Summary
Demonstration der Quantifizierung von dsDNA mit Molecular Probes PicoGreen Farbstoff und Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer mit einem Mikroplatten-Reader Zubehör ausgestattet.
Abstract
Quantifizierung von DNA, vor allem in kleinen Konzentrationen, ist eine wichtige Aufgabe mit einer Vielzahl von biologischen Anwendungen, einschließlich Standard-Molekularbiologie-Assays wie Synthese und Aufreinigung von DNA-, Diagnose-Anwendungen wie die Quantifizierung der DNA-Amplifikation Produkte und Detektion von DNA-Molekülen in der Medikamentenentwicklung Vorbereitungen. Während dieses Video zeigen wir Ihnen die Leistungsfähigkeit der Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer mit einer Micro-Plate Reader Zubehör zum dsDNA Quantifizierung mittels Molecular Probes Quant-it PicoGreen Farbstoff Reagenzienkit durchführen ausgestattet.
Der F-7000 Fluoreszenzspektrophotometer bietet hohe Empfindlichkeit und hohe Geschwindigkeit Messungen. Es ist ein sehr flexibles System für die Messung von Fluoreszenz, Lumineszenz und Phosphoreszenz. Mehrere Betriebsarten zur Verfügung, einschließlich Wellenlänge zu scannen, zu scannen, Photometrie und 3-D-Scan-Messung. Das Spektralphotometer ist die Empfindlichkeit im Bereich von 50 pmol Fluorescein bei der Verwendung eines 300 &mgr; Probenvolumen in der Mikrotiterplatte und ist in der Lage Scan-Geschwindigkeiten von 60.000 nm / min. Es hat auch einen breiten dynamischen Bereich von bis zu 5 Größenordnungen, die für die Verwendung von Kalibrierkurven über einen weiten Bereich von Konzentrationen erlaubt. Das optische System nutzt alle reflektive Optiken für maximale Energie und Sensibilität. Die Standard-Wellenlängenbereich von 200 bis 750 nm, und kann bis 900 nm erweitert werden, wenn mit einem der optionalen Nah-Infrarot-Photomultiplier. Das System ermöglicht optional Temperaturregelung für die Platten-Lesegerät 5 bis 60 Grad Celsius mit einem optionalen externen temperierten Flüssigkeit Thermostaten. Die Mikroplatten-Reader ermöglicht den Einsatz von 96-Well Mikrotiterplatten, und die Messung der Geschwindigkeit für 96 Vertiefungen von weniger als 60 Sekunden bei Verwendung der Kinetik-Modus.
Software steuert für die F-7000 und Mikroplatten-Reader sind auch sehr flexibel. Die Proben können entweder in Spalte oder Zeile Formate eingestellt werden und eine beliebige Kombination von Brunnen kann für die Probe-Messungen gewählt werden. Dies ermöglicht eine optimale Ausnutzung der Mikroplatten. Darüber hinaus ermöglicht die Software den Import Mikrotiterplatten Beispielkonfigurationen in Excel erstellt und gespeichert in Comma Separated Values oder "csv"-Format. Microplate Mess-Konfigurationen können gespeichert und wieder aufgerufen werden, indem die Software für Komfort und erhöhte Produktivität. Daten Ergebnisse kann auf einem Standard-Bericht, Excel, oder einem optionalen Report Generator Program.
Protocol
1. Instrument Setup
- Schalten Sie den Spektrofluorometer und warmlaufen lassen für 1 Stunde.
- Mit Excel erstellen Sie eine Datei mit den Standards und Sample-Daten, wie in Abbildung 1 gezeigt und speichern Sie sie in Comma Separated Values "csv"-Format.
Abbildung 1. Standards und Proben Daten. - Set up Fluorometer wie folgt:
- Klicken Sie auf die
Taste, wird diese öffnen Sie die Analysemethode Fenster in Abb. 2 dargestellt. 
Abbildung 2. Analysemethode Fenster, Registerkarte Allgemein.
