Summary
C57BL עכברים / 6 שימשו ללמוד בפתוגנזה HC ולספק את המודל הטוב ביותר. אנחנו בוחנים את היתרונות הפוטנציאליים של חסינות הלחות נגד פטריות זה שנוצר מבז מספר [כדי H2B היסטון ואת הלם חום 60kDa חלבון] כי בדקנו את יעילות ההגנה שלהם לאחר מתן intraperitoneal.
Abstract
מטרת השימוש של מתודולוגיה זו היא 1) כדי לקדם את היכולת שלנו להגן על אנשים עם נוגדנים או חיסון למניעת או לטיפול histoplasmosis נגרמת על ידי פטרייה capsulatum Histoplasma ו 2) לבחון את התפקיד של גורמים ארסיות כיעד לטיפול. כדי ליצור מבז, עכברים הם שחוסנו, תגובות החיסון מוערכים באמצעות בשלב מוצק ELISA המערכת שפותחה במעבדה שלנו, את העכברים הטובים ביותר המגיב נבחרים הבידוד של splenocytes היתוך עם תאים hybridoma. C57BL עכברים / 6 נעשה שימוש נרחב ללמוד H. בפתוגנזה capsulatum ולספק את המודל הטוב ביותר להשגת הנתונים הדרושים. על מנת להעריך את התפקיד של מבז זיהום, עכברים הם intraperitoneally מנוהל גם עם מב ח ל capsulatum או אלוטיפ בהתאמה מלאה מב ו נגוע אז או תוך ורידי (iv), intraperitoneal (IP), או intranasal (ב) מסלולים. בספרות המדעית, היעילות של מבז עבור זיהומים פטרייתיים בעכברים מסתמך על תמותה כנקודת סיום, בשיתוף עם formin יחידות המושבה (CFU) הערכות בנקודות זמן קודמות. (זמן מותו) מחקרים הישרדות נחוצים כמו שהם מייצגים בצורה הטובה ביותר מחלות אנושיות. לכן, יעילותה של התערבות שלנו לא מספקת תוקם ללא עקומות ההישרדות. הדבר נכון גם להקמת היעילות של חיסון או בדיקה של מוטנטים עבור ארסיות. עם histoplasmosis, העכברים לעתים קרובות ללכת מלהיות אנרגטית מת על כמה שעות. הקיבולת של התערבות כגון ניהול של MAB עשוי בתחילה להגן מפני מחלות בעלי חיים, אך המחלה יכולה להישנות אשר לא ימומש בקיצור ניסויים CFU. בנוסף הישרדות מבחני עומס פטרייתי, אנו בוחנים את תגובות דלקתיות לזיהום (היסטולוגיה, גיוס הסלולר, תגובות ציטוקינים). עבור ההישרדות / שעה כדי ניסויים מוות, עכברים נגועים ומנוטרים לפחות פעמיים ביום סימנים של תחלואה. על מנת להעריך את הנטל פטרייתי, histopathology, ותגובות ציטוקינים, בעכברים מורדמים בזמנים שונים לאחר ההדבקה. ניסויים בבעלי חיים מבוצעות על פי ההנחיות של המכון ללימודי החיות של אלברט איינשטיין לרפואה.
Protocol
1. צמיחה של ח Capsulatum
- הכן את ארון biosafety לעבודה עם הפטרייה על ידי ניקוי הממשלה עם אקונומיקה 10% ואחריו קרינה UV 20 דקות. ח capsulatum בשלב שמרים biosafety דורש רמה (מנהלת הליגה) נוהלי השנייה, בעוד טופס עובש דורש BSLIII. השתמש בטופס שמרים את השלבים הבאים.
