Summary
مظاهرة الكمي للdsDNA باستخدام المسابر الجزيئية PicoGreen صبغ وهيتاشي الطيف الإسفار F - 7000 مجهزة التبعي microplate القارئ.
Abstract
الكمي من الحمض النووي ، وخصوصا في تجمعات صغيرة ومهمة هامة مع مجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك المعايير البيولوجية المقايسات البيولوجيا الجزيئية مثل تجميع وتنقية من الحمض النووي ، والتطبيقات التشخيصية مثل الكمي للمنتجات تضخيم الحمض النووي ، والكشف عن جزيئات الحمض النووي في قضايا المخدرات التحضيرات. خلال هذا الفيديو سوف نظهر قدرة الطيف هيتاشي F - 7000 الإسفار مجهزة التبعي بلايت القارئ الصغير لأداء dsDNA الكمي باستخدام المسابر الجزيئية كوانت ، أنه كاشف صبغ PicoGreen عدة.
في الطيف F - 7000 الإسفار عروض حساسية عالية وقياسات سرعة عالية. وهو نظام مرن للغاية قادرة على قياس مضان ، التألق ، وتفسفر. طرق قياس عدة متاحة ، بما في ذلك فحص الطول الموجي والمسح الضوئي الوقت ، وقياس الضوء وقياس 3 - D الفحص. معمل لديه حساسية في مجموعة من 50 من picomoles فلوريسئين عند استخدام حجم العينة 300 ميكرولتر في microplate ، وقادر على قياس سرعة فحص 60000 نانومتر / دقيقة. كما أن لديها مجموعة واسعة ديناميكية تصل إلى 5 أوامر من حجمها والذي يسمح لاستخدام منحنيات المعايرة على طائفة واسعة من التركيزات. نظام بصري يستخدم كل البصريات الانعكاسية للطاقة القصوى والحساسية. النطاق الموجي هو معيار 200-750 نانومتر ، ويمكن أن تمتد إلى 900 نانومتر عند استخدام واحدة من photomultipliers اختياري الأشعة تحت الحمراء القريب. ويسمح نظام التحكم في درجة الحرارة اختياري للقارئ لوحة 5-60 درجة مئوية درجة الحرارة باستخدام اختياري للرقابة الخارجية دائري السائل. القارئ microplate يسمح للاستخدام من 96 microplates جيدا ، وقياس سرعة لمدة 96 بئرا أقل من 60 ثانية عند استخدام النمط حركية.
ضوابط البرمجيات لF - 7000 ، وقارئ Microplate أيضا درجة عالية من المرونة. قد يتم تعيين العينات في عمود أو صف الأشكال سواء ، ويمكن اختيار أي مجموعة من الآبار للحصول على قياسات العينات. وهذا يسمح للاستخدام الأمثل للmicroplate. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح برنامج استيراد التكوينات الدقيقة لوحة عينة التي تم إنشاؤها في Excel وحفظها في قيم مفصولة بفواصل ، أو "CSV" تنسيق. يمكن حفظ تكوينات Microplate قياس وأشار من قبل البرنامج للحصول على الراحة وزيادة الإنتاجية. يمكن أن يكون الناتج نتائج البيانات لتقرير القياسية ، إلى Excel ، أو إلى تقرير برنامج مولد اختيارية.
Protocol
1. إعداد صك
- بدوره على مقياس التألق الطيفي والسماح لالاحماء لمدة 1 ساعة.
- باستخدام Excel إنشاء ملف مع المعايير ونموذج البيانات ، كما هو مبين في الشكل (1) وحفظه في قيم مفصولة بفواصل "CSV" تنسيق.
الشكل 1. المعايير وبيانات العينات. - إعداد مقياس التألق على النحو التالي :
- انقر على
زر ، وهذا فتح نافذة أسلوب التحليل ، كما هو موضح في الشكل رقم 2. 
الشكل 2. نافذة تحليل الأسلوب ، التبويب عام.