Machen Sie die folgende Auswahl:- In der "Measurement"-Feld, wählen Sie Photometrie aus dem Pulldown-Menü.
- In "Operator"-Feld, geben Sie die entsprechenden Betreiber zu nennen.
- Es besteht keine Notwendigkeit, Informationen in der "Instrument" Feld eingeben. Dies erfolgt automatisch durch die Software selektiert.
- Das "Sampling"-Feld ist inaktiv, wenn mit der Mikroplatten-Reader.
- Geben Sie Kommentare, die Sie in dem Bericht in der "Kommentar"-Feld enthalten sein soll.
- In der "Accessory"-Feld, geben Sie Informationen im Zusammenhang mit dem Zubehör für diesen Test verwendet.
- Beachten Sie die Schaltflächen auf der rechten Seite des Fensters.
- Der "Load"-Taste erlaubt das Laden zuvor gespeicherte Analyse-Methoden.
- Die Schaltfläche "Speichern" ermöglicht die Aktualisierung eine Reihe von Test-Parameter oder Analysemethode zuvor gespeichert und geladen, mit dem gleichen Namen.
- Die Taste ermöglicht das Speichern einer neuen Reihe von Test-Parameter oder Analysemethode unter einem gewünschten Namen "Save As".
Abbildung 3. Analysemethode Window, Quantifizierung Registerkarte.- In der "Quantifizierung Typ"-Feld, wählen Wellenlänge. Dies zeigt die Fluoreszenz Lesen gemacht wird mit der gewählten Wellenlänge sein.
- In der "Calibration Type"-Feld, wählen Sie 1. Ordnung.
- In der "Anzahl der Wellenlängen"-Feld, wählen Sie 1.
- In der "Konzentration Einheit" Feld ng / mL.
- Lassen Sie unselected die Felder für "Manuelle Kalibrierung" und "Force Kurve durch Null".
- In der "Nachkommastelle"-Feld, wählen Sie 2.
- In der "Lower Grenzkonzentration"-Feld, 0 eingeben.
- In der "Upper Konzentrationsgrenze Feld 10000.
Jetzt auf dem "Instrument" Registerkarte klicken und die folgende Auswahl.
Abbildung 4. Analysemethode Fenster Instrument tab- In der "Data-Modus:" Wählen Sie im Feld Fluoreszenz.
- Die "Chopping speed"-Feld ist inaktiv zu diesem Zeitpunkt, es nur für Phosphoreszenz Messungen verwendet.
- In der "Wavelength-Modus"-Feld, wählen Sie Beide WL fixiert.
- In der "EX / WL1" Feld 480nm.
- In der "EM / WL1" Feld 520nm.
- Alle anderen Felder unter EX und EM sind in dieser Zeit inaktiv.
- In der "EX Schlitz"-Feld wählen 5.0nm aus dem Pulldown-Menü.
- In der "EM Schlitz"-Feld wählen 5.0nm aus dem Pulldown-Menü.
- Lassen Sie unselected das Feld vor der "PMT Voltage 1-1000V"-Feld.
- In der "PMT Voltage"-Feld, wählen Sie 700V aus dem Pulldown-Menü.
- In der "Auto-Statistik calc. Number"-Feld wählen Sie 2.
- In der "Repliziert" Feld auswählen 1.
- In der "Integration time" Feld auszuwählen 0.1s. </ Li>
- In der "Delay"-Feld eingeben oder 0s.
Abbildung 5. Analysemethode Fenster die Registerkarte Monitor.- In der "Y-Achse", "Max:"-Feld, wählen Sie 10000
- In der "Y-Achse", "Min:"-Feld, wählen 0.
- Wählen Sie das Feld links neben der "Open Datenverarbeitung nach Datenerfassung".
- Lassen Sie unselected der Box auf der linken Seite des "Bericht drucken nach Datenerfassung", wenn Sie einen Bericht automatisch gedruckt werden, nachdem die Lesungen abgeschlossen werden soll.