- הבא להכין צינור חרוטי 15 מ"ל עם 5 מ"ל של PBS. קציר מושבה של ח capsulatum (זן HC ATCC G217B) מתוך צלחת אגר דם BHI [גלוקוז 10 גר '/ ליטר, 0.1 ציסטאין g / L, פניצילין, סטרפטומיצין 1% וכבשים כדוריות דם אדומות 50 מ"ל / L (קולורדו סרום ושות', קולורדו, ארה"ב) ] מעובד על 37 מעלות צלזיוס או לקחת aliquot ממלאי שמרים קפוא ב -80 ° C ולהוסיף אותו PBS. וורטקס התאים במרץ צנטריפוגות עבור XG 1100 עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את supernatant מבלי להפריע גלולה ולהוסיף 10ml של PBS טריים. חזור על תהליך זה שלוש פעמים. להשעות את התאים של 5 מ"ל PBS ואת תשלומי העברה צינור חרוטי 50 מ"ל.
- כדי לשבש את התאים מצטברים, להעביר את ההשעיה תא שמרים דרך G1 26 / 2 מחט u לשיר מזרק 10 מ"ל 5 פעמים ארון biosafety (באמצעות הגנה על הפנים). כדי לבודד שמרים קטנה, בגודל אחיד, צנטריפוגה התאים XG ב 55 דקות 1 בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להסיר את מ"ל העליון 1.
- מוסיפים את ההשעיה התא בקבוק erlenmeyer סטרילית המכילה 100 מ"ל של מדיום F12 HAM (GIBCO) בתוספת גלוקוז 16G / L, 1g / L חומצה גלוטמית, 8.4mg / L ציסטין, 6g / L חומצה גלוטמית ואז לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות באינקובטור עם רעד 150rpm.
2. Hybridoma צמיחה טיהור של נוגדנים חד שבטיים
- מעבירים את hybridomas שנבחרו בינוני DMEM המכילה 10% נסיוב עגל עוברית, NCTC 10%, 1% שאינם חיוניים חומצות אמינו של 1% פניצילין, סטרפטומיצין. לגדל את התאים בבקבוק תא התרבות (בקטון דיקנסון) במשך 5-7 ימים ב 37 מעלות CO 5 / 2%.
- ואז בצנטריפוגה בינוני XG ב 1100 עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר לאסוף את כל supernatant מבלי לשבש את כדורי.
- הבא לטהר את supernatant חינם התא בעזרת חלבון שרף / G על ידי FPLC.
- ריכוז MAB אז יכול להיות מחושב על ידי לכידת ELISA (1) שימוש בפקד אלוטיפ IgG כסטנדרט (איור 1B).
3. הכנה Histoplasma Capsulatum Inoculum
- קחו 48 שעות capsulatum Histoplasma (זן HC ATCC G217B) שמרים שלב תרבות גדל בינוני F-12 HAM.
- צנטריפוגה התאים XG ב 1100 ל 10 דקות. בטל supernatant ולהוסיף PBS טריים.
- חזור על ההליך 3.2 3 פעמים.
- לעבור את ההשעיה תא שמרים 5 פעמים באמצעות מחט 26G1 / 2 באמצעות מזרק.
- צנטריפוגה את ההשעיה על XG 55 דקות עד 1 אשכולות גלולה תא שיורית. מעבירים את supernatant המכיל את ההשעיה תא בודד לצינור חדש.
- ספירת ההשעיה תא בודד באמצעות hematocytometer.
- התאם את הריכוז התא על מנת להשיג 1.25 x 10 7 שמרים (הישרדות) או 5.0 x 10 6 (CFU, ציטוקינים היסטולוגיה) ב suspention של μL 50 <(איור 2).
4. מינהל intraperitoneal של מבז
- תרים את העכבר בזנבו לבין בעורפו של הצוואר (איור 3A). לשתק את העכבר על ידי בעורפו שלה קרוב theears ככל האפשר (לוודא לקחת את העור מספיק כך העכבר cannotturn ראשו לנשוך את האדם לטיפול בה; איור 3B ו - 3C).
- לייצב את withthe זנב האצבע הקטנה לחצה בעדינות על כף היד (איור 3D).
- ספוגית באזור ההזרקה עם אתנול 70% לפני ששמים את המחט כדי לשאוב לחפש דם לפני הזרקת.