بإجراء التحديدات التالية :- في الميدان "القياس" ، حدد قياس الشدة الضوئية من سحب أسفل القائمة.
- في الحقل "المشغل" ، أدخل اسم المشغل المناسبة.
- ليست هناك حاجة لإدخال المعلومات في هذا المجال "الصك". يتم تحديد هذا تلقائيا بواسطة البرنامج.
- في "المعاينة" حقل غير نشط عند استخدام قارئ microplate.
- إدخال أية تعليقات التي قد تريد تضمينها في التقرير في هذا المجال "تعليقات".
- في الميدان "ملحقة" ، أدخل المعلومات المتعلقة الملحقات المستخدمة في هذا الاختبار.
- لاحظ الأزرار على الجانب الأيمن من النافذة.
- "تحميل" الزر يتيح تحميل أساليب التحليل التي تم حفظها سابقا.
- "حفظ" زر يسمح بتحديث مجموعة من المعلمات اختبار أو الطريقة التي تم حفظها سابقا التحليل وتحميلها ، وذلك باستخدام نفس الاسم.
- "حفظ باسم" الزر يتيح توفير مجموعة جديدة من المعلمات اختبار أو أسلوب التحليل تحت الاسم المطلوب.
الشكل 3. نافذة تحليل الأسلوب ، التبويب الكميات.- في الميدان "الكميات نوع" ، حدد الطول الموجي. يشير هذا وسوف تتاح القراءة مضان باستخدام الطول الموجي المحدد.
- في الميدان "معايرة نوع" ، حدد 1 ترتيب الحادي والعشرين.
- في الحقل "عدد من موجات" ، حدد 1.
- في الميدان "تركيز وحدة" ، أدخل نانوغرام / مل.
- إجازة غير محددة خانات "لمعايرة يدوي" و "القوة من خلال منحنى الصفر".
- في "الأرقام العشرية بعد نقطة" الحقل ، حدد 2.
- في الميدان "السفلى تركيز الحد" ، أدخل 0.
- في "أعالي تركيز مجال الحد ، أدخل 10000.
الآن انقر على علامة التبويب "الصك" وجعل التحديدات التالية.
الشكل 4. تحليل أسلوب النافذة ، التبويب الصك- في "وضع البيانات :" حقل ، حدد الإسفار.
- "سرعة التقطيع" حقل غير نشط في هذا الوقت ، يتم استخدامه فقط لقياس تفسفر.
- في الميدان "الموجي النمط" ، حدد كلا WL الثابتة.
- في الميدان "EX / WL1" دخول 480nm.
- في "EM / WL1" حقل إدخال 520nm.
- كافة الحقول الأخرى بموجب EX وEM غير نشطة في هذا الوقت.
- في "شق EX" حقل حدد 5.0nm سحب من أسفل القائمة.
- في "شق EM" حقل حدد 5.0nm سحب من أسفل القائمة.
- إجازة غير محددة المربع أمام "الجهد PMT 1 - 1000V" الميدان.
- في "PMT الجهد" الحقل ، حدد 700V سحب من أسفل القائمة.
- في "كالك سيارات الإحصائية. رقم" حقل حدد 2.
- في مجال "يعيد" حدد 1.
- في الميدان "تكامل الوقت" حدد 0.1s </ لى>
- في الحقل "تأخير" أو تحديد دخول 0s.
الشكل 5. تحليل أسلوب النافذة ، التبويب مراقب.- في "محور Y" ، "الحد الأقصى :" حقل ، حدد 10000
- في "محور Y" ، "الحد الأدنى :" حقل ، حدد 0.
- حدد المربع الموجود على يسار "فتح تجهيز البيانات بعد الحصول على البيانات".
- إجازة غير محددة المربع الموجود على يسار "طباعة التقرير بعد الحصول على البيانات" ، إلا إذا كنت تريد التقرير المراد طباعتها تلقائيا بعد الانتهاء من القراءات.