Abbildung 6. Analysemethode Fenster, Report Tab.- In den "Output"-Feld, wählen Sie Bericht drucken aus dem Pulldown-Menü. Sie können auch wählen Sie "Verwenden Sie Microsoft Excel", wenn Sie die Daten nach Excel exportiert oder "Use Print Generator Sheet" bei Verwendung des optionalen add on Programm Report Generator, die es generiert maßgeschneiderte Berichte werden wollen.
- Klicken Sie die Kontrollkästchen für die Elemente, die Sie in den Bericht aufgenommen werden.
- So speichern Sie alle ausgewählten Parameter in den verschiedenen Tabs des "Analysis Method"-Fenster, klicken Sie erneut auf die Registerkarte "Allgemein" und speichern Sie sie unter einem Dateinamen und in einem Ort, wo Sie sie für zukünftige Verwendung finden konnte, und klicken Sie auf " OK "-Taste, um das Fenster zu schließen.
- Damit ist die Inbetriebnahme des Instrumentes Prüfparameter.
- Jetzt richten wir Ihnen die Mikroplatten-Reader.
- Klicken Sie auf die
Button, der die MPR-Setup-Fenster auf der Oberseite bringt.
Abbildung 7. MPR-Setup-Fenster, Plate Registerkarte.- Klicken Sie auf die A1 Position und ziehen Sie die Maus auf E1, dann klicken Sie auf den
-Taste. Diese wählt die Positionen für die Standards verwendet werden. Diese Positionen werden in grüner Farbe hervorgehoben werden. - Jetzt müssen wir Positionen F1 bis H3 wählen für die Proben. Klicken und Ziehen mit der Maus ab Position F1, um H3 Position und klicken Sie dann auf die
drücken, wird dieses Highlight dieser Positionen in gelber Farbe. - Dann wiederholen Sie den gleichen Vorgang für die Positionen A2 bis E3, um die Positionen für die Probe-Messungen zu wählen.
- Jetzt wollen wir laden Sie die Datei Comma Separated Variable (csv-Datei) im Voraus mit den Standards und Probe bereitgestellten Informationen.
Abbildung 8. MPR-Setup-Fenster, Well Registerkarte Informationen.- Dann klicken Sie auf den
-Taste. Ein Windows-Explorer-Fenster öffnet sich, die wie in Abbildung 9, die es erlauben Auffinden der "Well information.csv"-Datei und laden es wird gezeigt. 
Abbildung 9. Lädt auch Probeninformationen.
Nach dem Laden der "Well information"-Datei, wird der "Well Informationen" so aussehen in Abbildung 10
Abbildung 10. Loaded Probe auch Informationen.
- Klicken Sie auf die
Taste, wird diese öffnen Sie die Analysemethode Fenster in Abb. 2 dargestellt. 
Button, der die MPR-Setup-Fenster auf der Oberseite bringt. 
-Taste. Diese wählt die Positionen für die Standards verwendet werden. Diese Positionen werden in grüner Farbe hervorgehoben werden. 
drücken, wird dieses Highlight dieser Positionen in gelber Farbe. 
-Taste. Ein Windows-Explorer-Fenster öffnet sich, die wie in Abbildung 9, die es erlauben Auffinden der "Well information.csv"-Datei und laden es wird gezeigt. 
2. PicoGreen Assay Probenvorbereitung
- Bereiten 1X TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) durch Zugabe von 1 ml 20 X TE-Pufferbis 19 mL DI H 2 O.
- Bereiten PicoGreen Reagenzlösung durch Zugabe von 50 ul 200 X PicoGreen Reagenz auf 9,95 ml 1 x TE-Puffer.