- השתמש 26G1 / 2 piercethe העור abdominalmuscles להזריק את הפתרון הכולל 500μg מב (PBS, נוגדן אלוטיפ מלאה או מב להיבדק, בדילול מלא 1 מ"ל PBS) לתוך שמאל thelower או נמוך ברבע הבטן ימינה (חלל intraperitoneal), עם החיה בראש את הפוזיציה, מקפיד להימנע andother הסרעפת לאיברים הפנימיים (איור 3E).
- חכו לזמן קצר לפני הנסיגה needleto להקטין את הסיכוי של דליפה.
- חכו לפחות שעתיים לפני שתמשיך לשלב הבא.
5. עכבר הרדמה וזיהומים Intranasal
- הכן את ההרדמה באמצעות קטמין ו xylazine על 100 מ"ג / ק"ג ו - 10 מ"ג / ק"ג, בהתאמה. בצע הממשל intraperitoneal של PBS, נוגדן אלוטיפ שליטה, או נוגדן ניסיוני כמתואר בפרוטוקול כתוב הנלווים. חכה שעתיים לאחר ההזרקה MAB לפני הרדמה העכבר שתמשיך הזיהום intranasal.
הכן קטמין הרדמה באמצעות ו xylazine על 100 מ"ג / ק"ג ו - 10 מ"ג / ק"ג, בהתאמה (7). - בתקופה 2h ההמתנה, להכין את inoculum capsulum Histoplasma כמתואר בפרוטוקול כתוב הנלווים.
- המשך לפי itens 5.1 עד 5.5. טו קמצוץ החיות עם פינצטה כדי לוודא העדר רפלקס ולוודא כי ההרדמה עבד. Anaesthetization לאחר בעדינות להשעות את העכבר על השיניים הקדמיות שלה ניילון או חוט כותנה. שימוש 2 עומד טור לקשור את החוטים על מנת להשעות את החיות.
- לאט לאט לנהל כ -50 inoculum μl לתוך n האם באמצעות micropipette בעוד מקרוב אחר קצב הנשימה של העכבר. אפשר העכבר כדי לנוח בתפקיד זה במשך 2-5 דקות לאחר ההדבקה intranasal כדי להקל על בתצהיר של השמרים לתוך הריאות של החיה (איור 3F).
- לאחר עכבר נדבק בווירוס, לשמור על העכבר בסביבה, פיקוח חם (בטמפרטורה שבין 25 ל 37 מעלות צלזיוס), בזהירות ניצול מנורת חום במידת הצורך, עד שהוא מתאושש מן ההרדמה. כאשר מתעורר עכבר, להחזיר אותו לכלוב נקי עם גישה כרצונך מודעה מזון ומים. כלובים מוחזרים למתקן החיה שלנו כל הזמן בחדר חיית נקי (BLSI).
6. הישרדות מחקרים
- הערכת בעלי חיים נגועים מעושה נגוע קלינית tachypnea, עייפות, obtundation, וירידה במשקל. החיות צריך להיבדק פעמיים ביום על ידי אנשי המעבדה יומי על ידי מטפלות בבעלי חיים.
- עם histoplasmosis Murine, עד קרוב לסוף חייו, יש בדרך כלל כל סימני הזיהום למעט עלייה קלה בקצב הנשימה. עם מחלה מתקדמת, אשר קורה בדרך כלל 10-11 ימים, עכברים הופכים tachypneic משמעותית ויש להם פעילות מצומצמת. בדרך כלל הם להפוך במהירות הגוססת ואת לפוג.
- בעלי חיים במצוקה צריך להיות מורדמים כראוי עם CO 2 בתא ייעודי, חיות המנוח צריכה להיות מנה יומית.
7. מחקרים CFU, היסטולוגיה ו ציטוקינים ללימודים
- הכן 15 מבחנות חרוטי מ"ל עם 10 מ"ל PBS עבור כל איבר להיות שנאספו.
