numune hacmi flöresein 50 picomoles aralığında hassasiyet vardır ve 60.000 nm / dakika tarama hızları ölçme yeteneğine sahiptir. Ayrıca konsantrasyonlarının geniş bir yelpazede üzerinde kalibrasyon eğrilerinin kullanımı için izin büyüklüğü 5 emir kadar geniş bir dinamik aralık vardır. Optik sistemi, maksimum enerji ve duyarlılık için tüm yansıtıcı optik kullanır. Standart dalga boyu aralığı 200-750 nm, ve isteğe bağlı yakın kızılötesi photomultipliers birini kullanarak 900 nm kadar uzatılabilir. Sistemi, isteğe bağlı bir dış ısı kontrollü sıvı sirkülatör kullanarak 5 ile 60 derece santigrat plaka okuyucu için isteğe bağlı sıcaklık kontrolü sağlar. Mikroplaka okuyucu kullanmak için 96 mikroplaka sağlar ve kinetik modunu kullanarak 96 kuyu için ölçüm hızı 60 saniyeden az.
F-7000 ve Mikroplaka Okuyucu Yazılım kontrolleri de son derece esnektir. Örnekler sütun veya satır biçimlerinden birini ve örnek ölçümler için seçilen kuyu herhangi bir kombinasyonu olabilir. Bu optimal kullanımı için mikroplak izin verir. Ayrıca, yazılım Excel'de oluşturulmuş ve virgülle ayrılmış değerler kaydedilir mikro plaka örnek konfigürasyonları, ya da "csv" formatında ithal sağlar. Mikroplaka ölçüm yapılandırmaları kaydedilir ve kolaylık sağlamak için yazılım ve verimlilik artışı ile geri çağrılabilir. Veri sonuçları standart bir rapor çıktı, Excel ya da isteğe bağlı Report Generator Programı olabilir.
Protocol
1. Enstrüman Kurulum
- Spectrofluorometer açın ve 1 saat ısınmasını bekleyin.
- Excel, Şekil 1'de gösterildiği gibi, Standartlar ve örnek veri ile bir dosya oluşturmak ve virgülle ayrılmış kaydetmek "csv" formatında değerleri.
Şekil 1. Standartlar ve örnekler veri. - Flüorometre aşağıdaki gibi ayarlayın:
- Tıklayın
düğmesi, Şekil 2'de gösterildiği Analiz Yöntemi penceresi açılacaktır. 
Şekil 2. Analiz Metodu Pencere, Genel sekmesinde.
Aşağıdaki seçimleri yapın:- "Ölçüm" alanına, menüyü aşağı çekme Fotometri seçin.
- "Operatör" alanına, uygun operatörün adını girin.
- "Instrument" alanına bilgi girmek için gerek yoktur. Bu, yazılım tarafından otomatik olarak seçilir.
- Mikroplak okuyucu kullanarak, "Örnekleme" alanında etkin değildir.
- Raporu "Yorumlar" alanına dahil etmek istediğiniz herhangi bir yorum girin.
- "Aksesuar" alanına, bu test için kullanılan aksesuarlar ile ilgili bilgiler girin.
- Pencerenin sağ tarafındaki düğmeleri unutmayın.
- "Load" düğmesine önceden kaydedilmiş Analiz Yöntemleri yüklenmesini sağlar.
- "Kaydet" düğmesine aynı adı kullanarak, test parametreleri bir dizi ya da önceden kaydedilen ve yüklenen Analiz Metodu güncellemeye izin verir.
- "Farklı Kaydet" düğmesine test parametreleri veya Çözümleme Yöntemi, istenilen bir isim altında yeni bir dizi tasarruf sağlar.
Şekil 3. Analiz Metodu Pencere, kantitasyonu sekmesini.- "Kantitasyonu tipi" alanında, Dalgaboyu seçin. Bu floresan okuma seçilen dalga boyu kullanılarak yapılacaktır gösterir.
- "Kalibrasyon" alanına, 1. sırasını seçin.
- "Dalga boyu Numarası" alanında, 1 seçin.
- "Konsantrasyon birim" alanında, ng / ml girin.
- "Manuel Kalibrasyon" ve "sıfır yoluyla Kuvvetleri eğrisi" kutuları seçilmemiş bırakın.
- "Rakam ondalık noktadan sonra" alanında, 2 seçeneğini seçin.
- "Alt konsantrasyon sınırı" alanına, 0 girin.
- "Üst konsantrasyon limiti alanında, 10000 girin.
Şimdi "Instrument" sekmesine tıklayın ve aşağıdaki seçimleri yapın.