- Bereiten Standards (Lambda dsDNA), indem serielle Verdünnungen von Lager dsDNA (100 ug / mL). Bereiten Sie zuerst eine Lösung von 50 ug / ml dsDNA durch Zugabe von 25 ul Lager dsDNA (100 ug / ml) und 25 ul 1 x TE-Puffer. Anschließend werden die Standard-Lösungen, indem Sie die angegebenen Mengen an dsDNA und Puffer wie in der Tabelle unten aufgelistet:
Die Konzentration der dsDNA Volumen der dsDNA Volumen Puffer 1 pg / mL 20 ul von 50 ug / mL dsDNA 980 ul 1 X TE-Puffer 0,1 ug / mL 100 ul von 1 pg / mL dsDNA 900 ul 1 X TE-Puffer 0,01 g / mL 100 ul von 0,1 ug / ml dsDNA 900 ul 1 X TE-Puffer 0,001 g / mL 100 ul von 0,01 ug / ml dsDNA 900 ul 1 X TE-Puffer
3. Measurement of Standards and Probenfluoreszenz
- Je 150 ul von jedem Standard in die Vertiefungen A1-E1 einer 96-Well-Platte, pro Bild 7, und nach der folgenden Tabelle:
Gut Standard A1 1 pg / mL B1 0,1 ug / mL C1 0,01 g / mL D1 0,001 g / mL E1 1 X TE-Puffer - Je 150 ul unbekannten Proben in die Vertiefungen F1 bis H3, in Abbildung 7
- Gießen PicoGreen Lösung in Schritt 1.2 in einen Trog für Mehrkanal-Pipette Einsatz konzipiert vorbereitet. Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette auf 150 ul PicoGreen Lösung in die Vertiefungen A1-H3 zu liefern. Die Lösung und Standards vorsichtig mit Pipette.
- Legen Sie Platte in dunklen Bereich und warten 2-5 Minuten für die Reaktion zu entwickeln.
4. Repräsentative Ergebnisse
Eine gute Kalibrierkurve wird unter Verwendung der verschiedenen Parameter, die von der F-7000-Software bei der Messung der Standards und die Berechnung der Kalibrierkurve von der Software zur Verfügung gestellt.
Das Bestimmtheitsmaß gibt die Güte der Anpassung der gemessenen Standards und die berechnete Eichkurve. Je näher dieser Wert auf "1", der besser ist die Anpassung des Messwertes und Eichkurve.
Wenn der Wert ist weit von "1", müssen die Standards neu vermessen werden, vorbereitet erneut, oder die Tauglichkeit der Kalibrierkurve geändert.
Abbildung 11 zeigt ein Beispiel für eine Eichkurve mit einer berechneten Bestimmtheitsmaß = 0,99993, für die Quantifizierung von dsDNA mit PicoGreen Farbstoff erhalten.
Abbildung 11. Beispiel für dsDNA Kalibrierkurve.
Discussion
Sorgfältige Pipettieren während der Probenvorbereitung sowie über eine stabile und empfindliche Fluoreszenz-Spektralphotometer ist unerlässlich für den Erhalt von guten und reproduzierbaren Ergebnissen.
Im Falle der Fluoreszenz-Spektralphotometer für diesen Test verwendet wird vorgeschlagen mit 300 ul Endprobe Volumen im Mikroplatten-Reader. Niedrigere Volumen verringert sich die Empfindlichkeit und ein größeres Volumen kann Kreuzkontaminationen zwischen den Wells zu verursachen.
Disclosures
Luis A. Moreno und Kendra L. Cox von Hitachi High Technologies America, dass das Instrument in diesem Artikel verwendet produziert beschäftigt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled H2O | Reagent | |||
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen | Reagent | P7589 | ||
| Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108 | Supply | 237108 | ||
| 12 Channel Eppendorf Micropipette | Supply | 3516677 | ||
| 1000 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 200 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 10 mL serological pipet | Supply | |||
| Aluminum foil | Supply | |||
| Pipette tips | Supply | |||
| Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1 | Equipment | 5J1-0003 | ||
| Microplate Reader Accessory for F-7000 | Equipment | 5J0-0139 |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).