الشكل 6. تحليل أسلوب النافذة ، تبويب التقرير.- في الميدان "إخراج" ، حدد تقرير طباعة من القائمة المنسدلة. هل يمكن أيضا تحديد "استخدام تعليمات Microsoft Excel" إذا كنت تريد أن البيانات التي تم تصديرها إلى Excel ، أو "مولد طباعة ورقة استخدام" في حالة استخدام الوظيفة اختياري على مولد تقرير البرنامج الذي سيسمح توليد مخصص التقارير المقدمة.
- انقر فوق خانات للعناصر التي تريد إدراجها في التقرير.
- لحفظ جميع المعلمات في تحديد علامات تبويب مختلفة من النافذة "تحليل أسلوب" ، انقر مرة أخرى على علامة التبويب "عام" وحفظها تحت اسم ملف ومكان حيث يمكن العثور عليها لاستخدامها في المستقبل ، وانقر على " موافق "الزر لإغلاق هذه النافذة.
- هذا اكتمال إعداد المعلمات اختبار الصك.
- الآن سنقوم بإعداد microplate القارئ.
- انقر على
زر ، والذي سيجلب إطار الإعداد MPR على القمة.
الشكل 7. MPR إطار الإعداد ، التبويب اللوحة.- انقر على موقف A1 واسحب الماوس لE1 ، ثم انقر على
الزر. وهذا اختيار المواقف التي ستستخدم لهذه المعايير. وسيتم تسليط الضوء تلك المواقف في اللون الأخضر. - الآن نحن بحاجة لتحديد المواقف F1 لH3 للعينات. انقر واسحب الماوس بدءا F1 في الموقف ، لوضع H3 ثم انقر على
زر ، وتسليط الضوء على هذا تلك المواقف في اللون الأصفر. - ثم كرر العملية نفسها للمناصب لE3 A2 ، لتحديد تلك المواقف لقياسات العينات.
- الآن ، دعونا تحميل ملف الفاصلة المفصولة متغير (CSV) ملف معدة مسبقا مع المعايير والمعلومات نموذج.
الشكل 8. MPR إطار الإعداد ، حسنا التبويب معلومات.- ثم انقر على
الزر. وهناك نافذة مفتوحة ويندوز اكسبلورر الذي كما هو مبين في الشكل 9 ، الأمر الذي سيتيح تحديد مكان وجود "حسنا information.csv" ملف وتحميله. 
الرقم 9. كذلك تحميل معلومات العينة.
بعد تحميل "حسنا معلومات" الملف ، فإن "المعلومات حسنا" تبدو كما هو مبين في الشكل 10
الرقم 10. تحميل معلومات العينة جيدا.
- انقر على
زر ، وهذا فتح نافذة أسلوب التحليل ، كما هو موضح في الشكل رقم 2. 
زر ، والذي سيجلب إطار الإعداد MPR على القمة. 
الزر. وهذا اختيار المواقف التي ستستخدم لهذه المعايير. وسيتم تسليط الضوء تلك المواقف في اللون الأخضر. 
زر ، وتسليط الضوء على هذا تلك المواقف في اللون الأصفر. 
الزر. وهناك نافذة مفتوحة ويندوز اكسبلورر الذي كما هو مبين في الشكل 9 ، الأمر الذي سيتيح تحديد مكان وجود "حسنا information.csv" ملف وتحميله. 
2. Picogreen تحضير عينة الفحص
- إعداد 1X TE العازلة (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، 1 ملم EDTA) وذلك بإضافة 1 مل من 20 العازلة TE Xإلى 19 مل دي H 2 O.
- تحضير محلول الكاشف PicoGreen بإضافة 50 ميكرولتر 200 الكاشف PicoGreen X ل9.95 مل 1 العازلة TE X.
