Summary
نظم الشمية الحشرات توفر فرصا فريدة لردود الرائحة الناجمة عن التسجيل في أشكال electroantennograms (EAG) وتسجيلات sensillum واحد (SSR) ، والتي تتلخص ردود من جميع الخلايا العصبية مستقبلات الرائحة (ORNs) الموجود على هوائي وعن تلك الموجودة في الفردي sensilla ، على التوالي.
Abstract
نظم الشمية الحشرات توفر فرصا فريدة لردود الرائحة الناجمة عن التسجيل في أشكال electroantennograms (EAG) وتسجيلات sensillum واحد (SSR) ، والتي تتلخص ردود من جميع الخلايا العصبية مستقبلات الرائحة (ORNs) الموجود على هوائي وعن تلك الموجودة في الفردي sensilla ، على التوالي. وقد تم استغلال هذه الأساليب من أجل الحصول على فهم أفضل للاتصال الكيميائية للحشرات. ثم يمكن أن تستخدم المنبهات التي تم تحديدها إما جاذبة أو طاردة في استراتيجيات لإدارة الآفات الحشرية.
Protocol
1. الحشرات
- orangeworm السرة ، Amyelois transitella (ووكر) (قشريات الجناح : Pyralidae) مستعمرة في مختبرنا نشأت من العث التي تم جمعها من أشجار اللوز في فريسنو ، كاليفورنيا. ويحتفظ لدينا مستعمرة الحشرات في غرف البيئية (بيرسيفال المؤتمر الوطني العراقي ، IA) في 28 ± 2 درجة مئوية ، والرطوبة النسبية 75 ± 10 ٪ ، وتحت 16:08 ح (النور : الظلام) صورة النظام.
- يتم جمع الفراشات الناشئة اليومية ، تلاعب ، وتحويلها إلى صناديق بلاستيكية (669 مل lunchbox ، 13 × 13 سم ، الارتفاع ، 4.5 سم ، Rubbermaid) قدمت مع ما يصل الى 10 طبقات من المناشف الورقية الماء المنقوع (الترا ماص الظامئ ، 27.9 X 27.9 سم ؛ السيفوي). ويغطي المربع مثقبة للسماح للتداول الهواء. يوفر هذا الترتيب RH ~ 100 ٪.
- للقياسات الكهربية التي نستخدمها 2-4 أيام بعد ظهور العث القديمة ، والتي هي قيد الرطوبة العالية.
2. إعداد الكهربية
- يتم الضغط بلطف العث (ذكور أو إناث) في تلميح ماصة (200 ميكرولتر ، الولايات المتحدة الأمريكية المؤتمر الوطني العراقي والعلم) التي خفضت من الأعلى إلى أن يبلغ قطرها غيض كبير (حوالي 2 مم). يتم الضغط بلطف والعثة من خلال الطرف الآخر مع كعب المناديل الورقية ترطيب حتى هوائيات وجزء من الرأس تبرز من الحافة.
- ويجمد رئيس كشفها بواسطة تغطية الرأس مع الطين غير التجفيف (Claytoon ، فان أكين الدولية ، CA) ترك جزء صغير من عين واحدة واثنان من الهوائيات المكشوفة. يتم وضع هذا المستحضر على منصة من Micromanipulator EAG MP - 12 (Syntech ، ألمانيا) بين أصحاب القطب اثنين.
- نحن نستخدم الزجاج الكهربائي مصنوعة من 1.0 ملم الأنابيب الشعرية البورسليكات مع خيوط (WPI المؤتمر الوطني العراقي ، FL) ، وانسحبت في طراز P - 97 micropipette مجتذب (سوتر الآلات ، CA) للحصول على microelectrodes أقل من طرف ميكرون. تمتلئ مرة أخرى مع أقطاب sensillum الليمفاوية الجرس (Kaissling وThorson 1980). قطب واحد يخوزق في منطقة معرضة للعين تحت المجهر (لايكا MZ75) ويخدم كمرجع ، في حين أن القطب تسجيل تسع الهوائيين. لتسهيل الاتصال ، وتقطع شرائح القاصي antennal 1-2 قبل ان يتم إدراجها في القطب التسجيل. لإشارات من التسجيلات sensilla الفردية ، ونحن تعديل طفيف هذا الإعداد حيث يتم تسجيل مخوزق القطب تحت المجهر (أوليمبوس BX51WI ؛ 800x التكبير). وتسجل امكانات العمل بإضافة الزجاج الكهربائي في القاعدة من sensillum. وتتضخم إشارات من مقاومة عالية قبل مكبر للصوت (Syntech ، ألمانيا) ، وتغذي خط حالا UB - IDAC لتحليلها مع برنامج AUTOSPIKE (Syntech ، ألمانيا). يتم استخراج إشارات مرور التيار المتردد والفرقة بين المصفاة 100 هرتز -10000 وإمكانات العمل عن طريق الكمبيوتر باستخدام خوارزمية AUTOSPIKE التي تميز بها الذروة إلى الحضيض سعة من الضوضاء. وتحسب ردود الخلايا العصبية الفردية والزيادة (أو النقصان) في وتيرة العمل المحتملة (المسامير في الثانية الواحدة) على مدى تواتر عفوية.