Şekil 4. Analiz Metodu pencere, Enstrüman sekmesi- "Veri modu:" alanına, Floresans seçin.
- "Doğrama hız" alanında bu zamanda, sadece fosforesans ölçümler için kullanılan etkin değildir.
- "Dalga boyu modu" alanında, hem WL sabit seçin.
- "EX / WL1" alanına 480nm girin.
- "EM / WL1" alanına 520Nm girin.
- EX altında diğer tüm alanlar ve EM, şu anda devre dışıdır.
- "EX yarık" alanına menüyü aşağı çekme 5.0nm seçin.
- "EM yarık" alanına menüyü aşağı çekme 5.0nm seçin.
- "PMT Voltaj 1-1000V" alanında önünde kutusu seçilmemiş bırakın.
- "PMT Voltage" alanında, menüyü aşağı çekme 700V seçin.
- "Otomatik istatistik calc. Numarası" alanında 2'yi seçin.
- 1 "çoğaltır" alanını seçin.
- "Entegrasyon" alanına 0.1s seçin./ P>
- "Gecikme" alanına girmek veya 0s seçin.
Şekil 5. Analiz Metodu pencere, Monitör sekmesini.- "Y ekseni", "Max:" alanına, 10000 seçin
- "Y ekseni", "Min:" alanına, 0 seçin.
- "Açık veri işleme veri toplama sonra" sol kutusunu işaretleyin.
- Okumalar tamamlandıktan sonra otomatik olarak basılacak bir rapor istediğiniz sürece, "veri toplama sonra Baskı raporu" sol kutusu seçilmemiş bırakın.
Şekil 6. Analiz Metodu penceresi, Rapor Tab.- "Çıkış" alanına, menü aşağı çekme Rapor Yazdır seçeneğini seçin. Ayrıca ısmarlama raporlar üretmek izin Report Generator programı isteğe bağlı eklemek kullanarak eğer Excel'e veri veya "Kullanım Baskı Jeneratör Formu" istiyorsanız, "Microsoft Excel kullan" seçeneğini seçin.
- Rapora dahil olmasını istediğiniz öğeleri için kutuları tıklayın.
- "Analiz Yöntemi" penceresinde farklı sekmelerde seçilen tüm parametreleri kaydetmek için, "tekrar" Genel "sekmesini tıklayın ve bir dosya adı altında ve ileride kullanmak için onları bulmak bir yere kaydedin ve tıklayın. OK "Bu pencereyi kapatmak için düğmesine basın.
- Bu cihaz test parametreleri kurma tamamlar.
- Şimdi mikroplak okuyucu kurar.
- Tıklayın
düğmesi, üstüne MPR Kur Penceresi getirecektir.
Şekil 7. MPR Kurulumu penceresinde, Levha sekmesini.- A1 pozisyonuna E1 tıklayın ve fareyi sürükleyin, sonra üzerine tıklayın
düğmesine basın. Bu standartlar için kullanılacak pozisyonlar seçecektir. Bu pozisyonları yeşil renkte vurgulanır. - Şimdi örnekleri için H3 pozisyonları F1 seçmeniz gerekir. Sonra tıklayın tıklayın ve fareyi sürükleyin pozisyon F1 başlayarak, H3 konumuna ve
düğmesi, bu sarı renkli bu pozisyonları vurgulayacaktır. - Sonra örnek ölçümler için bu pozisyonları seçmek için, E3 A2 pozisyonlar için aynı işlemi tekrarlayın.
- Şimdi, Standartlar ve örnek bilgileri önceden hazırlanmış dosya Virgülle Ayrılmış Değişken (csv) dosyası yüklemek.
Şekil 8. MPR Kurulumu penceresinde, Kuyu Bilgi sekmesi.- Sonra üzerine tıklayın
düğmesine basın. "Peki information.csv" dosya bulma ve yükleme sağlayacaktır Şekil 9 gösterilen bir Windows Explorer penceresinde açılacaktır. 
Şekil 9. Iyi örnek bilgileri yükleniyor.
"Eh bilgi" dosyasını yükledikten sonra, "İyi bilgi" Şekil 10'da gösterildiği gibi görünecektir
Şekil 10. Örnek kuyusu bilgi yüklendi.
- Tıklayın
düğmesi, Şekil 2'de gösterildiği Analiz Yöntemi penceresi açılacaktır. 
düğmesi, üstüne MPR Kur Penceresi getirecektir. 
düğmesine basın. Bu standartlar için kullanılacak pozisyonlar seçecektir. Bu pozisyonları yeşil renkte vurgulanır. 
düğmesi, bu sarı renkli bu pozisyonları vurgulayacaktır. 
düğmesine basın. "Peki information.csv" dosya bulma ve yükleme sağlayacaktır Şekil 9 gösterilen bir Windows Explorer penceresinde açılacaktır. 