- להרדים בעלי חיים 7 ו - 14 ימים לאחר ההדבקה עם inuculum sublethal (5.0 x 10 6) כפי שהוצג קודם ולהסיר את הריאות, הטחול והכבד מיד.
- הסר חתיכת איבר להיבדק ולבצע את הקיבעון של לילה פורמלין. סעיפים תיבחן תחת מיקרוסקופ להערכה פתולוגית.
- הכן 50 מבחנות חרוטי מ"ל עם 5 מ"ל PBS ועליו 70 strainers תא מיקרומטר עבור כל איבר להיות הומוגני. מרוכך כל החלק הנותר של איברים בנפרד לתוך צינורות 50 מ"ל באמצעות מזרק סטרילי בוכנות 5 מ"ל.
- בשלב הבא, סדרתי לדלל homogenates איבר (1:100, 1:1000 ו - 1:5000) ו 100μL צלחת של דילול על כל BHI דם צלחות אגר (2).
- הוסף מעכב פרוטאז טבליות אל homogenates בהתאם להוראות של ייצור (רוש, גרמניה).
- דגירה צלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך עד 14 ימים CFUs למנות.
- צנטריפוגה homogenates איבר ב 4000xg במשך 10 דקות ולהסיר supernatants איברים, whish ישמש המשמשים את מבחני ציטוקין שבוצעה על ידי שיטות סטנדרטיות על פי היצרן.
8. נוגדנים חד שבטיים כנגד ה 'הגנה Capsulatum תלוי ספציפיות נוגדן ו אלוטיפ
- MAB אלוטיפ הוא קריטי להגנה מפני ח capsulatum, כמו העכברים שטופלו IgG1 או IgG2a מבז כדי Hsp60 יש להישרדות ממושכת באופן משמעותי לעומת שליטה עכברים שקיבלו מאב IgG2b כדי Hsp60 או או פקד אלוטיפ MAB או PBS (איור 4).
- יתר על כן, בעכברים שקיבלו מבז מגן, היתה ירידה משמעותית במספר CFU ריאתי הטחול ביום 7 וירידה של 2 ו -2.5 יחידות יומן של מספרים השמרים לריאות בכל יום 14 (איור 5).
איור 1: גידול של ח capsulatum ו hybridomas. (א) HAM נוזלי הכנה F-12 תרבות מהמושבה יחיד המתקבל ח capsulatum גדל על BHI דם צלחות אגר. (ב) Hybridoma צמיחה בתרבות צלוחיות תא וטיהור MAB על ידי חלבון A / G באמצעות שרף cromatography זיקה.
איור 2: ח' capsulatum הכנה inoculum לזיהום intranasal. תא ההשעיה המתקבל לאחר ח שיבוש אגרגטים capsulatum על ידי מזרק צנטריפוגה היא על ידי ספירת המנויים ב hemocytometer. ריכוז נייד מותאם 1.25 x 10 7 (ניסויים הישרדות) או 5 x 10 6 (CFUs, ציטוקינים היסטולוגיה) ב μL 50 <.
upload/2532/2532fig3.jpg "alt =" איור 3 "/>
איור 3: טיפול עכבר במהלך מב הממשל. (א) העכבר הוא הרים בזנבו (B ו-C) משותקת על ידי החזקת בעורפו של הצוואר שלו קרוב theears. (ד) הזנב מוחזק בין האצבע בכף מעט. (ה) הפתרון MAB מוזרק באמצעות מחט 26G1 / 2. (ו) ח capsulatum inoculum מנוהל על ידי intranasally בעדינות pipetting ההשעיה לתוך התא n האם.
איור 4: מבז כדי Hsp60 יכול לשנות את בפתוגנזה של histoplasmosis. זריקות ip עם 500 מיקרוגרם של IgG1, או IgG2a מבז 2 שעות לפני קיום זיהום ממושך באופן משמעותי (p <בהשוואה לקבוצת הביקורת, 0.05), אך IgG2b מב.