- إعداد معايير (لامدا dsDNA) بجعل التخفيفات المتسلسلة لdsDNA الأسهم (100 ميكروغرام / مل). إعداد أول حل من 50 ميكروغرام / مل dsDNA بإضافة 25 ميكرولتر من dsDNA الأسهم (100 ميكروغرام / مل) و 25 ميكرولتر 1 العازلة TE س. ثم تعد الحلول القياسية من خلال إضافة وحدات التخزين من dsDNA وأشار العازلة كما هو موضح في الجدول أدناه :
تركيز dsDNA حجم dsDNA حجم الاحتياطي 1 ميكروغرام / مل 20 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل dsDNA 980 ميكرولتر 1 X TE العازلة 0،1 ميكروغرام / مل 100 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / مل dsDNA 900 ميكرولتر 1 X TE العازلة 0.01 ميكروغرام / مل 100 ميكرولتر من 0،1 ميكروغرام / مل dsDNA 900 ميكرولتر 1 X TE العازلة 0،001 ميكروغرام / مل 100 ميكرولتر من 0.01 ميكروغرام / مل dsDNA 900 ميكرولتر 1 X TE العازلة
3. قياس المعايير والإسفار نموذج
- ماصة 150 ميكرولتر من كل معيار في آبار A1 - E1 من 96 لوحة جيدا ، في الشكل 7 ، وفقا للجدول التالي :
جيد معيار A1 1 ميكروغرام / مل B1 0،1 ميكروغرام / مل C1 0.01 ميكروغرام / مل D1 0،001 ميكروغرام / مل E1 1 X TE العازلة - ماصة 150 عينات غير معروفة في ميكرولتر F1 الآبار لH3 ، كما هو موضح في الشكل 7
- من أجل حل PicoGreen أعدت في الخطوة 1.2 في حوض مصمم للاستخدام ماصة متعدد القنوات. استخدام ماصة متعدد القنوات لتقديم حل PicoGreen 150 ميكرولتر من الآبار A1 - H3. حل المزيج بلطف مع المعايير وماصة.
- لوحة في مكان مظلم ومنطقة الانتظار 2-5 دقائق للرد على تطوير.
4. ممثل النتائج
يتم تقييم منحنى المعايرة جيدة باستخدام معلمات مختلفة يقدمها البرنامج F - 7000 على قياس المعايير وحساب منحنى المعايرة بواسطة البرنامج.
معامل تقرير يشير الى الخير من يصلح لمعايير قياس والمعايرة منحنى المحسوبة. وهذه القيمة هي أقرب إلى "1" ، وأفضل تناسب قيمة قياس والمعايرة منحنى.
إذا كانت القيمة هي أبعد ما تكون عن "1" ، لا بد من اعادة قياس المعايير ، التي أعدت مرة أخرى ، أو تغيير اللياقة البدنية للمنحنى المعايرة.
ويبين الشكل 11 مثال على منحنى المعايرة مع احتساب معامل عزم = 0.99993 ، وحصل على تقدير من dsDNA باستخدام PicoGreen صباغة.
الرقم 11. مثال على منحنى المعايرة dsDNA.
Discussion
pipetting الحذر أثناء إعداد العينات ، وكذلك باستخدام معمل مستقرة وحساسة مضان ضروري للحصول على نتائج جيدة وقابلة للتكرار.
في قضية معمل مضان يستخدم لهذا الاختبار ، يقترح استخدام 300 ميكرولتر حجم العينة النهائية في القارئ microplate. انخفاض حجم يقلل من الحساسية ، وزيادة حجمها قد يسبب التلوث المتبادل بين الآبار.
Disclosures
ويعمل لويس مورينو ألف ولام كوكس كندرا تكنولوجيز التي كتبها هيتاشي أمريكا السامية التي تنتج الأداة المستخدمة في هذه المقالة.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled H2O | Reagent | |||
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen | Reagent | P7589 | ||
| Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108 | Supply | 237108 | ||
| 12 Channel Eppendorf Micropipette | Supply | 3516677 | ||
| 1000 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 200 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 10 mL serological pipet | Supply | |||
| Aluminum foil | Supply | |||
| Pipette tips | Supply | |||
| Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1 | Equipment | 5J1-0003 | ||
| Microplate Reader Accessory for F-7000 | Equipment | 5J0-0139 |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).