3. المحفزات الكيميائية وبروتوكول تحفيز
- تستخدم المواد الكيميائية من أعلى نقاء. والمكونة من مزيج الرئيسية فرمون الإناث من orangeworm السرة ، (Z ، Z) تم الحصول عليها من -11،13 - hexadecadienal Bedoukian بحوث المؤتمر الوطني العراقي ، CT. والمخففة للمواد الكيميائية ، يتم إجراء ث / ت ، مع الزجاج المقطر الهكسين الحلول لجعل مخزون التخفيفات ميكروغرام / ميكرولتر وdecadic 10. ويتم تحميل قسامة (10 ميكرولتر) من مادة كيميائية مذابة في التحفيز على شريط الهكسين Whatman رقة الترشيح (8x40 ملم) ، ويبخر المذيب عن طريق هز برفق لمدة 10 ق تحت غطاء الدخان ويتم وضع الشريط في البولي بروبلين 5 مل محقنة (الحقن دينار بحريني ، ونيو جيرسي) من وحدات التخزين التي يتم طردها المختلفة. الهكسين وحده ، وحقنة فارغة بمثابة السيطرة.
- يقام في إعداد تيار الهواء مرطب ألقاه تحكم التحفيز Syntech (CS - 55 النموذج ؛ Syntech والمانيا) في 20 مل / ثانية التي نبضة التحفيز من 4 يضاف مل / ثانية لمدة 500 مللي ثانية. يتم تسجيل إشارات لمدة 10 ثانية ، 2 ثانية قبل انطلاق بداية نبض التحفيز. ويتم تحفيز إعداد Antennal مع نبض مللي 500 خلالها كاليفورنيا. يضاف 2 مل من الهواء النقي من البولي بروبلين حقنة 5 مل تحتوي على التحفيز على تدفق الهواء الرئيسية. ويسمح للفجوة ما لا يقل عن 1 دقيقة أو أكثر ، وبعد ردود عالية ، وبين التحفيز.
4. ممثل النتائج
هوائيات من العث ضبط النفس (الشكل 1) مع عنصر حفز فرمون الإناث ، (Z ، Z) -11،13 - hexadecadienal توليد استجابات جرعة قوية تعتمد على (الشكل 2). هذا المكون الرئيسي فرمون يتسبب أيضا جرعة من ردود مثير تعتمد sensilla trichodea طويلة (الشكل 3A) كما هو معروض في آثار التسجيلات وحدة واحدة (الشكل 3B).
الشكل 1. ايف السرة orangeworm العثة ضبط النفس وهوائي يتعرض
load/2489/2489fig2.jpg "بديل =" الشكل 2 "/>
الشكل 2. الاستجابات تعتمد الجرعة EAG استدعت ردا على (Z ، Z) -11،13 - hexadecadienal ، كبرى فرمون التأسيسية للإناث.
الشكل 3. Sensilla شبيه الشعر في الذكور السرة orangeworm العثة الاستجابة إلى (Z ، Z) -11،13 - hexadecadienal بطريقة تعتمد على الجرعة. (أ) من الذكور الهوائي السرة orangeworm العثة متعدد مجزأة وتزين كل قطعة مع عدد كبير من الشعر مثل الهياكل وsensilla. A صورة مجهرية الإلكترون المسح الضوئي ، والتي تبين التفاصيل في أقحم (الحانات هي مقياس 200 و 50 ميكرون ، على التوالي). (ب) خارج الخلية وحدة واحدة من التسجيلات sensillum شبيه الشعر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أثبت هذا الأسلوب الرواية وضعت لتقييد حركة العثة تعيش orangeworm السرة لقياس اشارات الشم أن تكون قوية وموثوقة للغاية. نستخدم هذه الطريقة بشكل روتيني من أجل عزل وتحديد جاذبة الرواية من ركائز المضيفة الطبيعية مثل اللوز والفستق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
بدعم من USDA-NIFA/AFRI 2010-65105-20582 NSF ، 0918177 ، والتأسيس Bedoukian البحوث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus Corporation | BX51WI model | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ75 | |
| 1.0 mm borosilicate capillary tubing with filament | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Stimulus controller | Syntech | CS-55 model | |
| High Impedance pre-amplifiers (Universal Single ended probe) | Syntech | ||
| Amplifier / data-acquisition system (USB-IDAC) | Syntech | ||
| EAG Micromanipulator MP-12 | Syntech | ||
| (Z,Z)-11,13-hexadecadienal | Bedoukian Research Inc, CT. | ||
| Whatman filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1001070 | |
| 5 mL polypropylene syringe | BD Biosciences | 309633 | |
| pipette tip (200 μL) | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | |
| 669 mL lunchbox,13 x 13 cm; height, 4.5 cm, | Rubbermaid | ||
| Thirsty Ultra Absorbent, 27.9 x 27.9 cm | Safeway | ||
| Non-drying clay | Claytoon , Van Aken International, CA | 18150 | |
| Environmental chamber | I-30BLL model |
References
- Sattelle, D. B., Hall, L. M., Hildebrand, J. G. Insect olfactory sensilla: structural, chemical and electrical aspects of the functional organization. Receptors for Neurotransmitters. Hormones and Pheromones in Insects. , Elsevier North-Holland. Amsterdam. 261-282 (1980).