איור 5: קביעות CFU בריאות ב 7 ו - 14 ימים לאחר אתגר intranasal sublethal עם 5x10 6 שמרים HC-IP של עכברים שטופלו מבז שנבחרו Hsp60 או מאב לא רלוונטי הראו ירידה בנטל פטרייתי עבור IgG1 ו IgG2a מבז טיפול בבעלי חיים. פסים שחורים מייצגים CFUs ביום 7 וברים לבן 14 ימים לאחר הפגיעה (* p <0.001 ב 7 ימים ** p <0.001 ב 14 הימים שלאחר ההדבקה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול המוצג כאן מוכיח כי MAB של אל ח capsulatum יכול לשנות את מהלך histoplasmosis Murine ניסיוני. מבז אל פני השטח אנטיגנים התא של פתוגנים יכול לשנות את הדינמיקה מורכבים המתרחשים במהלך משחק הגומלין בין המארחת לבין הפתוגן. מחקר זה קובע כי מבז לתווך הגנה במודל Murine של histoplasmosis קטלני כאשר הוא מוזרק intraperitoneally, והוא מציע חלבונים מועמד לפיתוח חיסון, כגון H2B, אנטיגן M (משטח Catalase) (3) ו Hsp60. בשנת vivo, מנהלה של מבז מגן HC Hsp60 H2B ו מופחת נטל איבר דלקת פטרייתי והישרדות ממושכת של עכברים נגועים.
למרות פיתוח החיסון ח capsulatum הוא אזור מרתק של מחקר, החיסון לא יהיה יעיל אצל אנשים immunocompromised, שכן הם אינם יכולים בהכרח לתזמר immunoresponse. לפיכך, ברור כי אוכלוסייה זו עשוי להועיל בעיקר מטיפול פסיבי עם מב ל ח capsulatum אנטיגנים. הנתונים שלנו מראים כי מבז, במיוחד Hsp60 או בשילוב עם מבז אחרים אנטיגנים פני התא, יכול לשפר את הטיפול בחולים עם histoplasmosis (4, 6). בנוסף, שילוב של MAB ל ח capsulatum עם טיפול תרופתי נגד פטריות יכול להיות סינרגיסטי יעיל יותר יעילות מגן. Amphotericin B הוא הסם של בחירה המשמש בדרך כלל לטיפול הראשוני של histoplasmosis. לפיכך, תוספת של MAB לטיפול תרופתי נגד פטריות צריך להיחשב במחקרים עתידיים. למעשה, אנחנו הוכיחו בעבר אפקט סינרגיסטי של מבז ל H2B ותת מעכבות ריכוזים של amphotericin B במודל החיה שלנו (5). יתר על כן, מבז יכול להינתן prophylactically ב התפרצויות של histoplasmosis, במיוחד בסיכון גבוה, כגון אנשים עם זיהום או וירוס הכשל החיסוני האנושי בחולים המקבלים מעכבי TNF-α. חקירות עתידיות של מגן MAB עשוי לחשוף תובנות חשובות נוספות לתוך בפתוגנזה של histoplasmosis ותפקוד נוגדנים כנגד H. capsulatum, ואולי פתוגנים תאיים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet (BSL2) | |||
| 15 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| HAM F-12 medium | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 37°C shaker | |||
| Vortex | |||
| 50 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| 26G1/2 needle | BD Biosciences | ||
| 10 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 250 mL flasks | |||
| FPLC (Fast protein liquid chromatography) system | GE Healthcare | ||
| ELISA reader | BioTek | ||
| Anesthesia (ketamine and Xylazine) | |||
| Column stands | |||
| Nylon string | |||
| Heat lamp | |||
| 70μm cell strainers | Falcon BD | ||
| BHI agar plates | GIBCO, by Life Technologies |
References
- Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide. J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).
- Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77. , 1357-1367 (2009).
- Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum. PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).
- Nosanchuk, J. D. Protective antibodies and endemic dimorphic fungi. Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).
- Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &, G. S., Casadevall, A. Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum. J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).
- Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum. J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).
- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab Anim. 27, 30-39 (1993).