2. Picogreen Testi Numune Hazırlama
- 20 X TE Tampon 1 ml ekleyerek 1X TE Tamponu (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) hazırlayın19 ml di H 2 O.
- 9.95 ml 1 X TE Tamponu 50 mcL 200 X PicoGreen Reaktif ekleyerek PicoGreen Reaktif Çözüm hazırlayın.
- Stok dsDNA (100 mg / ml) seri dilüsyonları yaparak standartları (Lambda dsDNA) hazırlayın. İlk olarak 50 mikrogram / ml dsDNA stok dsDNA (100 mg / ml) ve 25 mcL 1 x TE Tamponu 25 mcL ekleyerek bir çözüm hazırlayın. Sonra, aşağıdaki tabloda listelenen belirtilen dsDNA hacimleri ve tampon ekleyerek standart çözümler hazırlamak:
DsDNA Yoğunlaşma Ses dsDNA Buffer Hacmi 1 mcg / mL 50 mcg / ml dsDNA 20 mcL 980 mcL 1 X TE Tampon 0.1 mg / ml 1 mcg / ml dsDNA 100 mcL 900 mcL 1 X TE Tampon 0.01 mcg / mL 0.1 mg / ml dsDNA 100 mcL 900 mcL 1 X TE Tampon 0.001 mg / ml 0.01 mcg / ml dsDNA 100 mcL 900 mcL 1 X TE Tampon
3. Standartlar ve örnek Floresans ölçümü
- Pipet Şekil 7 başına 150 96 plaka kuyuları A1-E1 içine her bir standart mcL, aşağıdaki tabloya göre:
Iyi Standart A1 1 mcg / mL B1 0.1 mg / ml C1 0.01 mcg / mL D1 0.001 mg / ml E1 1 X TE Tampon - Şekil 7 de gösterilmiştir H3, kuyular F1 pipetlenir 150 mcL bilinmeyen örnekleri
- Çok kanallı pipet kullanmak için tasarlanmış bir çukur içine adım 1.2 'de hazırlanan PicoGreen çözüm dökün. Kuyuları A1-H3 150 mcL PicoGreen çözümü sunmak için çok kanallı pipet kullanın. Hafifçe karıştırın çözüm pipet ile ve standartlara.
- Plaka ve karanlık bir alanda geliştirmek için reaksiyon için 2-5 dakika bekleyin.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Iyi bir kalibrasyon eğrisi yazılım tarafından kalibrasyon eğrisi ve hesaplama standartları ölçümü üzerine F-7000 yazılımı tarafından sağlanan farklı parametreler kullanılarak değerlendirilir.
Belirleme katsayısı, ölçülen standartlara uyum iyiliği ve hesaplanan kalibrasyon eğrisi gösterir. Yakın bu değer "1", ölçülen değer ve kalibrasyon eğrisi daha iyi uyum.
Değerini "1" uzak ise, standartlar, yeniden ölçülür tekrar hazırlanır veya kalibrasyon eğrisi fitness değişti olmalıdır.
Şekil 11 PicoGreen boya kullanarak dsDNA ölçümü için elde edilen hesaplanmış bir belirleme katsayısı = 0,99993, bir kalibrasyon eğrisi bir örnek gösterir.
Şekil 11. DsDNA kalibrasyon eğrisi örneği.
Discussion
Dikkatli numune hazırlama sırasında pipetleme yanı sıra, kararlı ve hassas bir floresan spektrofotometre kullanılarak iyi ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için esastır.
Bu test için kullanılan floresan spektrofotometre durumda, mikroplaka okuyucu 300 mcL son numune hacmi kullanarak önerilmektedir. Düşük ses duyarlılığı azalır ve daha büyük bir hacim kuyuları arasında çapraz kontaminasyona neden olabilir.
Disclosures
Luis A. Moreno ve Kendra L. Cox bu yazıda kullanılan alet üreten Hitachi High Technologies Amerika tarafından istihdam edilmektedir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled H2O | Reagent | |||
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen | Reagent | P7589 | ||
| Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108 | Supply | 237108 | ||
| 12 Channel Eppendorf Micropipette | Supply | 3516677 | ||
| 1000 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 200 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 10 mL serological pipet | Supply | |||
| Aluminum foil | Supply | |||
| Pipette tips | Supply | |||
| Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1 | Equipment | 5J1-0003 | ||
| Microplate Reader Accessory for F-7000 | Equipment | 5J0-0139 |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).
